遺傳與育種

1、微生物的遺傳育種技術,理想的工業(yè)發(fā)酵菌種應符合以下要求：,①遺傳性狀穩(wěn)定；②生長速度快，不易被噬菌體等異種微生物污染；③目標產物的產量盡可能接近理論轉化率；④目標產物最好能分泌到細胞外，以降低產物抑制并利于分離；⑤盡可能減少產物類似物的產量，以提高目標產物的產量并利于分離；⑥培養(yǎng)基成分簡單、來源廣、價格低廉；⑦對溫度、pH、離子強度、剪切力等環(huán)境因素不敏感；⑧對溶氧的要求低，便于培養(yǎng)及降低能耗。,微生物的獨特生物學特性：,

2、（1）個體的體制極其簡單；（2）營養(yǎng)體一般都是單倍體；（3）易于在成分簡單的組合培養(yǎng)基上大量生長繁殖；（4）繁殖速度快；（5）易于積累不同的中間代謝產物或終產物；（6）菌落形態(tài)特征的可見性和多樣性；（7）環(huán)境條件對微生物群體中各個個體作用的直接性和均一性；（8）易于形成營養(yǎng)缺陷型；（9）各種微生物一般都有相應的病毒；（10）存在多種處于進化過程中的原始有性生殖方式；,微生物是研究現(xiàn)代遺傳學和其它許多

3、主要的生物學基本理論問題中最熱衷的研究對象。對微生物遺傳規(guī)律的深入研究，不僅促進了現(xiàn)代分子生物學和生物工程學的發(fā)展，而且為育種工作提供了豐富的理論基礎，促使育種工作從不自覺到自覺、從低效到高效、從隨機到定向、從近緣雜交到遠緣雜交的方向發(fā)展。,研究微生物遺傳學的意義,遺傳與變異的概念,遺傳和變異是生物體的最本質的屬性之一。遺傳(heredity)：親代生物的性狀在子代得到表現(xiàn)；親代生物傳遞給子代一套實現(xiàn)與其相同形狀的遺傳信息。特點：具

4、穩(wěn)定性。遺傳型（genotype）：又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部基因的總和；------是一種內在可能性或潛力。 遺傳型 + 環(huán)境條件 表型表型（phenotype）：指生物體所具有的一切外表特征和內在特性的總和;------是一種現(xiàn)實存在，是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀。,變異(variation):生物體在外因

5、或內因的作用下，遺傳物質的結構或數(shù)量發(fā)生改變。變異的特點：a.在群體中以極低的幾率出現(xiàn)，（一般為10-6～10-10）；b.形狀變化的幅度大； c. 變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的，可遺傳的。飾變（modification）：指不涉及遺傳物質結構改變而只發(fā)生在轉錄、轉譯水平上的表型變化。特點是：a.幾乎整個群體中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化；b.性狀變化的幅度?。籧.因遺傳物質不變，故飾變是不遺傳的。引起飾變的因素消失后，表型即可恢復。,

6、例如：粘質沙雷氏菌：在25℃下培養(yǎng)，產生深紅色的靈桿菌素；在37℃下培養(yǎng)，不產生色素；如果重新將溫度降到25℃，又恢復產色素的能力。,遺傳與變異的概念,第一章 遺傳變異的物質基礎,種質連續(xù)理論：1883~1889年間Weissmann提出。認為遺傳物質是一種具有特定分子結構的化合物?；驅W說：1933年摩爾根（Thomas Hunt Morgan）發(fā)現(xiàn)了染色體，并證明基因在染色體上呈直線排列，提出了基因學說，使得遺傳物質基礎的范圍縮

7、小到染色體上。但染色體是由核酸和蛋白質兩種長鏈高分子組成。20多種氨基酸經過不同排列組合，可以演變出的蛋白質數(shù)目幾乎可以達到一個天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡單得多，一般僅由4種不同的核苷酸組成，它們通過排列核組合只能產生較少種類的核酸，因此當時認為決定生物遺傳型的染色體和基因，其活性成分是蛋白質。DNA是遺傳變異的物質基礎的證明：1944年以后，先后有利用微生物為實驗對象進行的三個著名實驗的論證（肺炎球菌的轉化試驗、噬菌體感染試驗、病

