遺傳病的診斷2

1、遺傳病的診斷,重 點,遺傳病特有的診斷方法？及其應用范圍？染色體檢查適應癥基因診斷產(chǎn)前診斷,1. 產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis),2. 癥狀前診斷(presymptomatic diagnosis)3. 現(xiàn)癥病人診斷(symptomatic diagnosis),遺傳病的診斷 （diagnosis of genetic disease）,第一節(jié) 病史、癥狀和體征,1.

2、癥狀和體征：遺傳病有其它疾病相同的體征和癥狀，往往又有其本身特異性癥候群，為診斷提供初步線索。 2.病史采集：遺傳病多有家族聚集現(xiàn)象，所 以采集病史除一般病史外，應著重患者的家族史、婚姻史和生育史。,1. 系統(tǒng)、完整,第二節(jié) 系譜分析,2. 去偽存真,3. 新的基因突變,系譜分析可以有效地記錄遺傳病的家族史，確定遺傳病的遺傳方式，還能用于遺傳咨詢中個體患病風險的計算和基因定位中的連鎖分析。,第二節(jié) 系譜分析,一、孟德

3、爾式遺傳病----單基因病,1. 基因多效性(AD)2. 遺傳異質(zhì)性(AR)3. 臨床表型雜合子(XR),系譜分析可以有效地記錄遺傳病的家族史，確定遺傳病的遺傳方式，還能用于遺傳咨詢中個體患病風險的計算和基因定位中的連鎖分析。,第二節(jié) 系譜分析,二、非孟德爾式遺傳病,1. 線粒體遺傳病2. 多基因病,系譜分析可以有效地記錄遺傳病的家族史，確定遺傳病的遺傳方式，還能用于遺傳咨詢中個體患病風險的計算和基因定位中的連鎖分

4、析。,一、孟德爾式遺傳病,第二節(jié) 系譜分析,1. 遺傳印記 2. 動態(tài)突變 3. 單親二體 4. 性別 5.修飾基因,三、特殊遺傳方式,系譜分析可以有效地記錄遺傳病的家族史，確定遺傳病的遺傳方式，還能用于遺傳咨詢中個體患病風險的計算和基因定位中的連鎖分析。,二、非孟德爾式遺傳病,一、孟德爾式遺傳病,染色體檢查： 染色體檢查亦稱核型分析（karyotype analysis）是確診

5、染色體病的主要方法。 一、染色體檢查標本的來源： 主要取自患者的外周血和身體的各種組織；胎兒的絨毛、羊水中胎兒脫落細胞和臍血、受精卵卵裂細胞、皮膚等各種組織。,第三節(jié) 細胞遺傳學檢查,第三節(jié) 細胞遺傳學檢查,二、染色體檢查 的適應癥：,1. 智能發(fā)育不全、生長遲緩或伴有其它先天畸形者,2. 夫婦中有染色體異常，如平衡易位、嵌合體等3. 家族中已發(fā)現(xiàn)染色體異常或先天畸形個體4. 多發(fā)性流產(chǎn)的婦女及其丈夫

6、5. 原發(fā)閉經(jīng)和男女不育癥者6. 34歲以上的高齡孕婦7. 有兩性內(nèi)外生殖器畸形者,三、方法：略四、臨床診斷標準： 15個分裂相，其中有2個異同將增倍。不僅對染色體的情況作出正確診斷，還要了解患者異常染色體的來源，而且對生育第二胎提供咨詢。,第三節(jié) 細胞遺傳學檢查,二、性染色質(zhì)檢查：優(yōu)點是方法簡單，主要用于疑為兩性畸形或性染色體數(shù)目異常的疾病診斷或產(chǎn)前診斷，有一定價值，但確認仍需依靠 染色體檢查。

7、,1. X 性染色質(zhì)檢查,2. Y 性染色質(zhì)檢查,一、染色體檢查 —— 核型分析,預測性別：98%。（X連鎖遺傳?。?第三節(jié) 細胞遺傳學檢查,三、染色體熒光原位雜交(FISH)： 應用標記的特異性DNA探針與玻片上的細胞中期染色體或間期核的DNA進行FISH檢測可完成非整倍體的檢測。,二、性染色質(zhì)檢查,一、染色體檢查 —— 核型分析,第三節(jié) 細胞遺傳學檢查,第三節(jié) 細胞遺傳學檢查,第四節(jié)

8、 皮膚紋理分析,一、正常皮膚紋理（一）指紋（二）掌紋（三）指摺紋和手掌摺紋（四）腳掌紋,二、染色體病患者皮膚紋理特征,基因突變引起的單基因病往往表現(xiàn)在酶和蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的改變或缺如。因此，酶和蛋白質(zhì)的定性定量分析是診斷單基因病或分子代謝病的主要方法。,1）對酶和蛋白質(zhì)的檢查①蛋白質(zhì)的檢查：血液。異常的血紅蛋白②酶的檢查：肝、腎、皮膚、甲狀腺、腸粘膜。,A B C,,,酶,第五節(jié)

