生理生化試驗

1、熒光定量PCR技術及其在科研中的應用孫沖南京林業(yè)大學森環(huán)學院江蘇南京210037[摘要]熒光定量PCR技術是一種新型的核酸定量技術，與常規(guī)的PCR相比，熒光定量PCR具有檢測靈敏，精確，特異性強，無污染，快速等特點。自問世以來在基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領域應用較為廣泛。在植物研究方面應用較少?，F已開始用于植物基因表達分析、外源基因基因鑒定等方面的研究。本文介紹了實時熒光定量PCR技術的原理、試驗方法、優(yōu)缺點，并對其在

2、植物研究中的應用及前景作了探討。[關鍵詞]實時熒光定量PCR技術；原理；植物；檢測；應用；聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）技術是1985年開始出現的一項基因檢測技術。由于PCR技術簡便易行、靈敏度高等優(yōu)點，該技術被廣泛應用于基礎研究，成為分子生物學必不可少的研究工具。由于傳統(tǒng)的PCR技術存在，不能準確定量，且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點，使其應用受到局限。實時熒光定量PCR技術是在PCR基

3、礎上發(fā)展起來的，將核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測等技術融合在一起的一項創(chuàng)造性技術。自產生以來，在醫(yī)學、檢疫、國防軍事及農業(yè)等各個領域得到了廣泛應用。該技術帶來了方法學上的重要突破，在植物學研究中具有廣闊的應用前景。1.實時熒光定量PCR技術的概念及基本原理實時熒光定量PCR技術（RealtimefluescentquantitativePCR，RealtimeQPCR）是指在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團，利用熒光信號來實時

4、監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析。在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質有其特定的波長。儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測別是DNA結合染料法、水解探針法、雜交探針法、熒光引物法。但在植物中常用的檢測模式主要有兩種：熒光染料檢測和熒光水解探針檢測。3.1雙鏈DNA結合染料SYBRGreenI技術SYBRGreenI是一種替代溴化乙錠能結合到dsDNA小溝部位的具有綠色激發(fā)波長的染料

5、，它只有與dsDNA結合后才會發(fā)出熒光。當DNA解鏈成為單鏈時，它從鏈上釋放出來，這時熒光信號急劇減落。因此，熒光強度可以代表擴增產物的數量。其最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。SYBRGreenI結合到雙鏈DNA后，熒光強度大大增加，具有較強的敏感性，且不必因為模板不同而特別定制，因此設計的程序通用性好，操作簡便，且價格相對較低，故廣泛應用于實時定量PCR研究中。但由于SYBRGreenI非特異結合雙鏈DNA，引

6、物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過升高溫度后測量熒光的變化可以幫助降低非特異產物的影響。由溶解曲線分析產物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到的定量結果。此外，設計引物時避免引物二聚體的出現，在PCR過程中建立不加模板的陰性對照，在試驗結束后，進行凝膠電泳分析等方法的實施可以有效保證試驗結果的可靠性。3.2熒光探針檢測技術根據標記基團的熒光共振能量轉移（fluescenceresonan