8、毒的拆開與重建試驗），才使人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質。,（一）核酸存在的七個水平及質粒細胞水平：存在于細胞核或核質體，單核或多核細胞核水平: 原與真核生物的細胞核結構不同，核外DNA染色體水平: 倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復制能力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉錄——翻譯密碼子水平：

9、信息單位,起始和終止,核苷酸水平：突變或交換單位，四種堿基,一、遺傳物質在細胞內的存在部位和方式,二、原核生物的質粒,定義：是一類小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋DNA分子，能獨立于細胞核進行自主復制。大?。杭s為2~100×106Dalton，上面攜帶有數(shù)個到數(shù)十個甚至上百個基因。性質：①可以在細胞質中獨立于染色體之外獨立存在（游離態(tài)），也可以通過交換摻入染色體上，以附加體（episome）的形式存在；②質粒是一種復制子（r

10、eplicon），根據(jù)自我復制能力的不同，可把質粒復制的控制形式分為嚴緊型和松弛型兩種，嚴緊型質粒的復制受細胞核控制，與染色體DNA復制相伴隨,一般一個寄主細胞內只有少數(shù)幾個（1~5）個拷貝；松弛型質粒的復制不受細胞核控制，在染色體DNA復制停止的情況下仍可以進行復制，在細胞內的數(shù)量可以達到10~200個或更多。,③可以通過轉化、轉導或接合作用而由一個細菌細胞轉移到另一個菌細胞中，使兩個細胞都成為帶有質粒的細胞；質粒轉移時，它可以單獨轉

11、移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進行轉移，所以它可成為基因工程的載體。④對于細菌的生存并不是必要的⑤功能多樣化,二、原核生物的質粒,功能：進行細胞間接合，并帶有一些基因，如產生毒素、抗藥性、固氮、產生酶類、降解功能等。重組：在質粒之間、質粒與染色體之間均可發(fā)生。存在范圍：很多細菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤桿菌等制備：包括增殖、裂解細胞、去除RNA和蛋

12、白質等成分、分離質粒與染色體DNA等步驟。鑒定：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法,二、原核生物的質粒,幾種代表性質粒：,1. F–因子（fertility factor）：又稱致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相當于核染色體DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼94個中等大小多肽，其中1/3基因（tra區(qū)）與接合作用有關。存在于腸細菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌、奈瑟氏球菌、鏈球菌等細菌中

13、，決定性別。,最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae），后來發(fā)現(xiàn)還存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。R因子由相連的兩個DNA片段組成，即抗性轉移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性決定R因子（r-determinant），RTF為分子量約為11×106Dalton，控制質粒co

14、py數(shù)及復制，轉移?？剐詻Q定因子大小不固定，從幾百萬到100×106Dalton以上，其上帶有其它抗生素的抗性基因。R-因子在細胞內的copy數(shù)可從1~2個到幾十個，分為嚴緊型和松弛型兩種，經氯霉素處理后，松弛型質?？蛇_2000~3000個/細胞。,2. R因子（resistence factor）,細菌素產大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的細菌素，能通過抑制復制、轉錄、轉譯或能量代謝等而專一地

15、殺死其它腸道細菌。其分子量約4×104~8×104Dalton。大腸桿菌素都是由Col因子編碼的。Col因子可分為兩類，分別以ColE1和ColIb為代表。ColE1分子量約為5×106Dalton，無接合作用，是多copy的； ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組DNA 的研究和用于體外復制系統(tǒng)上。ColIb分子量約為80×106Dalton，它與F因子相似，具有通過接合作用轉移的功能

16、，屬于嚴緊型控制，只有1~2個copy。凡帶Col因子的菌株，由于質粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。,3. Col因子（colicinogenic factor）,降解性質粒只在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質?？蔀橐幌盗心芙到鈴碗s物質的酶編碼，從而能利用一般細菌所難以分解的物質做碳源。這些質粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟腦）質粒，XYL（二甲苯）質粒，SAL（水楊酸）質粒，MDL（扁桃