9、 生物化學檢查,苯丙酮尿癥（PKU)（AR),病因：肝中苯丙氨酸羥化酶缺乏（PAH) , PAH基因12q24 13個外顯子,苯乙酸,,苯乙酰谷氨酰氨,,,,,L-谷氨酸脫羧酶,r氨基丁酸減少,抑制,5-羥色氨脫羧酶,5-羥色氨減少,,抑制,影響大腦的發(fā)育,,,2）代謝產(chǎn)物檢查,分子代謝病可以從三個層次檢測和分析,1．酶和蛋白質(zhì)的分析：基因突變引起的單基因病主要是特定的酶和蛋白質(zhì)的質(zhì)和量

10、改變的結(jié)果。 2．代謝產(chǎn)物的檢測：酶缺陷導致一系列生化代謝紊亂，從而使代謝中間產(chǎn)物、底物、終產(chǎn)物旁路代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。因此，檢測某些代謝產(chǎn)物的質(zhì)和量的改變?？砷g接反映酶的變化而作出診斷。 3．基因分析 ：基因診斷（gene diagnosis）是利用DNA分析技術(shù)直接從基因水平（DNA或RNA）檢測遺傳的基因缺陷。,上海：1981～1987年對284,396名新生兒進行PKU篩查，查出PKU患兒15名，高苯丙氨酸血癥4名。,

11、第五節(jié) 生物化學檢查,第六節(jié) 基因診斷,和傳統(tǒng)的診斷方法主要差異在于直接從基因型推斷表型，即可以越過產(chǎn)物（酶和蛋白質(zhì)）直接檢測基因結(jié)構(gòu)而作出診斷，這樣就改變了傳統(tǒng)的表型診斷方式，故基因診斷又稱為逆向診斷（reverse diagnosis）。 這一診斷方法不僅可對患者，還可以在發(fā)病前作出癥狀前基因診斷，也可對有遺傳病風險的胎兒作出生前基因診斷。此外基因診斷不受基因表達的時空限制，也不受取材的細胞類型和發(fā)病年齡的限制。

12、這一技術(shù)還可以從基因水平了解遺傳病異質(zhì)性，有效地檢出攜帶者。因此近年來這一技術(shù)日新月異地迅速發(fā)展，并已經(jīng)在遺傳病診斷中發(fā)揮了巨大作用。,第六節(jié) 基因診斷,1978年，Kan YW —— 鐮狀細胞貧血,癥狀前診斷 —— 外周靜脈血,產(chǎn) 前 診 斷 —— 孕早期的絨毛細胞,孕中期的羊水胎兒脫落細胞,母親外周血中的胎兒有核紅細胞,植入前診斷 —— 受精卵卵裂細胞,定義： 應用分子生物學方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能變化而作出的或

13、輔助臨床診斷的技術(shù)，稱為基因診斷。,,思路：用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。,基因診斷的原理,核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一。 基本原理是：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進行雜交。 這種結(jié)合是特異的，即嚴格按照堿基互補的原則進行，它不僅能在DNA和DNA之間進行，也

14、能在DNA和RNA之間進行。,進行基因檢測有兩個必要條件：一、是必需的特異的DNA探針；二、是必需的基因組DNA。 當兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時，就能進行分子雜交。,基因探針的定義：,基因探針（probe）就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列。它可以包括整個基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。,1、來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）。2

15、、是從相應的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNA 探針（cDNA probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。3、可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。長約20個bp左右。,探針的來源：,探針的標記：放射性同位素標記（32P、35S）、地辛高、辣根過氧化物酶、生物素。 方法：缺口平移、六核苷酸引物標記法。,基因探針的標記：,一、分子雜交

16、,1. Southern印跡雜交,第六節(jié) 基因診斷,一、分子雜交,1. Southern印跡雜交,第六節(jié) 基因診斷,2. ASO雜交,1、Southern 雜交法,細胞,Southern印跡雜交,,,,,,,,,,,,,,,一、分子雜交,1. Southern印跡雜交,第六節(jié) 基因診斷,2. ASO雜交,二、聚合酶鏈式反應,,聚合酶鏈反應：（polymerase chain reaction,PCR）原理：

17、1）引物的設(shè)計：合成2個與目的DNA序列兩側(cè) 互補的寡核苷酸，一般長約15-25bp。 2）基本條件：引物、DNA前提物質(zhì)、含有一 定離子（Mg）的反應體系 、DNA聚合酶、 模板。 3）三段循環(huán)：變性：93-95；復性：50-70 延伸：70-75。n個周期，2n個DNA,聚合酶鏈反應（polymerase chain r

18、eaction,PCR）,PCR原理,PCR原理,,,１變性,PCR原理,,,１復性,,,PCR原理,,,１延伸,,,,,PCR原理,,,２變性,,,,,PCR原理,,,２復性,,,,,,,,,PCR原理,,,２延伸,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,３變性,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,３復性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,３延伸,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,預變性

19、(93-95?C,2-5m),變性(93-95?C,30s),復性(50-70?C,30s),延伸(75?C,30-60s),總延伸(75?C,7m),,,,,,(25-35),PCR的一般過程：,經(jīng)過30次的循環(huán), 擴增的DNA片段可達100萬倍以上。,直接分析法,MstⅡ： CCTNAGG,鐮狀細胞貧血(HbS)： 第5～7位密碼子,?A： CCTGAGGAG?S： CCTGTGGAG,,,RFLP連鎖分析,

