dna提取和銀染程序

1、2.1.4同名異物小白菜的同名異物小白菜的AFLPAFLP鑒定方法鑒定方法模板模板DNADNA的制備：（的制備：（CTABCTAB法）法）(1)取2ml離心管蓋大小的三片嫩葉放入2ml滅菌的離心管，用相應(yīng)大小的尖頭玻璃棒研磨，使細(xì)胞壁充分破碎。(2)2%CTAB提取液在水浴鍋中預(yù)熱至65℃。加熱前在2%CTAB提取液中加入0.4%的巰基乙醇。(3)加入750l2%的CTAB提取液于2ml的離心管中，，充分混勻后65℃水浴1小時，期間每隔

2、10分鐘輕輕搖動一次。注意：樣品的量不能太多，否則CTAB加入的量太少，細(xì)胞裂解不充分。(4)冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）輕輕轉(zhuǎn)動搖勻。(5)保持溫度在18℃以上，13000rpm離心10分鐘。注意：溫度太低則DNA容易和CTAB結(jié)合而沉淀。(6)用大口徑槍頭緩慢吸取上清液，重復(fù)步驟（4），（5）使溶液中的蛋白和多糖沉淀充分。(7)用大口徑槍頭緩慢吸取上清液，加入預(yù)先加好600l異丙醇的2ml離心管。注意：吸取23

3、的上清即可，不能吸取太多，防止將氯仿：異戊醇或沉淀吸入，降低DNA的純度。(8)靜置。(9)13000rpm離心10分鐘，棄上清。加入1ml預(yù)冷的70%的乙醇漂洗2次，用無水乙醇漂洗1次。置于超凈工作臺上吹干12小時，或用冷凍真空干燥機(jī)抽干。(10)加入100l0.1TE或者水溶解DNA，每100l加入0.5l的RNase（2mgml），室溫放置0.5小時。(11)取2lDNA，以λDNA為對照進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度，稀釋為

4、100ngl左右，20℃保存。（試劑的配置見附錄）AFLP分析的操作步驟分析的操作步驟(1)基因組DNA的酶切和連接基因組DNA的雙酶切和接頭的連接采用一步完成，其反應(yīng)體系為25.0l，包括：MseI(10Ul)0.5lEcI(12Ul)0.5lMseI接頭(50pmoll)1.0lEcI接頭(5pmoll)1.0l10ATP1.0lMgCI2（25mmolL）0.8ldNTP(10mM)0.45lTaq酶(5Ul)0.15lEcI引物

5、(50ngl)1.2lMseI引物(50ngl1.2l模板DNA6l加超純水至20l擴(kuò)增程序為:94℃2min94℃30sec65℃30sec13cycles，0.7℃cycle72℃1min94℃30sec56℃30sec30cycles72℃1min72℃7min變性聚丙烯酰胺凝膠電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將選擇性擴(kuò)增的產(chǎn)物20l中加入變性上樣緩沖液8l（98%的甲酰胺，10mM的EDTA，0.25%的溴酚藍(lán)，0.25%的二甲苯青）

6、，95℃變性5分鐘，然后在冰浴中迅速冷卻。在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠（配方見附錄）上電泳1.5小時，電泳儀采用Biorab垂直電泳儀。加樣量為8.5l。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作規(guī)程：(1)玻璃板的清洗玻璃板是否清洗干凈直接關(guān)系到聚丙烯酰胺凝膠灌制的質(zhì)量，干凈的玻璃板可以明顯防止灌膠時產(chǎn)生氣泡。最好提前用洗潔精將玻璃板浸泡一天。洗干凈的玻璃板晾干備用。(2)涂板清洗干凈的短板用2%剝離硅膠（配方見附錄）均勻的涂在短板上，將0.5%的粘