降血糖藥物篩選方法

1、降血糖藥物篩選方法,2010年11月5日,導論動物水平篩選細胞水平篩選酶和受體水平篩選總結(jié)和思考,糖尿?。―M, Diabetes Mellitus）,糖尿病為一種多病因的代謝疾病，特點是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。指標：餐后2 h 血糖高于11.1 mmol/ L空腹血糖高于7.0 mmol/ L,發(fā)病率,全球糖尿病患者人數(shù)已超過1.77億，預計到2025年將達到3.7億

2、，成為繼心血管和腫瘤之后第三位“健康殺手” （WHO）。中國糖尿病發(fā)病率達5%，全國糖尿病患者人數(shù)已在3000萬以上，糖尿病患者的人數(shù)僅次于印度居世界第二位。,世界糖尿病日,紀念胰島素的發(fā)現(xiàn)者班廷的誕辰，世界衛(wèi)生組織（WHO）和國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）將班廷醫(yī)生的生日11月14日定為世界糖尿病日（WDD）。,班廷，Banting，加拿大生理學家（1891-1941）,控制糖尿病，刻不容緩！（Let's tak

3、e control of diabetes. Now！）,糖尿病的事實,全球每30秒就有一人因糖尿病而截肢。 每年死于糖尿病的人遠遠高于死于艾滋病的人。2005年，全球約290萬人死于糖尿病。 每年患糖尿病的人數(shù)增加700萬，而且多數(shù)集中在亞洲。 每10秒中，就有人死于糖尿病相關(guān)性疾病；同時，就有2例新病例被診斷． 在發(fā)達國家，糖尿病是成年人失明和視力障礙的主要原因。 2型糖尿病占糖尿

4、病患者的90％以上。 肥胖是2型糖尿病的主要危險因素。,并發(fā)癥,糖尿病可導致失明、心腦血管疾病、腎功能衰竭、神經(jīng)病變、肢體壞疽以致截肢、昏迷等多種并發(fā)癥。,治療藥物,磺脲類： 格列本脲（優(yōu)降糖）格列齊特（達美康） 格列吡嗪（美吡達）格列喹酮（糖適平

5、 格列美脲（亞莫利）雙胍類： 　　　　　　苯乙雙胍（降糖靈）二甲雙胍（美迪康） α糖苷酶抑制劑： 　　　　　　阿卡波糖（拜糖平）伏格列波糖（倍欣） 胰島素增敏劑：羅格列酮（文迪雅） 胰島素：　　　諾和靈、優(yōu)泌林,二、動物水平篩選,2.1 I型糖尿病動物模型 造模方法： 采用化學試劑破壞胰島細胞造模或因為遺傳因素，胰島細胞受到自身免疫性破壞而產(chǎn)生的。 1）化學試劑誘

6、導的高血糖動物模型 鏈脲霉素（四氧嘧啶）誘導的高血糖動物模型,鏈脲霉素誘導的高血壓動物模型,原理： 含亞硝基的化合物 特異性破壞胰島β細胞 誘導NO大量合成 激活自身免疫過程 STZ量決定細胞損傷程度： 凋亡（低劑量） 高劑量（壞死）,鏈脲霉素結(jié)構(gòu),,方法：一次性大劑量靜脈或腹腔注射STZ 大鼠（60-80 mg

7、/kg） 小鼠（100-200 mg/kg）注意： STZ水溶液不穩(wěn)定，生物半衰期5 min，造 模時新鮮配置、快速注射。結(jié)果：注射72 小時后，血糖穩(wěn)定升高，動物出現(xiàn) 三多癥狀（多食、多飲、多尿）。 優(yōu)缺點：造?？焖?、模型穩(wěn)定、組織毒性??；但 價格昂貴,2）自發(fā)性糖尿病大鼠（

8、BB大鼠）,渥太華Biobreeding實驗室培育出來的自發(fā)遺傳I 型糖尿病大鼠。發(fā)病機制：自身免疫性破壞胰腺β細胞引發(fā)胰腺炎發(fā)病特征：于出生后60日發(fā)病，體重減輕，糖尿， 低胰島素，胰腺炎、胰島細胞減少， 須胰島素治療才能生存。,2.2 II型糖尿病動物模型,II 型糖尿病動物模型的病理生理改變 胰島素抵抗增加

9、 基礎(chǔ)肝糖輸出率增加，空腹高血糖 胰島細胞功能減退　　　 胰島素抵抗的出現(xiàn)，為維持血糖穩(wěn)定，胰島細胞分泌胰島素代償性增加，最終導致細胞分泌功能障礙，發(fā)展為糖尿病。,1）高糖高脂飲食誘發(fā)II型糖尿病動物模型,方法： 采用占熱量61%高脂飲食（飽和脂肪酸的動物脂肪，蛋白質(zhì)19%，碳水化合物20%，脂肪61%），飼養(yǎng)3-6周。指標： 血糖升高，胰島素水平升高，出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗。優(yōu)缺點：