17、酸）質粒，，NAP（奈）質粒和TOL（甲苯）質粒等。,4. 降解性質粒,即誘癌質粒。存在于根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起許多雙子葉植物的根癌。當細菌侵入植物細胞中后，在其細胞中溶解，把細菌的DNA釋放到植物細胞中。這時，含有復制基因的Ti質粒的小片段與植物細胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞控制細胞分裂的激素調節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉變成癌細胞。Ti質粒長200kb，是一個大型質粒。當前，Ti質粒

18、已成為植物遺傳工程研究中的重要載體。一些具有重要性狀的外源基因可借DNA重組技術設法插入到Ti質粒中，并進一步使之整合到植物染色體上，以改變該植物的遺傳性，達到培育植物優(yōu)良品種的目的。,5. Ti質粒（tumor inducing plasmid）,是近年來在Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質粒，分子量為200~300×106Dalton，比一般質粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質粒，其上有一系列固氮基因。,6. 巨大質

19、粒（mega質粒）,第二章 基因突變和誘變育種,突變（ mutation ）：指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳的變化。 染色體畸變——細胞學上可以看到染色體的變化突變 基因突變——細胞學上看不到遺傳物質的變化突變體（mutant）：發(fā)生了突變的微生物細胞或菌株野生型（wild type）：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生突變前的原始菌株,,,★依表型的改變分為：

20、形態(tài)突變型——個體和菌落形態(tài)的變異營養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失產生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質才能生長的突變類型。發(fā)酵突變型——喪失產生某種生物合成酶能力的突變型抗性突變型——因突變而產生了對某種化學藥物或致死物理因子的抗性條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型抗原突變型——因突變而引起的抗原結構發(fā)生改變產量突變型——,（一）基因突變的類型,★按是

21、否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細胞來分：選擇性突變株（selective mutant）：具有選擇標記（如營養(yǎng)缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當?shù)沫h(huán)境條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，就比較容易檢出和分離到。非選擇性突變株（non-selective mutant）：無選擇標記（如產量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。,定義：每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的

22、幾率。突變率為10–8是指該細胞在一億次細胞分裂中，會發(fā)生一次突變。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。如一個含108個細胞的群體，當其分裂為2×108個細胞時，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10–8 。突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)突變是獨立的。某一基因發(fā)生突變不會影響其它基因的突變率。在同一個細胞中同時發(fā)生兩個基因突變的幾率是極低的，因為雙重突變型的幾率只是

23、各個突變幾率的乘積。由于突變的幾率一般都極低，因此，必須采用特殊手段篩選突變株加以確定。,（二）突變率,若干細菌某一性狀的自發(fā)突變率,菌 名 突變性狀突變率E. coli抗T1噬菌體3 ×10–8E. coli抗T3噬菌體1 ×10–7 E. coli不發(fā)酵乳糖1 ×10–10E. coli 抗紫外線1 ×10–5Staphylococcu

24、s aureus 抗青霉素1 ×10–7S. aureus 抗鏈霉素1 ×10–9 Salmonella typhi抗25?g/L鏈霉素1 ×10–6 Bacillus megaterium 抗異煙肼5 ×10–5,（三）突變的特點,適用于整個生物界，以細菌的抗藥性為例。不對應性：突變的性狀與突變原因之間無直接的對應關系。自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)

25、地產生。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨立性：各種突變獨立發(fā)生，不會互相影響?？烧T發(fā)性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳?？赡嫘裕簭脑嫉囊吧突虻阶儺愔甑耐蛔兎Q為正向突變（forward mutation），從突變株回到野生型的過程則稱為回復突變或回變（back mutation或reverse mutation）。,（四）基因突變的自發(fā)性和不對應性的證明,在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去相當長時