20、,,,,,,Back,,,,,ASO斑點雜交,1986年，胡流清等基于點突變原理，用寡核苷酸探針進行基因診斷。,,Back,基因診斷的臨床檢測應用,基因診斷在腫瘤檢測中的應用：在許多腫瘤中存在的：癌基因 ras、myc等的突變；抗癌基因P53、Rb等的突變、丟失的檢出。 基因診斷在個體識別中的應用：親子鑒定、個體識別、法醫(yī)物證。,產(chǎn)前診斷（prenatal or antenatal diagnosis）又稱宮內(nèi)診斷（intrau

21、terine diagnosis）是對胚胎或胎兒在出生前是否患有某種遺傳病或先天畸形作了準確的診斷?！‘a(chǎn)前診斷的適應癥的選擇原則　　一、是有高風險而危害較大的遺傳病　　二、是目前已有對該病進行產(chǎn)前診斷的手段。,第七節(jié) 產(chǎn)前診斷,第七節(jié) 產(chǎn)前診斷,產(chǎn)前診斷的適應癥:1、染色體?。悍驄D之一有染色體異常、生育過染色體病的 患兒夫婦之一為平衡易位攜帶者、脆性X家

22、 系的孕婦。2、單基因?。禾囟溉毕菟碌倪z傳性代謝病。3、多基因病：NTD4、不明原因的自然流產(chǎn)史、畸胎史、死產(chǎn)、新生兒死亡、羊水過多；35歲以上孕婦、有明顯制畸史的孕婦。5、有明顯形態(tài)改變的先天畸形。,幾種主要產(chǎn)前診斷方法,1、超聲波檢查：是一項簡便對母體無痛無損傷的產(chǎn)前診斷方法。B型超聲波應用最廣，利用超聲波能作出的產(chǎn)前診斷或排除性診斷。此外還可直接對胎心和胎動進行動態(tài)觀察，并可攝象

23、記錄分析，亦可作胎盤定位，選擇羊膜穿刺部位，可引導胎兒鏡操作，采集絨毛和臍帶血標本供實驗室檢查。 范圍：多胎妊娠、羊水過多、NTD、腦積水、多囊腎、肢體短小；18周測性別：XR男性選擇性流產(chǎn)。,第七節(jié) 產(chǎn)前診斷,2、X線檢查 ：主要用于檢查24周以后胎兒骨骼先天畸形。但因X線對胎兒有一定影響，現(xiàn)已極少使用。,3、胎兒鏡 （fetoscope） ：又稱羊膜腔鏡或?qū)m腔鏡，是一種帶有羊膜穿刺的雙套管光導纖維內(nèi)窺鏡。能直接觀察胎兒

24、，可于懷孕15－21周進行操作。由于B超的應用，此方法易引起流產(chǎn)、母體免疫反應，已少用。 范圍： 各種類型的地中海貧血、DMD,4、羊膜穿刺 ：（amniocentesis）亦稱羊水取樣。最佳時間：是妊娠16－18周。范圍：經(jīng)體外培養(yǎng)后，可進行染色體分析、酶和蛋白質(zhì)檢測、性染色質(zhì)檢查、提取DNA作基因分析，也可不經(jīng)培養(yǎng)，用微量技術(shù)作酶和蛋白質(zhì)分析或直接提取DNA作基因診斷。,第七節(jié) 產(chǎn)前診斷,方法：B超、腰穿針穿刺、穿

25、過腹壁和子宮壁進 入羊膜腔。 20-30ml。,應用：1、生活的脫落細胞。-- 染色體分析、酶和蛋白質(zhì)檢 測、性染色質(zhì)檢查、提取DNA作基因分析 2、羊水：AFP、乙酰膽堿脂酶。,1 2 3 4

26、 CHE ACHE1、2正常3、4患者,,,,,,,5．絨毛吸?。航q毛取樣（chorionic villi aspiration sampling,cvs）方法：絨毛可經(jīng)宮頸部取樣，最好在B超監(jiān)視下進行。絨毛枝經(jīng)處理（與蛻膜嚴格分離）或經(jīng)短期培養(yǎng)。,時間：一般于妊娠8--10周時進

27、行。范圍：染色體分析、酶和蛋白質(zhì)檢測和直接抽取DNA進行基因分析。優(yōu)點：時間早。 6．臍帶穿刺術(shù)（cordocentesis）： 經(jīng)母腹抽取胎兒靜脈血，可在B超引導下于孕中期、孕晚期（17-32周）進行。臍血可作染色體或血液學各種檢查，亦可用于因羊水細胞培養(yǎng)失敗，DNA分析無法診斷而能用胎兒血漿或血細胞進行生化檢測的疾病，或在錯過絨毛和羊水取樣時機下進行，在一些情況下，可代替基因分析。,胎兒的表型形態(tài)特征、分析蛋白質(zhì)和酶的