抗體工程制藥

1、抗體工程制藥,,2,抗體工程藥物的概念,又稱(chēng)抗體藥物、單克隆抗體治療劑、抗體治療劑。 通過(guò)細(xì)胞工程或基因工程方法制備，用于治療的單克隆抗體、抗體片段、基因工程改造的抗體，以及抗體免疫偶聯(lián)物或抗體融合蛋白,稱(chēng)為抗體工程藥物。,3,美國(guó)FDA已批準(zhǔn)的治療抗體藥物,OrthocloneReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath

2、-1HZevalin,移植排斥心絞痛B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥嬰兒呼吸道合胞病毒類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎乳腺癌急性復(fù)發(fā)性髓性白血病難治性慢性淋巴細(xì)胞白血病難治性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤,19861994199719971998199819981998200020012002,4,抗體藥物的重要地位,,。,惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人們的生命健康，是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的重要因素。全球每年有700萬(wàn)人死于腫瘤，且逐年增長(zhǎng)

3、。 傳統(tǒng)的腫瘤臨床治療有三種：手術(shù)、放療和化療。近幾年里，以單克隆抗體為基礎(chǔ)的抗腫瘤導(dǎo)向治療藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域發(fā)生了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。單克隆抗體藥物能特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞，能有效提高藥物殺傷力、減少毒副作用。 1997年以來(lái)，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)10種單克隆抗體藥物，占有市場(chǎng)所有生物技術(shù)藥品的四分之一。一年的綜合銷(xiāo)售超過(guò)10億美金。,5,,隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體在疾病治療方面的作用越來(lái)越受到人們的重視。在同種異體免疫排斥、自身免疫反應(yīng)

4、抑制、抗血小板治療、癌癥治療、感染性疾病治療等方面應(yīng)用最為廣泛。目前全球從事人源化單克隆抗體開(kāi)發(fā)的企業(yè)260家左右，研究中的產(chǎn)品達(dá)700多個(gè)，其中進(jìn)入臨床階段的約100個(gè)，估計(jì)占研制中的生物技術(shù)藥物的25%。據(jù)美國(guó)制藥工業(yè)協(xié)會(huì)的調(diào)查報(bào)告顯示，單克隆抗體藥物居所有醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品之首。,6,,2000年底，在美國(guó)藥品市場(chǎng)上生物技術(shù)藥物有76種，其中抗體藥物有15種；正處于臨床研究階段的369種生物技術(shù)藥物中，抗體藥物有70種。 中國(guó)已

5、有2個(gè)治療性單抗產(chǎn)品獲準(zhǔn)生產(chǎn)，3個(gè)治療性產(chǎn)品處在臨床試驗(yàn)階段，多個(gè)抗體藥物處于臨床前研究階段，已批準(zhǔn)的診斷性單抗有31個(gè)。,7,抗體分子的應(yīng)用,抗體分子是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用途最為廣泛的蛋白分子。以腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)性抗原、抗體獨(dú)特型決定簇、細(xì)胞因子及其受體、激素及一些癌基因產(chǎn)物等均作為靶分子，利用傳統(tǒng)的免疫方法或通過(guò)細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)制備的多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體廣泛應(yīng)用在疾病診斷、治療及科學(xué)研究等領(lǐng)域。完整

6、鼠源抗體容易引起機(jī)體排異反應(yīng)，而基因工程抗體由于分子量小，通過(guò)改造可以降低鼠源性，所以是生物技術(shù)制藥領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。,8,,目前正在進(jìn)行開(kāi)發(fā)和已經(jīng)投入市場(chǎng)的抗體性藥物主要有以下幾種用途：1．器官移植排斥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)；2．腫瘤免疫診斷；3．腫瘤免疫顯像；4．腫瘤導(dǎo)向治療；5．哮喘、牛皮癬、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、急性心梗、膿毒癥、多發(fā)性硬化癥及其他自身免疫性疾?。?．抗獨(dú)特型抗體作為分子瘤苗治療腫瘤；7．多功能抗體（雙