26、間內對這種抗性產生的原因爭論十分激烈。一種觀點認為，突變是通過適應而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的抵抗對象）誘發(fā)出來的，突變的原因和突變的性狀間是相對應的，并認為這就是“定向變異”，也有人稱它為“馴化”或“馴養(yǎng)”。另一種看法則認為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯綜在一起，所以難以探究問題的實質。從1943年起，經過幾個嚴密而巧妙的實驗設計，主要攻克了檢出

27、在接觸抗性因子前已產生的自發(fā)突變株的難題，終于解決了這場紛爭。,變量試驗又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年，S. E. Luria 和M. Delbrück 根據(jù)統(tǒng)計學原理，設計了左方的實驗。,1. 變量試驗fluctuation test,2.涂布試驗,原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率。,,涂布試驗中突變率的計算,初始接種量：5 × 104 個/皿培養(yǎng)5小時，繁殖了12.3代，每個微菌落約含51

28、00個細菌這時，每個平皿上的細胞數(shù)為：5100 × 5 × 104 ≈ 2.6 ×108個/皿在6個平板上，比接種時增加的細胞數(shù)為：6 ×（2.6 × 108 ? 5 × 104）= 15.6 ×108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個突變，故突變率 = 28/15.6 ×108 = 1.8 ×10?8,3. 平板影印培養(yǎng)試驗（replic

29、a plating）,1952年，J. Lederberg夫婦的論文《平板影印培養(yǎng)法和細菌突變株的間接選擇》，更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產生的，這一突變與相應藥物環(huán)境毫不相干。平板影印培養(yǎng)法，是一種能達到在一系列培養(yǎng)皿的相同位置上出現(xiàn)相同遺傳型菌落的接種培養(yǎng)方法：把長有許多菌落的母種培養(yǎng)皿倒置于包有滅菌絲絨布的木質圓柱印章上，使其沾上來自平板上的菌落。然后可把這一“印章”上的菌落一一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板上

30、。待這些平板培養(yǎng)后，對各平板相同位置上的菌落作對比后，就可選出適當?shù)耐蛔冃途?。?jù)報道，用此法可把母平板上10~20%量的細菌轉移到絲絨布上，并可利用這一“印章”接種8個子培養(yǎng)皿。因此，通過影印培養(yǎng)法，就可以從在非選擇性條件下生長的細菌群體中，分離出各種類型的突變株。,平板影印培養(yǎng)法,在根本未接觸過任何一點鏈霉素的情況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說明了突變是自發(fā)產生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。平板影印培養(yǎng)不僅在微生

31、物遺傳理論的研究中有重要應用，而且在育種時間和其它研究中均有應用，值得很好地領會。,（五）基因突變的機制,基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，誘變又可分為點突變和畸變。具體類型可歸納如下：,1. 誘變機制,誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。按照遺傳物質結構變化的特點討論幾種有代表性的誘變劑的作用機制。,（1）

32、堿基置換（substitution）,定義：對DNA來說，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷（microlesion），一般也稱點突變（point mutation）。它只涉及一對堿基被另一對堿基所置換。分類：轉換（transition），即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換； 顛換（transversion），即一個嘌呤被一個嘧啶,或是一個嘧啶被一個嘌呤所置換。,對某一具體誘變劑來說，即可

33、同時引起轉換與顛換，也可只具其中的一種功能。根據(jù)化學誘變劑是直接還是間接地引起置換，可把置換的機制分成以下兩類來討論。,,,★直接引起置換的誘變劑,定義：一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學反應的誘變劑，不論在機體內或是在離體條件下均有作用。種類：很多。例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。作用：它們可與一個或幾個核苷酸發(fā)生化學反應，

34、從而引起DNA復制時堿基配對的轉換，并進一步使微生物發(fā)生變異。羥胺只引起G┇C→A : T，其余都是可使G┇C=A : T發(fā)生互變的。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有.,亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。 HNO2胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U）

35、 HNO2腺嘌呤（A） 次黃嘌呤（H） HNO2鳥嘌呤（G） 黃嘌呤（X）這些反應及形成物均可在DNA復制中產生影響，主要是使堿基對發(fā)生轉換。,,,,堿基轉換的分子機制——以亞硝酸為例,,腺嘌呤（A）變成次黃嘌

