ⅱ型膠原酶加壓灌流提高成年大鼠心肌細胞分離效率

1、1Ⅱ型膠原酶加壓灌流提高成年大鼠心肌細胞分離效率型膠原酶加壓灌流提高成年大鼠心肌細胞分離效率李德，唐兵，楊大春，楊永健成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科（成都610083）摘要：目的摘要：目的探討效率更高的成熟心肌細胞分離方法。方法方法采用Ⅱ型膠原酶升主動脈逆行灌流法分離成年大鼠心肌細胞。對照組采用Langendff裝置灌流；實驗組在Langendff裝置基礎上加壓勻速灌流。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并計算桿狀細胞比率及產(chǎn)量；通過臺盼藍染色和局部場

2、剌激評價心肌細胞活性。結(jié)果結(jié)果分離即刻，實驗組桿狀細胞比率顯著高于對照組（90.34.4%νs53.45.2%，p0.01）；實驗組活細胞產(chǎn)量也顯著高于對照組[（3.60.7）107νs（1.90.6）107，p0.01]。復鈣過程中，實驗組發(fā)生自發(fā)性收縮的細胞比率及變圓細胞比率均明顯低于對照組（10.42.1%νs18.94.5%，p0.01；5.31.3%νs8.61.7%，p0.05）。實驗組臺盼藍染色陰性的桿狀細胞比率和局部場剌

3、激條件下收縮細胞比率明顯高于對照組（95.38.2%νs90.69.8%，p0.05；92.27.6%νs856.4%，p0.01）。結(jié)論結(jié)論Ⅱ型膠原酶加壓灌流可獲得高產(chǎn)量、高活性的心肌細胞，提高了成熟心肌細胞的分離效率。關鍵詞：關鍵詞：大鼠；心肌細胞；細胞分離PressurizingperfusionwithcollagenasetypeⅡimprovetheisolationefficacyofadultratcardiomyocy

4、tesLIDeTANGBingYANGDachunYANGYongjian(DepartmentofCardiologyChengduMilitaryGeneralHospitalChengdu610083China.)Abstract:ObjectiveToinvestigateameeffectivemethodofisolationofadultratcardiomyocytes.MethodsCardiacmyocytesfro

5、mSDratswereisolatedbycollagenasetypeⅡperfusionincontrolgroupbypressurizingperfusioninexperimentalgroup.Thecardiomyocytesweremphologicallyobservedwithopticalmicroscopeevaluatedbytrypanbluedyingfieldstimulation.ResultsTher

6、atioofrodshapedcellsyieldofviablecellsperratweresignificantlyhigherinexperimentalgroupthanincontrolgroup[90.34.4%νs53.45.2%，p0.01（3.60.7）107νs（1.90.6）107，p0.01].DuringrecalcificationTheincidenceofspontaneouscontractionde

7、fmationweresignificantlylowerinexperimentalgroupthanincontrolgroup（10.42.1%νs18.94.5%，p0.01；5.31.3%νs8.61.7%，p0.05）.Theratiooftrypanbluedyingnegativecellscellswithcontractileunderfieldstimulationweresignificantlyhigherin

8、experimentalgroupthanincontrolgroupalso（95.38.2%νs90.69.8%，p0.05；92.27.6%νs856.4%，p0.01）.ConclusionAdultratcardiomyocytescanbeisolatedmeefficientlybycollagenasetypeⅡpressurizingperfusion.Keywds:ratcardiomyocytescellsepar

9、ation心肌細胞已成為研究心肌結(jié)構(gòu)、代謝、功能、病理生理、發(fā)病其機制及心肌疾病治療的重要工具。分離和培養(yǎng)胚胎期或新生期動物心肌細胞（未成熟心肌細胞）的實驗方法較為成熟，而成年動物心肌細胞（成熟心肌細胞）的分離和培養(yǎng)較為困難。未成熟心肌細胞無論在功能還是在結(jié)構(gòu)等方面與成熟的心肌細胞相比均存在差異，因此，來自于未成熟心肌細胞實驗的結(jié)論難于推論于成熟心肌細胞，應用成熟心肌細胞進行心臟疾病發(fā)病機制和治療研究成為心血管病領域的重要課題[1]。但

10、由于成熟心肌細胞分離和培養(yǎng)較困難，技術31.5心肌細胞梯度復鈣加入0.18mMCaCl2臺氏液10ml重懸細胞，靜置10分鐘，細胞自然沉降；吸除上清5ml，再加入1.8mMCaCl2臺氏液5ml重懸細胞，靜置10分鐘，細胞自然沉降，去上清；加入1.8mMCaCl2臺氏液10ml重懸細胞，靜置10分鐘，細胞自然沉降。1.6心肌細胞產(chǎn)量及活性檢測①在倒置顯微鏡下用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，計算每個心臟細胞產(chǎn)量。細胞數(shù)毫升原液=（4個大格細胞數(shù)

11、之和4)104稀釋倍數(shù)。②臺盼藍染色：用0.4%臺盼藍染色，臺盼藍拒染的細胞為活的心肌細胞，計算臺盼藍染色陰性的桿狀（包括矩形）細胞占總桿狀細胞數(shù)的百分比。③場剌激觀察收縮細胞比率：將心肌細胞加入檢測皿，給予局部場刺激（頻率1Hz，電壓15V，脈寬2ms），在倒置顯微鏡下計算收縮細胞比率。1.7統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以xs表示，組間比較用t檢驗。2結(jié)果結(jié)果2.1心肌細胞的形態(tài)及產(chǎn)量在倒置顯微鏡下觀察，分離即刻的心肌細胞主要有4種形態(tài)：呈桿狀、矩