7、特異抗體、三特異抗體、抗體細(xì)胞因子融合蛋白、抗體酶等）的特殊用途。,9,,根據(jù)美國(guó)藥物研究和生產(chǎn)者協(xié)會(huì)（ P hRMA）的調(diào)查報(bào)告，癌癥是威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一，預(yù)防和治療癌癥是研究和開(kāi)發(fā)抗體藥物的主要目標(biāo)之一。最初抗體主要被用于腫瘤體外免疫診斷和體內(nèi)免疫顯像，隨著抗體工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，近年來(lái)人們將更多的目光集中在治療腫瘤的抗體藥物開(kāi)發(fā)上。第一個(gè)被美國(guó)批準(zhǔn)用于人腫瘤治療的基因工程抗體－Rituxan（r）最初被用于非何杰金氏淋

8、巴瘤，總有效率達(dá)60％，現(xiàn)在正在探索用于治療艾滋病相關(guān)淋巴瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤。,10,,目前在臨床中使用的腫瘤治療藥物多數(shù)存在“敵我不分”的問(wèn)題，即在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也破壞了人體正常細(xì)胞?！吧飳?dǎo)彈”為解決這個(gè)難題提供了一個(gè)理想的思路。“生物導(dǎo)彈”，即將各種毒素、放射性同位素、化療藥物與識(shí)別腫瘤特異抗原或偶聯(lián)腫瘤相關(guān)的抗原后，能夠特異殺傷腫瘤細(xì)胞的一類(lèi)藥物。這種藥物經(jīng)由靜脈注入人體內(nèi)，藥效分子集中作用于腫瘤細(xì)胞，既增強(qiáng)療效又

9、減少對(duì)機(jī)體的毒副作用。放射性同位素與抗體的偶聯(lián)物在體內(nèi)能將前者運(yùn)至藥靶部位，并通過(guò)其放射性活性殺傷靶細(xì)胞，還可通過(guò) X射線(xiàn)照相機(jī)拍攝核素放射線(xiàn)圖像，用于體內(nèi)治療和定位診斷。,11,,抗體與化療藥物分子的偶聯(lián)方法一般采用化學(xué)法。 這些偶聯(lián)物對(duì)結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、腎癌、卵巢癌、宮頸癌、乳癌、肺癌、骨肉瘤等有一定的抗癌效應(yīng)?？贵w與生物毒素交聯(lián)制備的偶聯(lián)物稱(chēng)為免疫毒素。免疫毒素抗體部分對(duì)相應(yīng)抗原有特異識(shí)別作用，及免疫毒素部分具有

10、對(duì)細(xì)胞毒作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷效應(yīng)，是很有潛力的免疫治療方法。,12,,抗腫瘤血管生成抗體治療腫瘤的研究最近也取得了很大的進(jìn)展。在動(dòng)物模型中用抗血管生成因子、抗體封閉血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子取得了抑制腫瘤生長(zhǎng)作用；抗癌基因產(chǎn)物抗體Herceptin（r）作為生物技術(shù)藥品已經(jīng)在美國(guó)上市，配合化療用于乳腺癌和卵巢癌的治療，并獲得較好療效。,13,,1．單克隆抗體（McAb）抗體作為免疫治療的生物制劑，在臨床應(yīng)用已有一個(gè)世紀(jì)。以前抗體主要來(lái)

11、自于經(jīng)抗原免疫的異種動(dòng)物（如馬）的血清。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，可以大量制備針對(duì)任何抗原決定基的單克隆抗體。,14,,抗T細(xì)胞及其亞類(lèi)的抗CD3、抗CD4、抗CD8單克隆抗體，它們?cè)谝浦才懦饧澳承┳陨砻庖卟〉膽?yīng)用中，已取得了明顯的療效?？垢鞣N細(xì)胞表面分子的單克隆抗體，如抗IL-2受體的單克隆抗體，抗粘附分子的單克隆抗體都有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，在自身免疫病的治療，防止腫瘤轉(zhuǎn)移等方面都有重要的使用潛力。,15,,單克隆抗體的另一重要應(yīng)用是腫

