堿性蛋白酶和亞硫酸鈉水解菜籽粕制取菜籽多肽的研究

1、1堿性蛋白酶和亞硫酸鈉水解菜籽粕制取菜籽多肽的研究嚴梅榮摘要本文研究堿性蛋白酶Alcalase直接水解菜籽粕制取菜籽多肽，試驗反應時添加亞硫酸鈉的影響及使用膜分離技術去除產(chǎn)物中的硫代葡萄糖苷。結果表明，Na2SO3通過對蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵的斷裂作用及對堿性蛋白酶抑制劑的影響，可提高堿性蛋白酶的活性，使得到的菜籽多肽的分子質(zhì)量分布發(fā)生變化，小分子的多肽比例相應增加。結果同時顯示，膜分離可有效減少或除去硫代葡萄糖苷等抗營養(yǎng)因子，使用截留分

2、子質(zhì)量3000u的膜對菜籽粕酶解產(chǎn)物進行超濾和透析過濾，當超濾濃縮因子和透析過濾體積倍數(shù)均為2時，產(chǎn)物的硫代葡萄糖苷含量從1.36mgg降低到0.39mgg。關鍵詞關鍵詞菜籽亞硫酸鈉蛋白質(zhì)水解水解度中圖分類號：中圖分類號：TS201.2TS201.2文獻標識碼：文獻標識碼：A文章編號：文章編號：1003017410030174（）隨著世界人口增長和食物來源減少促使人們研究開發(fā)新的植物蛋白資源，其中對于油籽食用蛋白的開發(fā)已引起人們越來越大

3、的興趣。菜籽是重要油料作物，世界年產(chǎn)量已超過4000萬噸，中國、印度和加拿大是主要生產(chǎn)國。菜籽提油后的粕中含有40－50％的蛋白，且菜籽蛋白氨基酸組成平衡，符合FAO要求，因此菜籽粕可能成為食用蛋白的合適來源[12]。由于菜籽粕中還存在硫代葡萄糖苷，植酸和多酚類等有毒和抗營養(yǎng)因子，因此目前主要還是當作飼料或肥料使用，只有盡量降低或除去這些有毒和抗營養(yǎng)物質(zhì)，才有可能使菜籽粕作為食用蛋白來源。近年來，蛋白水解物被認為是生物活性肽的來源，它們

4、易于被大腸細胞吸收進入血液，產(chǎn)生有益的生物活性。已報道的生物活性肽具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗血栓形成和降血壓等生理功能，它們在食品、藥物和化妝品工業(yè)上的應用已引起人們廣泛的興趣。由于消費者對于動物蛋白的擔憂日益增加，因而更偏愛開發(fā)植物多肽。酶水解蛋白是目前制取植物多肽的最重要手段，通過水解可以得到分子質(zhì)量大小不同的肽。傳統(tǒng)的制取多肽方法是先通過堿提取酸沉淀法制取分離蛋白，再使用不同的蛋白酶將分離蛋白水解制取肽。由于菜籽蛋白成分復雜，難溶于水

5、，通常需要使用pH11以上的強堿提取，加之菜籽蛋白等電點范圍廣，提取后加酸調(diào)節(jié)等電點析出的分離蛋白得率較低。本文研究使用堿性蛋白酶Alcalase直接水解菜籽粕制取肽，利用膜分離除去硫苷等有毒物質(zhì)，同時研究水解時加入低濃度亞硫酸鈉對于反應速率的影響。1材料與方法材料與方法1.11.1材料材料加拿大菜籽：張家港出入境檢驗檢疫局提供；堿性蛋白酶Alcalase2.4L（活力2.4AUg）：諾維信公司；芥子酶(100unitsg)：Sigma