36、呤（H）后引起的轉換過程：,①腺嘌呤氧化脫氨后形成烯醇式次黃嘌呤（He） ② He通過互變異構效應形成酮式次黃嘌呤（HK）③DNA復制時，HK 與胞嘧啶（C）配對④ DNA第二次復制時，C與G正常配對，實現(xiàn)了轉換。,亞硝酸引起的AT-GC轉換細節(jié),這類誘變劑主要是一些堿基類似物 ,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5—AU）、疊氮胸腺嘧啶（AIT）等等； 作用方式：通過活細胞的代謝活動參入到DNA分子中，主要是在D

37、NA復制時堿基類似物插入DNA中，引起堿基對配對錯誤，造成堿基置換。以5-溴尿嘧啶(5-BU)為例： 5-BU是胸腺嘧啶（T）的的類似物 ，酮式的5-BU可以和A配對，烯醇式的5-BU可以和G配對，在DNA分子復制的過程中，由于5-BU的插入和互變異構導致堿基置換。,★間接引起置換的誘變劑,5-BU引起的轉換,5-BU引起的轉換,從上圖中，還可以看到5-BU的摻入引起的G┇C回復到A?T的過程。通過這兩個圖示，就很容易理解為什么同

38、一種誘變劑既可造成正向突變，又可使它產生回復突變的原因了。也可以知道，為什么像5-BU這類代謝類似物只有對正在進行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對休止細胞、游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。,（2）移碼突變,frame-shift mutation 或 phase-shift mutation，指誘變劑使DNA分子中增加（插入）或缺失一個或少數(shù)幾個核苷酸，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉錄和轉譯錯誤的一類突變。

39、由移碼突變所產生的突變株，稱為移碼突變株（frame-shift mutant）。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷。丫啶類染料，包括原黃素、丫啶黃、丫啶橙和α-氨基丫啶等，以及一系列稱為ICR類的化合物，都是移碼突變的有效誘變劑。,,圖8-14——能誘發(fā)移碼突變的幾種代表性化合物,引起移碼突變的誘變劑：主要是吖啶類染料，如吖啶黃、吖啶橙等等。這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結構與一個嘌呤—嘧啶對十分相似

40、。,丫啶類化合物的誘變機制：,至今還不很清楚。有人認為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結構與一個嘌呤–嘧啶對十分相似，故能嵌入兩個相鄰DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開（兩個堿基對原來相距0.34nm，當嵌入一個丫啶分子時，就變成0.68nm），從而在DNA復制過程中，會使鏈上增添或缺失一個堿基，結果就引起了移碼突變。,丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復突變圖示：,（3）染色體畸變（chromosomal aberration）,

41、某些理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點突變外，還會引起DNA的大損傷（macrolesion）——染色體畸變，它包括：染色體結構上的變化：缺失（deletion）重復（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）染色體數(shù)目的變化,★染色體結構上的變化,分為染色體內畸變和染色體間畸變兩類。染色體內畸變：只涉及一條染色體上的變化，如發(fā)生染色體的部分缺失或重復時，

42、其結果可造成基因的減少或增加；如發(fā)生倒位或易位時，則可造成基因排列順序的改變，但數(shù)目卻不改變。倒位--------是指斷裂下來的一段染色體旋轉180?后，重新插入到原來染色體的原位置上，從而使其基因順序與其它的基因順序相反；易位--------是指斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上。染色體間畸變：指非同源染色體間的易位。,,染色體畸變,轉座因子（transposible element）,由40年

43、代B. McClintock對的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位，自1967年以來，已在微生物和其它生物中得到普遍證實，并已成為分子遺傳學研究中的一個熱點。舊概念：基因是固定在染色體DNA上的一些不可移動的核苷酸片段。新發(fā)現(xiàn)：有些DNA片段不但可在染色體上移動，還可從一個染色體跳到另一個染色體，從一個質粒跳到另一個質?；蛉旧w，甚至還從一個細胞轉移到另一個細胞。在這些DNA順序的跳躍過程中，往往導致DNA鏈的斷裂或重接，從而產生重組交換或使

