微生物的遺傳變異與育種

1、微生物的遺傳變異與育種,第八章,本章內(nèi)容：,基因突變與誘變育種基因重組菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,第一節(jié) 基因突變與誘變育種,一、基因突變：,（一）突變類型：,基因突變與誘變育種,細胞形態(tài)形態(tài)突變型 菌落形態(tài) 營養(yǎng)缺陷型生化突變型 抗性突變 抗原性突變（包括細胞內(nèi)部、表面成分的　　　　　　　　　　　

2、 改變）致死性突變型（合成關(guān)鍵性酶的基因發(fā)生了突變，則表現(xiàn) 出致死突變）條件致死突變型：如突變?yōu)闇囟让舾行停?7℃死， 25℃ 活） 其它突變型：毒力突變、糖發(fā)酵突變、產(chǎn)量、產(chǎn)品突變等,按表型分,,,,溫度敏感型突變,基因突變與誘變育種,（二）突變的特點：,1）

3、不對應(yīng)性：環(huán)境與變異無對應(yīng)性 2）自發(fā)性：非人為的誘變因素下發(fā)生 3）稀有性：生物體的自發(fā)突變率為10-10～10-12 4）獨立性：一個基因的突變對其它基因突變無 影響 5）誘變性：誘變劑可提高突變率10~105倍 6）穩(wěn)定性：突變性狀穩(wěn)定、可遺傳 7）可逆性：有回復(fù)突變,基因突變與誘變育種,（三）基因突變自發(fā)性及不對應(yīng)的證明：,基因突

4、變與誘變育種,變量彷徨試驗： 涂布試驗試驗： 平板影印培養(yǎng)試驗：,自發(fā)突變：沒有人工誘變因素的參與，生物體的自然突變,1.變量彷徨試驗：,1)抗性細胞的出現(xiàn)，是在接觸噬菌體之前；2)噴上噬菌體，僅起淘汰野生型和鑒別抗性株作用；3)由于甲方高度彷徨，說明突變是隨機的。,基因突變與誘變育種,2. 涂布試驗,基因突變與誘變育種,1、突變與噬菌體無關(guān)；2、涂布使抗性菌株均勻分布；3、抗性突變可在任何時間發(fā)生，與噬菌

5、體存在無關(guān)。,以上實驗用統(tǒng)計學(xué)原理間接證明。,3. 平板影印,基因突變與誘變育種,實驗表明：從未接觸 str 的菌株可發(fā)生抗性突變， 分離可得到純的 str r 菌株。,由此表明：,突變是自發(fā)的與環(huán)境不對應(yīng)的。,基因突變與誘變育種,（四）基因突變的機制：（自學(xué)） （五）紫外線(U.V)對DNA的損傷及修復(fù): （自學(xué)）,二、突變與育種,（一）自發(fā)突變與生產(chǎn)育種,基因突變與誘變育種

6、,1.生產(chǎn)選育：群體培養(yǎng)中個別的變異個體表現(xiàn)出 生長優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)突變種后，隨時分離、純化。2.定向培育：用特定的環(huán)境長期處理某一微生物 群體,同時不斷對其移種、傳代，以達到積累 和選擇合適的自發(fā)突變 體的一種育種方法.,3、自發(fā)突變的機制：,自發(fā)突變(spontaneous)：在非人為的情況下由于 遺傳 物質(zhì)的微小變化引起的性狀變異。原因可能是：1

7、）環(huán)境因素；2）自身有毒產(chǎn)物的積累；3）互變異構(gòu)效應(yīng)；4）環(huán)出效應(yīng)等。,基因突變與誘變育種,（二）誘變育種,1. 概念：誘變育種是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。,基因突變與誘變育種,2. 誘變劑：,2）種類： 物理因子（phisical agents) 化

8、學(xué)因子(chemical agents) 轉(zhuǎn)座子(transposable elements)物理誘變劑：U.V、χ、γ、快中子、超聲波等。,基因突變與誘變育種,1） 概念：凡能提高基因突變頻率的理化因素。,化學(xué)誘變劑：,烷化劑 (alkylating agents)： 如：氮芥、硫酸二乙酯、亞硝基胍、NTG等 機制：將烷烴加在含氮堿基上，改變氫鍵性質(zhì) 堿基類似物 (base a