12、瘤診斷及分型。在過(guò)去10多年來(lái)，抗各種人腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體得到了廣泛的研究。針對(duì)各種人腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體都能較特異地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，而基本上不與正常組織起反應(yīng)?？鼓[瘤單克隆抗體在腫瘤的診斷及分型方面是一種有用的工具；但在腫瘤的治療上，由于大多抗腫瘤單克隆抗體不能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，所以單獨(dú)應(yīng)用腫瘤沒(méi)有明顯效果。,16,,2．導(dǎo)向藥物（targeteddrug）利用抗腫瘤單克隆抗體特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，將它作為導(dǎo)向載體與各種

13、殺傷分子，如毒素、抗癌藥物、放射性核素等，進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，可以構(gòu)建成一種對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高度特異的強(qiáng)殺傷活性的雜交分子，稱(chēng)為導(dǎo)向藥物。,17,,抗腫瘤單抗與毒素的交聯(lián)物又稱(chēng)免疫毒素(IT)。用于制備IT的毒素主要有：①植物毒蛋白這類(lèi)毒素主要有篦麻毒素（ricin）、相思子毒素（abrin）以及苦瓜毒素（mormordin）、商陸抗病毒蛋白（PAP）、天花粉蛋白等。它們都可以通過(guò)滅活核糖體，阻斷蛋白質(zhì)合成，殺傷靶細(xì)胞。。,18,,②

14、細(xì)胞毒素主要有白喉外毒素（DT），綠膿桿菌外毒素（PE）等。它們主要通過(guò)抑制延長(zhǎng)因子-2阻斷蛋白質(zhì)合成，殺死靶細(xì)胞。上述這些毒素都具有極強(qiáng)的毒性，1個(gè)分子的篦麻毒素進(jìn)入細(xì)胞，就足以殺死該細(xì)胞,19,,抗腫瘤單克隆抗體與抗癌藥物的交聯(lián)物，又稱(chēng)免疫交聯(lián)物(immunoconjugate)。用以制備這類(lèi)導(dǎo)向藥物的抗癌藥物主要有阿霉素（adriamycin）、氨甲蝶呤（MTX）等。它們主要通過(guò)阻斷DNA合成來(lái)殺死靶細(xì)胞?？拱┧幬餁⒓?xì)胞

15、作用比毒素低得多，增加抗體分子攜帶的藥物分子數(shù)，可以增強(qiáng)其殺傷活性，但常會(huì)導(dǎo)致抗體活性的下降與喪失。這類(lèi)導(dǎo)向藥物的優(yōu)點(diǎn)是分子較小，同時(shí)如有非特異殺傷不會(huì)有嚴(yán)重后果。缺點(diǎn)：殺傷力不高，臨床應(yīng)用前景不被看好。,20,,Ⅰ、放射性免疫交聯(lián)物可用于腫瘤的診斷。 與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的放射性免疫交聯(lián)物放出的γ射線(xiàn)，可以用γ照像機(jī)攝像，獲得清晰的腫瘤顯像。此技術(shù)稱(chēng)為放射免疫顯像。Ⅱ、放射性免疫交聯(lián)物也可用于腫瘤治療。 標(biāo)記了大量高能核素

16、的抗腫瘤單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，可以通過(guò)輻射損傷殺死靶細(xì)胞及其周?chē)哪[瘤細(xì)胞。此技術(shù)又稱(chēng)為放射免疫治療。用于與抗腫瘤單克隆抗體交聯(lián)的放射性核素主要有125Ⅰ、131Ⅰ、111In等。,21,,（四）腫瘤疫苗　　腫瘤疫苗與傳統(tǒng)疫苗在概念上不同，它主要不是用于腫瘤的預(yù)防，而是通過(guò)瘤苗的接種來(lái)刺激機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答來(lái)治療腫瘤。由于人腫瘤相關(guān)抗原的免疫原性很弱，不足以有效地刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答，因此單純用自身或同種腫瘤細(xì)胞作瘤苗治療腫

17、瘤的效果不好。用腫瘤細(xì)胞卡介苗等佐劑聯(lián)合應(yīng)用，能提高免疫應(yīng)答效果，在一些晚期腫瘤患者取得了一定的治療效果。,22,,腫瘤疫苗主要有二類(lèi)：第一類(lèi)對(duì)腫瘤抗原表位性質(zhì)的研究，導(dǎo)致了腫瘤分子疫苗的產(chǎn)生。具有腫瘤抗原決定基的肽疫苗和多糖疫苗已在研制，有的已在臨床試用。第二類(lèi)，確定了抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞是TC細(xì)胞，導(dǎo)致了基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞疫苗的出現(xiàn)。,23,,TC細(xì)胞識(shí)別腫瘤表面的肽抗原（peptide）與MHCⅠ類(lèi)分子的復(fù)合物，必需