10、 模擬人類高糖高脂膳食誘發(fā)糖尿病模型； 但造模時間較長，成本高，不穩(wěn)定。,2）自發(fā)性糖尿病大鼠（PO大鼠）,PO大鼠又稱嗜沙肥鼠發(fā)病特征： 出生兩周后，90%PO大鼠出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗癥狀。發(fā)病階段： 起始階段，血清及胰島素水平正常 胰島素水平升高，血糖正常 高胰島素水平，高血糖水平 胰島細胞受損，導致低胰島素和高血糖,3）肥胖高血糖小鼠（ob/ob小鼠

11、）,發(fā)病特征：體型極胖，早期有高血糖和糖尿，血清胰島素水平高，有明顯的胰島素抗性。胰島肥大增生，胰島素含量增加。用途：胰島素增敏劑的研究,4）糖尿病小鼠（db/db小鼠）,發(fā)病特征：體型極胖，脂肪沉淀，早期有高血糖和糖尿，高胰島素血癥，晚期可見胰島細胞壞死。,2.3 降糖藥物體內(nèi)藥效評價方法,利用糖尿病動物模型評價藥效，主要以空腹血糖、糖耐量及胰島素敏感性為指標。a）空腹血糖測定 取材：動物禁食過夜，次日眼眶采血，測

12、 定血糖濃度。 方法：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法以及 血糖儀。,葡萄糖氧化酶法（國內(nèi)推薦方法）,葡萄糖,+ O2,葡萄糖氧化酶,,葡萄糖酸,+ H2O2,H2O2,+ 4-氨基安替吡啉,+ 酚,,過氧化物酶,醌亞胺,+ H2O,醌亞胺在480-550 nm有最大吸收峰，醌亞胺與葡萄糖的量成正比，比色法測定醌亞胺的量，即可得到葡萄糖濃度。,原理：,方法：,葡萄糖氧化酶

13、過氧化物酶磷酸緩沖液酚4-氨基安替吡啉,,,孵育15 min,505 nm測定吸光度OD,結(jié)果：局限：還原性物質(zhì)如尿酸、維 C 、膽紅素等，可 與色原性物質(zhì)競爭過氧化氫，從而消耗反 應過程中所產(chǎn)生的過氧化氫，使測定結(jié)果偏低 舉例：,葡萄糖濃度 =,A樣品-A空白,,A標準-A空白,X 標準濃度（mM）,血糖儀,方法：

14、 手指采集1 ul血樣，將試紙頂端輕靠血樣，試紙就可以自動吸收血樣，插入血糖儀，只需5秒快速顯示測試結(jié)果特點： 方便、快速、簡單，主要用于糖 尿病患者日常監(jiān)控血糖，但準確 度稍差。,b）糖耐量試驗,口服糖耐量試驗： 糖尿病診斷主要指標，也是降糖藥物藥效評價的主要指標。原理：口服葡萄糖后，血糖迅速上升，刺激胰島素分泌，肝糖元合成增加，血糖持續(xù)下降。正常人服用葡萄糖30-60 min，

15、血糖達到最高峰，之后迅速下降，在2 h左右，血糖降至正常。糖尿病時，耐糖功能下降，服糖后血糖峰值超過正常，且2 h不能下降到正常 。,方法： 實驗前動物過夜禁食，灌胃給葡萄糖或蔗糖（2.5g/kg），或淀粉（3-5g/kg）。測定給糖后0 h，0.5 h，1 h，2 h血漿血糖濃度，并繪制血糖變化曲線。結(jié)果：,哪一個樣本是糖尿病鼠？哪個是降糖藥治療后樣本？,c) 胰島素釋放試驗,目的：檢查胰島功能和胰島素分泌水平原

16、理：I型糖尿病，空腹胰島素水平很低； II型糖尿病，空腹胰島素水平正?；蚱撸?葡萄糖刺激后，胰島素分泌增加； 部分藥物可促進胰島素分泌，提高胰島素水平方法：灌胃給葡萄糖或蔗糖（2.5 g/kg），或淀粉 （3-5 g/kg）.測定給糖后0 h，0.5 h，1 h，2h

17、 血漿胰島素濃度，并繪制胰島素變化曲線。,胰島素測定方法（ELISA）：原理：預先包被胰島素抗體在ELISA 板上，加入樣品后，樣品 中的胰島素與包被抗體結(jié)合，再加入生物素標記的抗胰 島素單克隆抗體，結(jié)合已俘獲胰島素的另一端，最后加 入過氧化酶標記的抗生物素，生物素與抗生物素結(jié)合。 通過過氧

18、化物酶底物顯色來定量測定樣品中的胰島素。,方法：胰島素測定試劑盒（wako）組成：抗胰島素包被板；胰島素標準溶液；生物素標記的抗胰島素抗體；HRP 標記的鏈酶親和素；顯色底物；終止液；洗滌液 試驗操作：參見試劑盒說明 結(jié)果：,胰島素標準曲線,圖１ 哪個樣品為正常，I型或 II型病人？圖２ 哪個為治療前或治療后？圖３ 哪個為治療前或治療后？,圖１,圖２,圖３,d) 葡糖鉗技術(shù)(glucose clamp tec