9、nalogs)： 如：疊氮胸腺嘧啶（AIT）等； 機制：在DNA復(fù)制時將堿基類似物插入DNA中，而堿 基類似物沒有正常堿基的氫鍵性質(zhì)，在DNA復(fù) 制時出現(xiàn)突變體。,基因突變與誘變育種,插入劑 (intercalating agents):,,,如：溴化乙啶等一些三環(huán)分子。機制：與DNA中的一對堿基有大致相同的位點，這些分子 不改變堿基的氫鍵性質(zhì)，而插入在雙螺旋中，

10、加寬間 距，引起堿基增加。,基因突變與誘變育種,3. 誘變程序：,基因突變與誘變育種,原始菌種,純化,斜面/肉湯培養(yǎng),單孢子/單細胞懸液,誘變劑處理,平板分離,移至斜面,小試,中試,初篩,復(fù)篩,,,,,,,,,,,計算存活率,觀察形態(tài)變異，挑單菌落,良種保藏,原菌種特性鑒定,4. 誘變的主要環(huán)節(jié),1）誘變劑的選擇：,基因突變與誘變育種,a. 了解誘變劑的性質(zhì)、作用機理和使用方法b. 處理方式： 單一因子處

11、理： 復(fù)合因子處理：兩種以上因素,先后使用同時使用單一因子重復(fù)使用,,c. 處理劑量：測致死率。,方法,平板菌落計數(shù)法紙片法,,一般殺菌率為70%左右。,基因突變與誘變育種,Ames test：對化學(xué)誘變劑做檢測,菌種：鼠傷寒沙門氏菌 his -；原理： his -在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復(fù)突變則長。,基因突變與誘變育種,Ames test 方法示意圖,用于檢測食品、飲料、藥物和飲水等

12、樣品的中致癌物,基因突變與誘變育種,2）出發(fā)菌株： 育種的原始菌種；應(yīng)具備：,對誘變劑的敏感性高；生產(chǎn)中選育過的自發(fā)變異菌株；本身具有一些有利性狀；對代謝產(chǎn)物有一定積累；已經(jīng)發(fā)生過某些變異。,基因突變與誘變育種,3）單孢子或單細胞懸液的制備,a. 必要性： 單細胞可以均勻地接觸誘變劑 避免出現(xiàn)不純的菌落——菌種退化,基因突變與誘變育種,,b. 制備： 物

13、理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl) 化學(xué)誘變劑——緩沖液,c. 方法：,三角瓶內(nèi)加φ0.5cm玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐溫80（表面活性劑）用無菌脫脂棉過濾。,d. 濃度： 細菌、放線菌 108個/ml 霉菌、酵母菌 106個/ml,基因突變與誘變育種,4)設(shè)計和采用效率高的篩選方案和方法,初篩： 平

14、板上做定性、半定量的測定，觀察突變株 的生理效應(yīng)范圍。方法：梯度平板法；（抗性菌株） 紙片法； （抗性菌株） 透明圈法；（淀粉酶產(chǎn)生菌株等） 變色圈法；（氨基酸生產(chǎn)菌株）,基因突變與誘變育種,如：用梯度平板法篩選抗性菌株,基因突變與誘變育種,抗生素法直接篩選抗藥性突變體,基因突變與誘變育種,復(fù)篩：,較精確的生物化學(xué)分析方法 ——做搖瓶測定（見P250

15、）,基因突變與誘變育種,三、營養(yǎng)缺陷型的篩選,（一）概念：,基因突變與誘變育種,1. 三種遺傳型個體,營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）：經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能 力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng) 有機養(yǎng)分才能正常生長的變異菌株。 如：lys - ; bio - ;,野生型(wild type)：自然界分離到的任何微生物

16、，在 其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為 該微生物的野生型。如：lys + ; bio + ;,原養(yǎng)型 (prototroph) ：指auxo突變菌株回復(fù)突變或重組 后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。,2、篩選用的培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基（minimal medium,MM）[-]：滿足野生

17、 型菌株營養(yǎng)要求最低成分的組合。 完全培養(yǎng)基（complete medium,CM）[+]：滿足一 切auxo生長的天然或半組合培養(yǎng)基。 補充培養(yǎng)基（supplemented medium,SM）[x]：在 MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成 分以滿足相應(yīng) auxo生長的組合培養(yǎng)基。,基因突變與誘變育種,（二）篩選方法,auxo的鑒