44、某些基因啟動或關閉，結果導致突變的發(fā)生。轉座因子（transposible element）：在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序。也稱作跳躍基因（jumping gene）或可移動基因（movable gene）。,轉座因子的種類（1）,插入序列（IS，insertion sequence）：特點是分子量最?。▋H0.7~1.4kb），只能引起轉座（transposition）效應而不含其它基因?？梢栽谌旧w、F因子

45、等質粒上發(fā)現(xiàn)它們。已知的IS有5種，即 IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。E . coli的F因子和核染色體組上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通過這些同源序列間的重組，就可使 F因子插入到E . coli的核染色體組上，從而使后者成為Hfr菌株。因IS在染色體組上插入的位置和方向的不同，其引起的突變效應也不同。IS引起的突變可以回復，其原因可能是IS被切離，如果因切離部位有誤而帶走IS以外的一部分DNA序列，就會在插入部

46、位造成缺失，從而發(fā)生新的突變。,轉座因子的種類（2）,轉座子（Tn，transposon，又稱轉位子，易位子）：與IS和Mu噬菌體相比，Tn的分子量是居中的（一般為2~25kb）。它含有幾個至十幾個基因，其中除了與轉座作用有關的基因外，還含有抗藥基因或乳糖發(fā)酵基因等其它基因。Tn雖能插到受體DNA分子的許多位點上，但這些位點似乎也不完全是隨機的，其中某些區(qū)域更易插入。,轉座因子的種類（3）,Mu噬菌體（即 mutator phage，誘

47、變噬菌體）：它是E . coli的一種溫和噬菌體。與必須整合到宿主染色體特定位置上的一般溫和噬菌體不同，Mu噬菌體并沒有一定的整合位置。與以上的IS和Tn兩種轉座因子相比，Mu噬菌體的分子量最大（37kb），它含有20多個基因。Mu噬菌體引起的轉座可以引起插入突變，其中約有2%是營養(yǎng)缺陷型突變。,若干誘變劑的作用機制及誘變功能,誘變因素在DNA上的初級效應 遺傳效應堿基類似物 摻入作用

48、 AT=GC雙向轉換 羥 胺 與胞嘧啶起反應GC→AT的轉換 亞硝酸 A、G、C的氧化脫氨作用AT=GC雙向轉換 交 聯(lián) 缺失 烷化劑 烷化堿基（主要是G） AT=GC雙向轉換 烷化磷酸基團

49、 AT→TA的顛換 喪失烷化的嘌呤 GC→CG的顛換糖-磷酸骨架的斷裂巨大損傷（缺失、重復、倒位、易位）丫啶類 堿基之間的相互作用（雙鏈變形） 碼組移動（＋或－）紫外線 形成嘧啶的水合物 GC→AT轉換 形成嘧啶的二聚體碼組移動（＋或－） 交 聯(lián)

50、 電離輻射 堿基的羥基化核降解 AT=GC雙向轉換 DNA降解 碼組移動（＋或－） 糖-磷酸骨架的斷裂巨大損傷（缺失、重復、倒位、易位） 喪失嘌呤 加熱

51、 C脫氨基 CG→TA轉換 Mu噬菌體 結合到一個基因中間 碼組移動,,2.自發(fā)突變機制,自發(fā)突變是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。幾種自發(fā)突變的可能機制★微生物自身有害代謝產物的誘變效應：過氧化氫是普遍存在于微生物體內的一種代謝產物。它對Neurospora（脈孢菌）有誘變作用，這種作用可因同時加入過氧化氫酶而降低，如果在加入

52、該酶的同時又加入酶抑制劑KCN，則又可提高突變率。這就說明，過氧化氫很可能是“自發(fā)突變”中一種內源性誘變劑。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的原因?！镉杀尘拜椛浜铜h(huán)境因素引起：天然的宇宙射線,★互變異構效應：,堿基T、G的第六位上是酮基，會以酮式或烯醇式兩種互變異構的狀態(tài)出現(xiàn)C、A的第六位上是氨基，會以氨基式或亞氨基式兩種互變異構的狀態(tài)出現(xiàn)平衡一般趨向于酮式或氨基式，在DNA雙鏈結構中一般總是以A︰T和G┇