18、要有第二信號(hào)才能活化。這個(gè)第二信號(hào)可以由TC細(xì)胞表面的CD28分子與粘附分子B7的結(jié)合來(lái)提供。（B7分子主要存在于活化的B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞表面。）在通常性況下，腫瘤細(xì)胞合成的胞內(nèi)抗原經(jīng)胞內(nèi)降解、處理后，形成的腫瘤肽抗原與MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合復(fù)合物，共表達(dá)于瘤細(xì)胞表面。,24,,大多數(shù)腫瘤細(xì)胞由于沒(méi)有B7分子，因此腫瘤細(xì)胞雖具有肽抗原與MHCⅠ類(lèi)分子的復(fù)合物，但由于不能提供第二信號(hào)，所以不能活化TC細(xì)胞。IL-2、IL-4、IL-6

19、、IFN-γ等基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞本身可以分泌細(xì)胞因子，導(dǎo)致抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，接種了工程化的腫瘤細(xì)胞后，原先已生長(zhǎng)的親本野生型腫瘤細(xì)胞開(kāi)始消退；并且以后再接種野生型的腫瘤細(xì)胞也不再生長(zhǎng)，這說(shuō)明工程化的腫瘤細(xì)胞具有典型的抗腫瘤疫苗效應(yīng)。有意義的是，用放射線(xiàn)將這種工程瘤苗殺傷死后，仍然可以獲得相同的抗腫瘤效果。,25,,免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)的提出　　這一學(xué)說(shuō)是Jerne（1972）根據(jù)現(xiàn)代免疫學(xué)對(duì)抗體分子獨(dú)特型的認(rèn)識(shí)而提出的。

20、這一學(xué)說(shuō)認(rèn)為在抗原刺激發(fā)生之前，機(jī)體處于一種相對(duì)的免疫穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)抗原進(jìn)入機(jī)體后打破了這種平衡，導(dǎo)致了特異抗體分子的產(chǎn)生，當(dāng)達(dá)到一定量時(shí)將引起抗Ig分子獨(dú)特型的免疫應(yīng)答，即抗體的產(chǎn)生。,26,,抗體分子在識(shí)別抗原的同時(shí)，也能被其他抗體分子所識(shí)別。在同一動(dòng)物體內(nèi)一組抗體分子上獨(dú)特型決定簇可被另一組抗獨(dú)特型抗體分子所識(shí)別。而一組淋巴細(xì)胞表面抗原受體分子亦可被另一組淋巴細(xì)胞表面抗獨(dú)特型抗體分子所識(shí)別。這樣在體內(nèi)就形成了淋巴細(xì)胞與抗體分子所組

21、成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)認(rèn)為：這種抗體的產(chǎn)生在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著重要作用。使受抗原刺激增殖的克隆受到抑制，而不至于無(wú)休止地進(jìn)行增殖，藉以維持免疫應(yīng)答的穩(wěn)定平衡。,27,抗體藥物的特異性,特異性與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合對(duì)腫瘤等靶細(xì)胞的選擇性殺傷作用多樣性抗原的多樣性抗體結(jié)構(gòu)的多樣性抗體活性的多樣性免疫偶聯(lián)物的多樣性制備時(shí)的定向性針對(duì)特定的靶分子定向制備抗體藥物根據(jù)需要選擇抗體藥物的“效應(yīng)分子”,28,,單克隆抗體針對(duì)特

22、定的單一抗原表位，具有高度的特異性，這是抗體藥物發(fā)揮治療作用的重要基礎(chǔ)。單克隆抗體技術(shù)由英國(guó)劍橋的科學(xué)家米爾斯坦（Milstein）和科勒（Kohler）于1975年首度研制。單抗作為治療劑的研究經(jīng)歷了比較曲折的發(fā)展過(guò)程，上個(gè)世紀(jì) 80年代迅猛發(fā)展；90年代初期又一度處于低谷；近年再度成為生物技術(shù)藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前，單抗藥物的品種數(shù)量位居前列。,29,,單抗藥物具有下列重要特點(diǎn)：其一，特異性。單抗針對(duì)特定的單一抗原表位，具有

