實驗九dna的粗提取與鑒定

1、1【實驗九實驗九】DNA】DNA的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定陳小陳小珺（江西?。ń魇≮M州市第三中學贛州市第三中學341000341000）1教學建議教學建議在本實驗的教學中，教師應注意以下幾點。1.1實驗材料必須準備充足。本實驗所用的實驗材料是雞血細胞液由活雞的鮮血經(jīng)沉淀后獲得。每組(2個學生)需用5mL雞血細胞液則每班(50人)至少需要130mL而雞血細胞液與雞血的體積比為1:3這樣每班至少需要390mL雞血細胞液。宰殺1只中等大小

2、的活雞一般可得120mL左右的鮮血因此1個班實驗需要買4只活雞。也可以到市場售活雞處去索取雞血但所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑。（每100ml雞血加入3g檸檬酸鈉）1.2盛放雞血細胞液的容器最好是塑料容器。因為雞血細胞破碎后釋放出的DNA容易被玻璃容器吸附由于細胞內DNA的含量本來就比較少再被玻璃容器吸附去一部分提取到的DNA就會更少。1.3獲取較純凈的DNA的關鍵步驟。1.3.1充分攪拌雞血細胞液：將雞血細胞液與蒸餾水混合以后必須用玻璃

3、棒沿一個方向快速攪拌使雞血細胞加速破裂并釋放出DNA。1.3.2沉淀DNA時必須用冷酒精：體積分數(shù)為95%的酒精在冰箱中至少存放24h。1.3.3正確攪拌含有懸浮物的溶液實驗步驟3、5、7都需要用玻璃棒攪拌。教師應提醒學生注意在進行步驟3、5時玻璃棒不要直插燒杯底部而且攪拌要輕緩以便獲得較完整的DNA分子。進行步驟7時要將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間用手緩慢轉動5min。2實驗原理的補充介紹實驗原理的補充介紹2.1DNA的釋放本實驗用雞血

4、細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破。DNA位于雞血細胞的細胞核中正常情況下不會釋放出來。為了使DNA從細胞核中釋放出來實驗中采用了向雞血細胞液中加入蒸餾水并且攪拌的方法。蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體水分可以大量進入血細胞內使血細胞破裂。同時再加上攪拌的機械作用就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)于是釋放出DNA當然也有RNA。但是釋放出來的大量DNA和RNA往

5、往與蛋白質結合在一起。2.2將DNA與蛋白質分離根據(jù)二者的特性即在濃度較高的氯化鈉溶液(物質的量濃度為2moLL)中核蛋白容易解聚游離出DNA。而DNA在濃度較高的氯化鈉溶液中的溶解度很高Na與帶負電的DNA結合成DNA鈉鹽。這時DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)。2.3DNA的析出與獲取利用DNA在濃度較低的氯化鈉溶液中溶解度小的原理向含有DNA的濃度較高的氯化鈉溶液中加入大量(300mL)蒸餾水稀釋氯化鈉溶液使DNA的溶解度下降而蛋白質的溶解

6、度增高(這就是蛋白質的鹽溶現(xiàn)象)從而使二者分離。這時加上不停地攪拌溶解度下降的DNA逐漸呈絲狀物。再通過過濾濾去蛋白質就可以獲取DNA的黏稠物了。如果采用離心法則更好用4000rmin的旋轉頻率離心15min除去上清液(含有蛋白質)留下的沉淀物中含DNA。2.4DNA的再溶解再用較高濃度的氯化鈉溶液去溶解DNA黏稠物。3洗滌劑等去污劑可以溶解細胞的細胞壁，破壞細胞膜，同時也能使蛋白質變性。當細胞壁破壞后，細胞釋放出核酸與蛋白質形成的復合

7、物——核糖核蛋白(RNP)和脫氧核糖核蛋白(DNP)，這兩種復合物在不同電解質溶液中的溶解度有較大差異。當NaCl濃度達到0.14mol／L時，DNP溶解度約為純水中溶解度的1％，但RNP則不一樣，在0.14mol／LNaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相當大，因此在制備DNA時，利用0.14mol／L稀鹽溶液使DNP與RNP分開。去除蛋白質后的核酸鹽溶液，再利用其不溶于有機溶劑的性質，但細胞中的其他物質則可以溶于有機溶

8、劑，應用適當濃度的有機溶劑(如乙醇)使DNA呈絮狀沉淀析出（本實驗加入酒精后使食鹽濃度接近0.14molL）。在溶液中，DNA鏈略帶負電荷，而鹽離子可被吸引到DNA的負電荷上，中和這些負電荷，因此就能夠使DNA片段聚合在一起，形成絮狀粘稠物質。利用這一原理，就可以用酒精萃取DNA。DNA與二苯胺作用生成藍色沉淀用來鑒定DNA。二.材料：洋蔥、洗潔精、食鹽、95％酒精、蒸餾水、0.015mol／L的NaCl溶液：稱取0.88gNaCl，投

9、入1000ml容量瓶中，加水到所需體積的刻度線上，溶解后成0.015mol／L氯化鈉溶液。二苯胺試劑：1g重結晶的二苯胺溶于100ml冰乙酸（A.R.）中，再加10ml過氯酸，臨用前加入1.0ml16%的乙醛，試劑應為無色，三.器具：勻漿機或研缽、紗布、漏斗、燒杯、玻璃棒、量筒、滴管、試管、天平。四.方法步驟稱取100g洋蔥，切碎，放進攪拌機或研缽中加入100ml洗潔精充分攪拌或研磨將研磨液用漏斗和兩層紗布過濾到燒杯中加入1g食鹽，攪拌

10、均勻量取上述澄清的洋蔥液50ml加入70ml的95％酒精輕輕搖動或用玻璃棒輕輕攪拌白色纖維狀粘稠物質析出，即DNA用玻璃棒可將其輕輕卷起，放入1號試管攪拌溶解后，加入4ml二苯胺試劑混合均勻，在沸水浴中加熱3～8min，觀察顏色的變化。五.實驗注意事項1)材料必須充分勻漿或研磨，否則洋蔥細胞沒有完全破碎，影響實驗效果；2)加入酒精后搖動或攪拌時一定要輕緩，否則會破壞DNA，以至于看不到；3)DNA鑒定時，二苯胺最好現(xiàn)配現(xiàn)用，否則二苯胺會