53、C堿基配對的形式出現(xiàn)在偶然情況下，在DNA復制到達這一位置的瞬間，在T以稀有的烯醇式出現(xiàn)時，其相對位置上就出現(xiàn)G同樣，如果C以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)在DNA復制到達這一位置的瞬間，則在新合成DNA單鏈中與C相對應的位置上就將是A。這可能就是發(fā)生相應的自發(fā)突變的原因。要預言在某一時間、某一基因發(fā)生自發(fā)突變是不可能的。在運用數(shù)學方法對這些偶然事件做大量統(tǒng)計分析后，可以發(fā)現(xiàn)并掌握其中的規(guī)律。例如，據(jù)統(tǒng)計，堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為10

54、–8 ~ 10 – 9。,（六）紫外線對DNA的損傷及其修復,已知的DNA損傷類型很多，機體對其修復的方式也各異。發(fā)現(xiàn)較早和研究得較深入的是紫外線（U.V.，ultraviolet ray）的作用。嘧啶對紫外線的敏感性要比嘌呤強得多。嘧啶的光化產物主要是二聚體和水合物。其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價結合的胸腺嘧啶二聚體。二聚體的出現(xiàn)會減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結

55、構扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，從而有可能引起突變或死亡。在互補雙鏈間形成嘧啶二聚體的機會較少。但一旦形成，就會妨礙雙鏈的解開，因而影響DNA的復制和轉錄，并使細胞死亡。,,光復活作用（photoreactivation）,定義：經紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復活作用。這一現(xiàn)象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomyces griseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來，在許

56、多微生物中都得到了證實。最明顯的是在E.coli的實驗中：對照：8×106個/ml E.coli U.V. 100個/ml E.coli試驗：8×106個/ml E.coli U.V. 360~490nm 2×106個/ml E.coli 可見光，30分經紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶

57、二聚體的DNA分子，在黑暗下會被一種光激活酶（photoreactivating enzyme）即光裂合酶（photolyase）結合，當形成的復合物暴露在可見光（300~500nm）下時，此酶會因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。與此同時，光激活酶也從復合物中釋放出來，以便重新執(zhí)行功能。每一E.coli細胞中約含有25個光激活酶分子。由于一般的微生物中都存在著光復活作用，所以進行紫外線誘變育種時，只能在紅光下照射及處理

58、照射后的菌液。,,,圖:光復活作用,暗修復作用（dark repair）,又稱切除修復（excision repair）。是活細胞內一種用于修復被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和γ射線等）損傷后的DNA的機制。這種修復作用與光無關。有四種酶參與——①內切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5’一側切開一個3’-OH和5’-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5’-P至3’-OH方向切除二聚體，并擴大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一條互補鏈為模板，從原

59、有鏈上暴露的3’-OH端起逐個延長，重新合成一段缺失的DNA鏈；④通過連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3’-OH末端與原鏈的5’-P末端相連接，從而完成了修復作用。,暗修復作用（dark repair）,1、由核酸內切酶切開二聚體的5’末端，形成3’-OH和5’-P的單鏈缺口2、核酸外切酶從5’-P到3’-OH方向切除二聚體，并擴大缺口。3、DNA聚合酶以另一條互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’-OH端起合成缺失片段。4、連接酶

60、將新合成的3’-OH與原有的5’-P相連接。,誘變育種：是用物理或化學的誘變劑使誘變對象內的遺傳物質（DNA）的分子結構發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。,誘變育種具有極其重要的實踐意義。當前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產部門所使用的高產菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產性能的。,（七）誘變育種,誘變育種的步驟：,原始菌種,純化,斜面/肉湯培養(yǎng),單孢子/單細胞懸液,誘變劑處理,平板分離,移

