spo0A基因缺失對(duì)克勞氏芽孢桿菌發(fā)酵性能的影響.pdf

1、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）是一株應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)堿性蛋白酶菌株，生產(chǎn)過(guò)程中芽孢的形成對(duì)后期的發(fā)酵和產(chǎn)酶有較大的影響，相對(duì)的增加了成本，降低了收益。利用基因組學(xué)和功能基因組學(xué)技術(shù)，分析芽孢形成過(guò)程中的基因調(diào)控機(jī)制以及構(gòu)建高產(chǎn)芽孢缺失型菌株成為可能，而芽孢的形成過(guò)程是一個(gè)多層次分階段的過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)spo0A、kinA、kinB以及δ因子等基因在芽孢形成過(guò)程中起著重要作用。文對(duì)堿性蛋白酶的基本特性、芽孢形成初始

2、階段的基因調(diào)控機(jī)制以及實(shí)驗(yàn)中采用的基因敲除技術(shù)進(jìn)行了綜合分析；實(shí)驗(yàn)中完成了對(duì)克勞氏芽孢桿菌的菌株特性、敲除了upp基因?qū)崿F(xiàn)了反向篩選標(biāo)記的構(gòu)建、敲除了spo0A基因，分析spo0A基因?qū)藙谑涎挎邨U菌的影響。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴針對(duì)該菌株不同于嗜堿芽孢桿菌的特性，本研究對(duì)克勞氏芽孢桿菌進(jìn)行了16rDNA分析，按照基因組提取試劑盒提取基因組，PCR擴(kuò)增出目標(biāo)片段后送上海生工測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在GeneBank中BLAST比對(duì)，

3、結(jié)果表明該菌株與克勞氏芽孢菌屬重合度達(dá)到100％。同時(shí)對(duì)菌株的菌落形態(tài)、染色形態(tài)、培養(yǎng)條件、產(chǎn)酶、培養(yǎng)條件以及相關(guān)抗性等特性進(jìn)行了分析。⑵根據(jù)克勞氏芽孢桿菌轉(zhuǎn)化效率較低的特點(diǎn)，利用溫敏型質(zhì)粒作為載體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)該質(zhì)粒在改變培養(yǎng)溫度后復(fù)制狀態(tài)轉(zhuǎn)變成自殺質(zhì)粒。在提取克勞氏芽孢桿菌的基因組后利用upp基因的上下游同源臂引物擴(kuò)增兩片段，再利用重疊PCR技術(shù)將上下游同源臂拼接，測(cè)序驗(yàn)證后連接于溫敏型質(zhì)粒pKSV7上，轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)后敲除了upp基因進(jìn)而成

4、功構(gòu)建了upp缺失型菌株，實(shí)現(xiàn)了upp基因的無(wú)痕敲除和upp反向篩選標(biāo)記的構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)中分析了 upp敲除菌株的5-氟尿嘧啶抗性來(lái)驗(yàn)證該菌株是否具有反向篩選功能。⑶以u(píng)pp敲除菌株為宿主菌株，利用upp作為反向篩選標(biāo)記并結(jié)合溫敏型質(zhì)粒pKSU敲除芽孢形成的關(guān)鍵基因spo0A，分析構(gòu)建的Δspo0A菌株產(chǎn)酶及其他的相關(guān)特性。其中，構(gòu)建upp的缺失菌株作為敲除實(shí)驗(yàn)的初始菌株，質(zhì)粒pKSU用來(lái)在42℃中獲得單交換菌株，5-氟尿嘧啶用來(lái)篩選雙交換