18、定,基因突變與誘變育種,誘變處理,auxo的濃縮,auxo的檢出,,,,1. 誘變處理（同前）,auxo的篩選程序：,,,,,,,,,,,基因突變與誘變育種,細菌培養(yǎng),離心洗滌,誘變處理,CM后培養(yǎng),洗滌,MM加PN,涂布于CM平板,影印培養(yǎng),挑取,鑒定,菌種保存,2. auxo的濃縮：,基因突變與誘變育種,1）抗生素法： 原理： 青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細胞，對休止態(tài)細胞無作用。方法：菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基

19、中。,,2）菌絲過濾法：,適用于絲狀（放線菌、霉菌）原理：基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲；auxo孢子可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。,基因突變與誘變育種,3）差別殺菌法：,基本培養(yǎng)基上只有野生型生長，加熱殺死野生型營養(yǎng)體，保留auxo芽孢。細菌——80℃酵母——60 ℃適用于產(chǎn)芽孢、孢子菌。,基因突變與誘變育種,3. auxo的檢出,1）逐個檢出法,基因突變與誘變育種,2）影印平板培養(yǎng)法,,3）限量補充法 （在mm中加0.

20、01%蛋白胨， auxo菌落小，野生型菌落大）,基因突變與誘變育種,3）夾層培養(yǎng)法,4. auxo的鑒定,基因突變與誘變育種,1）生長譜法方法簡便；回變和污染不影響 結(jié)果測定物質(zhì)可為粉末 或紙片,混合氨基酸法步驟：,a. 將多種營養(yǎng)因子編組， 如： 一組：1 2 3 4 5 二組：2 6 7 8 9 三組：3 7 10 11 12

21、 四組：4 8 11 13 14 五組：5 9 12 14 15,基因突變與誘變育種,2）混合氨基酸（Vit）法,1）每組內(nèi)無重復(fù)的營 養(yǎng)因子2）每組中應(yīng)包含只出 現(xiàn)一次的因子3）每組中其他因子應(yīng) 分別出現(xiàn)二次,營養(yǎng)因子分組編排時注意：,基因突變與誘變育種,b. 將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)c. 結(jié)果分析,a. 將多種營養(yǎng)因子

22、編組， 如： 一組：1 2 3 4 5 二組：2 6 7 8 9 三組：3 7 10 11 12 四組：4 8 11 13 14 五組：5 9 12 14 15,5. auxo 的應(yīng)用,1）作為標記菌株：進行基因工程、誘變育種、 代謝過程的研究中的親本標記；2）作為生產(chǎn)菌種：aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種；3）作為aa、維

23、生素、堿基的測定菌株。,基因突變與誘變育種,第二節(jié) 基因重組,本節(jié)內(nèi)容： 原核生物的基因重組 真核生物的基因重組,基因重組：,把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)遺傳物質(zhì)重新組合后，形成新遺傳型個體的方式。,基因重組——分子水平的雜交一般雜交——細胞水平,基因重組,甲生長快、產(chǎn)量低,乙生長慢、產(chǎn)量高,,基因重組,基因重組,如：,生長快、產(chǎn)量高,一、原核生物的基因重組,（一）轉(zhuǎn)化（transformat

24、ion),基因重組,受體菌(receptor)直接吸收來自供體菌(donor)的DNA片段，通過交換，將其整合到自己的基因組中，再經(jīng)復(fù)制就使自己變成一個轉(zhuǎn)化子(transformation)。 這種受體菌接受供體菌的DNA片段而獲得部分新的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。,概念：,1. 感受態(tài),基因重組,不同菌株的親緣關(guān)系 受體細胞是否處于感受態(tài),,感受態(tài)：受體細胞最易接受外源DNA片段并實

25、 現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。,不同菌出現(xiàn)感受態(tài)的時間不同。,轉(zhuǎn)化的決定因素：,2. 感受態(tài)因子,一種胞外蛋白質(zhì)，分子量為5～10kD,基因重組,其作用為：,催化轉(zhuǎn)化，促進外來DNA片段吸收可降解細胞表面某種成分，使DNA受體暴露 1）不同菌細胞DNA受體位點不同2）有的菌感受態(tài)因子只對同種菌起作用,3. 轉(zhuǎn)化因子：,轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是供體DNA片段一般為線狀或閉合環(huán)狀；單鏈或雙鏈；轉(zhuǎn)化的