6、公司。1.21.2試劑及儀器試劑及儀器1.2.11.2.1試劑試劑石油醚（30～60℃），氫氧化鈉，鹽酸，磷酸，檸檬酸，二氯甲烷，氨水，亞硫酸鈉等：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。1.2.21.2.2儀器儀器3行噴霧干燥，得到的水解物作為不加亞硫酸鈉的菜籽蛋白酶水解對照物P2。1.3.61.3.6菜籽蛋白水解液的膜分離菜籽蛋白水解液的膜分離上述酶水解時留存的部分水解液使用截留分子質(zhì)量為3000u的膜進行超濾，以除去亞硫酸鈉、無

7、機鹽和硫苷等有毒和抗營養(yǎng)物質(zhì)。膜面積為0.1M2，超濾液的溫度為400C，超濾濃縮因子為2，超濾后再進行透析過濾(diafiltration)，透析過濾體積倍數(shù)為2。最后將膜上溶液進行噴霧干燥，得到經(jīng)超濾的蛋白水解物PF1。1.3.71.3.7水解度的測定方法水解度的測定方法蛋白質(zhì)的水解度（DH）是指蛋白質(zhì)中的肽鍵被水解的百分數(shù)，其計算公式為：DH%=(hhtot)100式中h是每克蛋白中被水解的肽鍵的毫摩爾數(shù)，htot則是指每克原料蛋

8、白中肽鍵的毫摩爾數(shù)。本實驗采用pHstat法測定水解過程中的水解度（DH）[4]，即根據(jù)水解過程中為保持反應液pH值不變而加入的NaOH的量按下式計算水解度：式中B為保持pH不變而加入的NaOH體積（mL），Nb為NaOH的濃度，Mp為蛋白質(zhì)的量（g），α為水解時αNH2的平均離解度。1.3.81.3.8凝膠層析測定菜籽肽的凝膠層析測定菜籽肽的分子質(zhì)量分子質(zhì)量分布分布菜籽肽的分子質(zhì)量分布采用凝膠層析法測定，所用的凝膠柱為Superose

9、1210300GL(10300mmGEHealthcareBioScienceCo.PiscatawayNJUSA)使用紫外檢測器于215nm檢測。洗脫液為pH等于7的0.15molLNaCl的50mmolL磷酸鹽緩沖液樣品液先經(jīng)0.45μM膜過濾，進樣量為500μL洗脫液流速為0.8mlmin。取牛血清蛋白（67000u）、細胞色素（12700u）、VB12(1355u)和氧化型谷胱甘肽（612u）為分子質(zhì)量標準。2結果與討論結果與討

10、論2.12.1膜分離清除菜籽水解物中的硫膜分離清除菜籽水解物中的硫苷加拿大菜籽粕的主要組分見表1，其蛋白質(zhì)含量較高，值得進一步開發(fā)利用。表1加拿大菜籽粕的主要組分的含量％含水率含油率蛋白質(zhì)含量灰分含量9.205.6445.046.78加拿大菜籽粕的硫代葡萄糖苷含量見表2。硫苷是菜籽粕中影響最大的有害物質(zhì)，在芥子酶作用下水解可生成異硫氰酸酯和惡唑烷硫酮等有毒物質(zhì)[5]，這些有毒物質(zhì)的存在使菜籽粕即使用作飼料也受到限制，只有盡量降低或除去硫

11、苷才能有效利用菜籽粕及其蛋白。表2顯示經(jīng)過Alcalase水解得到的水解物中的硫苷含量大于菜籽粕，說明硫苷易溶于水，在酶水解時被提取到水解液中，使得菜籽蛋白水解物P1中的硫苷含量增加。硫苷的增加將嚴重影響蛋白水解物的應用。表2同時顯示了膜分離對于硫苷的去除作用。雖然本實驗膜分離的超濾濃縮因子和透析過濾體積倍數(shù)都不大，但去除硫苷的效果還是明顯的，膜分離后硫苷的含量降到未經(jīng)膜分離處理的28.7%。如果提高超濾濃縮因子和透析過濾體積倍數(shù)，DH