23、高度的特異性，這是單抗藥物發(fā)揮治療作用的重要基礎(chǔ)。對(duì)于抗腫瘤抗體藥物的研究表明，其特異性主要表現(xiàn)為特異性結(jié)合、選擇性殺傷、體內(nèi)靶向性分布以及具有更強(qiáng)的療效。其二，多樣性。主要表現(xiàn)在抗原的多樣性、抗體結(jié)構(gòu)的多樣性，作用機(jī)理的多樣性等方面。,30,,其三，制備單抗藥物的定向性。單抗藥物的重要特點(diǎn)之一是可以定向制造。即根據(jù)需要，可以制備具有不同治療作用的單抗藥物。可以針對(duì)特定的靶分子，定向制備相應(yīng)的抗體；也可以根據(jù)需要選擇相應(yīng)的“效應(yīng)分子

24、”，制備相應(yīng)的免疫偶聯(lián)物或融合蛋白。,31,抗體工程的發(fā)展簡(jiǎn)史,多克隆抗體階段，早在1890年，培林 (von Behring)和北里(Kitasato)，就在實(shí)驗(yàn)室制造出抗白喉?xiàng)U菌外毒素的血清用于治療白喉。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性的單克隆抗體，叫細(xì)胞工程抗體。在80年代初，抗體基因結(jié)構(gòu)和功能的研究成果與重組DNA技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了基因工程抗體技術(shù)，1984年第一個(gè)基因工程抗體人

25、－鼠嵌合抗體誕生。1994年，Winter等人的抗體庫(kù)技術(shù)：噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)；核糖體展示抗體庫(kù)技術(shù)。,32,抗體工程發(fā)展歷程,抗體作為疾病預(yù)防、診斷和治療的制劑已有上百年的發(fā)展歷史。早期制備抗體的方法是將某種天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動(dòng)物，成熟的 B細(xì)胞克隆受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。實(shí)際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱(chēng)之為多克隆抗體。多克隆抗體是人類(lèi)有目的利用抗體第一步。多克隆抗體的不均一性，限制了對(duì)抗體

26、結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。,33,,這種單克隆抗體多是由鼠 B細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞分泌的，具有鼠源性，進(jìn)入人體會(huì)引起機(jī)體的排異反應(yīng)；完整抗體分子的分子量較大，在體內(nèi)穿透血管的能力較差；生產(chǎn)成本太高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。 1975年Kohler和Milstein首次用 B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出均一性的單克隆抗體。雜交瘤單克隆抗體又稱(chēng)細(xì)胞工程抗體。雜交瘤技術(shù)的誕生被認(rèn)為是抗體工程發(fā)展的第一次質(zhì)的飛躍，也

27、是現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的一個(gè)里程碑。,34,基因工程抗體的優(yōu)點(diǎn)：,1．通過(guò)基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)；2．基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；3．根據(jù)治療的需要，制備新型抗體；4．可以采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)方式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。,35,,自從1984年第一個(gè)基因工程抗體人－鼠嵌合抗體誕生以來(lái)，新型基因工程抗體不斷出

28、現(xiàn)。如人源化抗體、單價(jià)小分子抗體（Fab、單鏈抗體、單域抗體、超變區(qū)多肽等）、多價(jià)小分子抗體（雙鏈抗體，三鏈抗體，微型抗體）、某些特殊類(lèi)型抗體（雙特異抗體、抗原化抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、催化抗體、免疫脂質(zhì)體）及抗體融合蛋白（免疫毒素、免疫粘連素）等。用于構(gòu)建基因工程抗體的抗體基因最初來(lái)源于雜交瘤細(xì)胞，因此同樣必須經(jīng)過(guò)動(dòng)物免疫，細(xì)胞融合及克隆篩選這樣一個(gè)長(zhǎng)期、復(fù)雜的工藝流程；仍然不能制備針對(duì)稀有抗原的抗體和人源性抗體，無(wú)法改善抗體的親和力。