26、頻率往往很低，一般為0.1～1%。 據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）的 轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高,基因重組,4. 轉(zhuǎn)化的檢出,甲（受體） strr，lys-,基因重組,如出現(xiàn)strr，lys+的菌株，則表明已經(jīng)轉(zhuǎn)化,乙（供體）strs，lys+,在含str的MM上培養(yǎng),,轉(zhuǎn)化的全過程（以噬菌體為例）,基因重組,（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction),以噬菌體為媒介，把供體細胞的DNA片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合

27、，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細胞，稱轉(zhuǎn)導(dǎo)子。,基因重組,概念：,轉(zhuǎn)導(dǎo)以溫和噬菌體為媒介，其從宿主DNA上誘導(dǎo)裂解時可能有三種情況：,1）包入的完全是噬菌體的DNA（噬菌體）2）包入的完全是細菌DNA（完全缺陷噬菌體）3）部分帶有噬菌體基因的DNA（部分缺陷噬菌體）,基因重組,1. 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalized transduction）,1）完全轉(zhuǎn)導(dǎo)(complete transd

28、uction)： 由完全缺陷噬菌體將外源DNA片段導(dǎo)入受體細胞，經(jīng)交換、整合、復(fù)制形成遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 此時受體細胞的特點：a. 不發(fā)生溶源化； b. 不顯示免疫性； c. 不會裂解產(chǎn)生正常噬菌體。2）流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortive transduction)： 外源DNA片段不經(jīng)交換、整合、復(fù)制，僅轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和 性狀表達。 特點：子代

29、只有一個細胞帶有重組子性狀。,基因重組,由完全缺陷噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。,2. 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)：,指通過部分缺陷噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。,基因重組,,部分缺陷噬菌體：λ噬菌體帶有宿主gal基因——λdgal噬菌體λ噬菌體帶有宿主bio基因——λdbio噬菌體特點：a、無正常溶源化能力； b、受體細胞不具免疫性。,根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的高低，可分為：,1）低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）：

30、 部分缺陷噬菌體比例低，獲得局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子量極少。,2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT）：,雙重溶源菌：感染λdgal噬菌體后，又感染正 常λ噬菌體，且同時整合在菌染色體上。,HFT裂解物：誘導(dǎo)裂解雙重溶源菌，裂解物 中含等量的兩種噬菌體，稱此裂解物為~。,高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：用低感染復(fù)數(shù)的HFT裂解物感染 另一gal-受體菌時，可高頻地將其轉(zhuǎn)化 為gal+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，這種方式稱~,3.

31、 溶源轉(zhuǎn)換與轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別（自學(xué)）,基因重組,（三）接合(conjugation),供體與受體細胞直接接觸，借性菌毛傳遞大段DNA的過程。在受體細胞中發(fā)生交換、整合，使之獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新性狀的受體細胞就稱接合子。,基因重組,概念：,（四）原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）,使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（fusant）的過程。,基因重組,已成功地應(yīng)用

32、與植物細胞、真菌細胞、屬間、科間的遠緣細胞融合，融合產(chǎn)物含兩親代細胞基因組。,過程：,基因重組,二、真核微生物的基因重組,基因重組,（一）有性雜交,一般指性細胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。,凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都能采用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進行育種。,（二）準性雜交（parasexual hybridization）,同種異株的兩個體細胞融合，不經(jīng)減數(shù)分裂而導(dǎo)致

33、低頻基因重組發(fā)生的一種繁殖方式。（單倍體體細胞重組）,基因重組,1. 準性生殖,2. 準性生殖的意義：,對一些沒有有性過程但有重要生產(chǎn)價值的半知菌來說，進行基因在染色體上定性研究、雜交育種，準性生殖提供了一個重要的手段。 發(fā)現(xiàn)存在構(gòu)巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放線菌中，使之有普遍意義。,3. 過程,1）菌絲聯(lián)結(jié)（anastomosis）;2）形成異核體（heterocaryon）; 細胞質(zhì)、核交流形成

34、異核菌絲體。3）核配（caryogamy)形成雜合二倍體;特點：頻率低，10-5～10-7促成：樟腦熏蒸、紫外、高溫4）體細胞交換和單倍體化,基因重組,半知菌的準性生殖示意圖,基因重組,異核體的特點：,1）具有感受性的兩種菌絲間才可形成異核體；2）具有野生型性狀，可在基本培養(yǎng)基上生長 ； （基因互補功能）3）大多數(shù)異核體的分生孢子不能在基本培養(yǎng)基 上生長；如能生長，則為異核體、或為雜合 二