61、至斜面,小試,中試,初篩,復篩,,,,,,,,,,,計算存活率,觀察形態(tài)變異，挑單菌落,良種保藏,原菌種特性鑒定,1.出發(fā)菌株的選擇：出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株◆出發(fā)菌株應具備： ①對誘變劑的敏感性高； ②具有特定生產性狀的能力或潛力； ◆出發(fā)菌株的來源； ①自然界直接分離到的野生型菌株： ②歷經生產考驗的菌株： ③已經歷多次育種處理的菌株：,2.制備細胞懸液要求：

62、①菌體處于對數(shù)生長期，并使細胞處于同步生長； ②細胞分散且為單細胞，以避免表型遲延現(xiàn)象（phenotypic lag）;方法： ①玻璃珠打散10-15min; ②加０.3%吐溫80（表面活性劑） ③用無菌脫脂棉過濾。 濃度： 細菌、放線菌 108個/ml 霉菌、酵母菌 106個/ml,表型遲延現(xiàn)象：指某一突變在DNA復制和細胞分裂后，

63、才在表型上顯示出來，造成不純的菌落。產生原因：①分離性遲延現(xiàn)象②生理性遲延現(xiàn)象,3.誘變處理：誘變劑的作用： ①提高突變的頻率 ②擴大產量變異的幅度 ③使產量變異朝著正突變或負突變移動劑量的表示法：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應預先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。—致死率是最好的誘變劑相對劑量的

64、表示方法。最適劑量的選擇：產量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在70~80%）,,誘變劑劑量一般指強度與作用時間的乘積。各種誘變劑有不同的劑量表示方式，如化學誘變劑以一定溫度下誘變劑的濃度和處理時間來表示。在育種實踐中，常以殺菌率來作誘變劑的相對劑量。誘變劑的合適劑量：凡在提高誘變率的基礎上，能擴大變異幅度，促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。要確定一個合適的劑量，常常要經過多次試驗。就一般微生物而言，在一定的劑量范圍內

65、，突變率往往隨劑量的增高而提高，但正變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中；還發(fā)現(xiàn)經多次誘變而提高產量的菌株中，更容易出現(xiàn)負變。因此，在誘變育種工作中，目前大家比較傾向于采用較低的劑量。,選擇誘變劑的種類：在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果下，應選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。,紫外

66、誘變方法:,設備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等，紫外燈：波長為253.7nm, 功率是15W處理時的照射距離：20cm — 30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量。,由于微生物接受的照射劑量與燈的功率、照射距離、照射時間、菌液濃度、菌液厚度、細胞本身特性等因素有關，所以單純用時間表示照射劑量并不完全可靠。一定的死亡率必定對應一定的照射劑量，

67、所以，在實際應用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。 通常先繪制照射時間與死亡率的關系曲線，然后選擇合適的劑量。 生產上經常采用的劑量： 死亡率為70%——80%左右。,,,艾姆斯試驗測定潛在化學致癌物的基本原理,艾姆斯試驗測定潛在化學致癌物的基本原理Salmonella typhimurium的組氨酸缺陷型（his―）菌株在 [―]平板上不能生長，如發(fā)生回復突變則能生長。如將可疑“三致”物黃曲霉毒素，加入鼠肝勻漿，保溫一段

68、時間后，吸入濾紙片中，然后將濾紙片放置于[―]平板中央。經培養(yǎng)后，出現(xiàn)三種情況：如在平板上無大量菌落產生，說明試樣中不含誘變劑；如在紙片周圍有一抑制圈，其外才是大量菌落，說明試樣中某誘變劑的濃度很高；如在紙片周圍即生長大量菌落，說明誘變劑的濃度合適。目前，艾姆斯試驗法已廣泛用于檢測食品、飲料、藥物核引水等試樣中的致癌物。它具有快速（僅3天左右）、準確（檢測致癌物的符合率＞85%）和費用省等優(yōu)點。,,Ames test：對化學誘變劑做檢

69、測,菌種：鼠傷寒沙門氏菌 his -； 原理： his -在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復突變則長。,Ames test 方法示意圖,4. 菌種篩選,,4.1 篩選方案：實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復篩兩步進行。初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網；——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應盡