19、hnique),葡糖鉗技術(shù)是美國耶魯大學醫(yī)學院于1979年創(chuàng)立的一種臨床測定胰島素分泌或胰島素敏感性的定量技術(shù)。 正糖鉗：對胰島素的敏感性的定量分析，是國際上公認的評估胰島素敏感性和β細胞功能的“金標準” 。正糖鉗技術(shù)原理： 靜脈注射胰島素使其維持高水平； 同時靜脈注射葡萄糖使血糖維持在基礎(chǔ)血糖水平上。高胰島素水平代謝葡萄糖，為維持血糖需不斷注射葡萄糖，當葡萄糖注射速率平衡時，此時的速率相當于體內(nèi)代謝葡萄糖

20、的速率。1983發(fā)展大鼠正糖鉗試驗。,Dr. Jim Liebau,方法：大鼠麻醉頸靜脈插管接三通管，兩個進口端一側(cè)輸入10%葡萄糖，一側(cè)輸入胰島素，出口端接靜脈插管手術(shù)完畢，輸入4 mU/kg/min胰島素，同時輸入10%葡萄糖 每隔10 min測定血糖血糖輸入速率至穩(wěn)態(tài)后，記錄連續(xù)60 min葡萄糖輸注速率 穩(wěn)態(tài)下6次葡萄糖輸注速率平均值為GIR， 6次血糖平均值為BG,結(jié)果：,穩(wěn)態(tài)葡萄糖注射速率GIR值

21、 11.56 mg/kg/min 血糖平均值BG 值4.13 mM,哪個樣品胰島素敏感度高？哪個樣品是來自藥物治療后大鼠？,三、細胞水平降糖藥物篩選,脂肪細胞（肝細胞）-葡萄糖消耗 葡萄糖轉(zhuǎn)運試驗,,1. 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗實驗,脂肪細胞,,11mM葡萄糖含藥培養(yǎng)液,培養(yǎng)24或48 h,檢測培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量

22、,,,葡萄糖氧化酶法,計算葡萄糖消耗量,陽性藥物可選擇二甲雙胍,糖消耗量(mM)=11mM-培養(yǎng)基葡萄糖濃度(mM),2. 3T3-L1脂肪細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運實驗,,脂肪細胞,,加藥培養(yǎng)24h,,0.5 uCi/ml2-deoxy-[H ]-D-glucose,3,孵育10min,加NaOH裂解細胞,細胞裂解液,,KRP緩沖液清洗3次,,[H ]含量,同位素測定儀,,KRP緩沖液組成：131.2 mM NaCl，4.7

23、mMKCl，2.47 mM CaCl2， 1.24 mM MgSO4, 2.48 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES,3,b-細胞損傷模型H2O2鏈脲霉素四氧嘧啶 b-細胞胰島素分泌模型 b-細胞ATP敏感鉀通道阻斷劑,,四、分子水平降糖藥物篩選,4.1 a-糖苷酶

24、抑制劑篩選原理： 飲食中淀粉和蔗糖(雙糖)不能直接被腸壁細胞吸收，需要在小腸絨毛上的多種α-葡糖苷酶的作用下生成單糖(葡萄糖及果糖)后才能被吸收。 α-糖苷酶上具有與寡糖及雙糖相結(jié)合的位點，藥物與這個位點結(jié)合，能可逆性地抑制小腸絨毛上的多種α-葡糖苷酶的活性。,α-糖苷酶有多種，包括：蔗糖酶；葡萄糖淀粉酶；麥芽糖酶；糊精酶。,阿卡波糖,,阿卡波糖與α-蔗糖酶結(jié)合位點,方法：,p-NPG(底物)磷酸緩沖液0.2U/m

25、l a-糖苷酶一定濃度藥物,,,保溫 30 min,,Na2CO3終止反應,405 nm測定釋放p-NP量,p-NPG為對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（無色）p-NP為對硝基苯酚（黃色）,4.2 蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1B (PTP-1B)抑制劑篩選,原理： 蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)是胰島素信號轉(zhuǎn)導通路的負調(diào)節(jié)因子，與II型糖尿病密切相關(guān)。 PTP-1B過度表達將會使胰島素受體去磷酸化，無法與

26、胰島素結(jié)合，引起胰島素抵抗。,,方法：結(jié)果：,p-NPP液PTP-1B酶液一定濃度藥物,,,37 度孵育0 min,405 nm處測定吸光度OD值,PTP-1B活性=,（給藥組OD10min-給藥組OD0min),（對照組OD10min-對照組OD0min),,x100%,37 度孵育10 min,p-NPP為對硝基苯磷酸酯(無色)；p-NP為對硝基苯酚(黃色),總　結(jié),一、動物水平篩選 模型

27、： I型（鏈霉素誘導高血糖動物模型） II型（高脂飲食、PO大鼠） 藥效評價： 血糖測定（葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、血糖儀） 糖耐量試驗； 胰島素釋放試驗； 胰島素敏感性試驗(葡糖鉗技術(shù)),,二、細胞水平篩選 葡萄糖消耗、轉(zhuǎn)運試驗三、酶和受體水平篩選