35、倍體（重組子）。,基因重組,異核體：同一菌絲有不同遺傳性狀的核在同一 細胞質(zhì)中生長。同核體：同一菌絲中只有一種核。,體細胞交換和單倍體化,雜合體細胞中有極少數(shù)細胞核在進行有絲分裂的過程中，能發(fā)生體細胞染色體間的交換、分離（單倍體化）而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子、雙倍體及非整倍體。,A,B,A+B,（同核體）,（異核體）,A,A,B,B,AB,A,A,B,B,（雜合二倍體）,單倍體雜合子,,,,,,基因

36、重組,4. 檢出：,1）若MM和CM上差別不大的，為穩(wěn)定 的雜合二倍體2）若MM上不長，CM上大量長，為不 穩(wěn)定異核體,基因重組,第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,一、菌種的衰退和復(fù)壯,1.衰退： 概念：菌種經(jīng)長期的人工培養(yǎng)或保藏，在 其自發(fā)突變的影響下，引起某些優(yōu)良 性狀變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象，稱為衰退。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,現(xiàn)象：,菌

37、落和細胞形態(tài)的改變；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生 能力下降；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。,衰退的原因： 有關(guān)基因負突變,1）多次傳代造成負突變數(shù)量增加 如斜面保藏： 細菌：1個月 酵母菌：3個月 放線菌、霉菌、芽孢：半年2）培養(yǎng)條件；3）誘變時出現(xiàn)

38、不純菌落。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,2. 防止衰退的方法：,控制傳代次數(shù)； 選擇合適的培養(yǎng)條件； 采用不同類型的細胞進行傳代； 采用有效的菌種保藏方法。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,3. 菌種的復(fù)壯：,復(fù)壯：使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu) 良性狀的方法。,復(fù)壯的方法：,1）純種分離： 菌落純（劃線法、涂布法、傾注法） 菌株純（單細胞挑取法）2）通過寄主體進行復(fù)壯；3）淘汰已衰退

39、的個體。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,二、菌種保藏：,1. 目的：,存活，不丟失，不污染防止優(yōu)良性狀喪失隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種,2. 原理：,創(chuàng)造一定條件，盡可能降低微生物代謝活動強度，使之基本上處于休眠狀態(tài)。,條件：1）挑選優(yōu)良純種的休眠體；2）創(chuàng)造適合長期休眠的環(huán)境條件（干燥、低溫、 缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑等）,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,3. 方法：,1）暫時保藏法——斜面保藏,

40、方法：斜面置4℃冰箱保藏，定時傳代原理：低溫下，微生物代謝強度明顯下降優(yōu)點：適用于各種微生物、簡便易行、易 于觀察；缺點：保藏時間短、傳代頻、易退化、易 污染、工作量大。,改良方法：橡皮塞取代棉塞、加礦油,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,2）長期保藏法,方法： 砂土管法 真空冷凍干燥法 液氮法,原理：運用干燥、低溫和隔絕空氣

41、等手段，降低 微生物菌種的新陳代謝速率，使菌種的生 命活動處于半永久性的休眠狀態(tài)，以達到 長期保存的目的。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,1）砂土管法：,干法：（適用于部分真菌、放線菌）將斜面上 孢子刮下，接種于無菌砂土管中（砂 裝試管2/5)，攪拌均勻。濕法：斜面中加3~5ml無菌水制成菌懸液，取菌

42、 懸液10滴加入砂土管，以管內(nèi)砂全部濕 潤為宜。,將砂土管置于干燥器中真空干燥，低溫或室溫下保藏 適用于放線菌、芽孢菌和某些真菌保藏。 保藏時間幾至幾十年。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,2）真空冷凍干燥法,原理：加有保護劑的菌懸液在凍結(jié)狀態(tài)下予以真空干燥， 使微生物細胞處于半永久的休眠狀態(tài)，以達到長 久保藏的目的。方法：用無菌脫脂牛奶作保護劑

43、，加入3ml于斜面中制成 菌懸液，分裝在安瓿中速凍真空干燥。 真空度維持在0.1~0.3mmHg,懸液維持凍結(jié)狀， 水分不斷升華，至菌體混合物呈疏松狀，熔封。優(yōu)點：適用于各種微生物；便于大量保藏；可避免污染， 菌種存活時間長（幾到幾十年）缺點：手續(xù)繁瑣。,菌種的衰退、復(fù)壯及保藏,3)液氮超低溫保藏法：,方法：用10%甘油、二