29、,36,,這些缺點(diǎn)限制了基因工程抗體更為廣泛的應(yīng)用。噬菌體抗體庫(kù)是應(yīng)用最為普遍的抗體庫(kù)技術(shù)。采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選抗體不必進(jìn)行動(dòng)物免疫，易于制備稀有抗原的抗體、篩選全人源性抗體和高親和力抗體。,37,,噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是生命科學(xué)研究的突破性進(jìn)展之一，同時(shí)也將抗體工程的研究推想了一個(gè)新的高潮。在噬菌體抗體庫(kù)基礎(chǔ)上，近幾年又發(fā)展了核糖體展示抗體庫(kù)技術(shù)。利用核糖體展示技術(shù)篩選抗體的整個(gè)過(guò)程均在體外進(jìn)行，不經(jīng)過(guò)大腸桿菌轉(zhuǎn)化的步驟，因此可

30、以構(gòu)建高容量、高質(zhì)量的抗體庫(kù)，更易于篩選高親和力抗體和采用體外進(jìn)化的方法對(duì)抗體性質(zhì)進(jìn)行改造。核糖體展示抗體庫(kù)技術(shù)代表了抗體工程的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。,抗 體,39,抗體的概念,定義一：抗原誘導(dǎo)由淋巴細(xì)胞合成和分泌的，具有特殊氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子(lg)。定義二：能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。,40,人體中主要的抗體及性質(zhì),,© 2002 by Bruce Alberts, Alexande

31、r Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.,41,抗原,,抗體由抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生，抗原是抗體藥物的靶分子?？贵w所針對(duì)的抗原可包括：半抗原。蛋白如糖蛋白或脂蛋白。多糖如脂多糖。人體疾病相關(guān)基因及其編碼的蛋白。各種病原體如病毒、支原體、細(xì)菌、原蟲(chóng)、寄生蟲(chóng)。,42,抗體的主要作用,,結(jié)合抗原中和毒素促進(jìn)吞噬功能,43,結(jié)合抗原和中和毒素

32、,,© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.,44,促進(jìn)吞噬功能,,45,,自然界中可作為抗原的物質(zhì)數(shù)不勝數(shù)，機(jī)體中可產(chǎn)生大量的抗體來(lái)對(duì)付各種抗原，每個(gè)漿細(xì)胞每秒鐘可分泌2000多個(gè)抗體，免疫蛋白占血漿總蛋白的20％，是血液中豐度最高的蛋白。,46,抗體的結(jié)構(gòu),&

33、#169; 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.,47,,Lg分子是由二硫鍵連接起來(lái)的約4條（2對(duì)）多肽鏈構(gòu)成，長(zhǎng)的一對(duì)稱(chēng)為重鏈H，有450-570個(gè)Aa殘基，短的一對(duì)稱(chēng)為輕鏈L，約有214個(gè)Aa殘基。,48,抗體多樣性-抗體編碼基因較多,Sources from Mole

34、cular Cell Biology   9. Molecular Structure of Genes and Chromosomes   9.4. Functional Rearrangements in Chromosomal DNA,輕鏈L編碼區(qū)由V、J和C區(qū)組成，其中V、J組成可變區(qū),49,抗體多樣性,Sources from Molecular Cell Biology   9. M

35、olecular Structure of Genes and Chromosomes   9.4. Functional Rearrangements in Chromosomal DNA,重鏈H編碼區(qū)由V、D、J和C區(qū)組成，其中V、D、J組成可變區(qū),50,抗體多樣性,Lg分子氨基端L鏈1／2與H鏈的1／4區(qū)段的氨基端組成及排列順序多變，稱(chēng)為可變區(qū)（V區(qū)）。Lg分子氨基端L鏈1／2與H鏈的3／4區(qū)段的氨基端組成及排列比

36、較恒定，稱(chēng)為恒定區(qū)（C區(qū)）。可變區(qū)中互補(bǔ)決定區(qū)CDR 具有很大的變異性，而恒定區(qū)中FR 保守。,51,抗體多樣性,,Sources from Molecular Biology of the Cell   V. Cells in Their Social Context   24. The Adaptive Immune System   B Cells and Antibodies,,恒定

37、區(qū)FR 保守,恒定區(qū),,52,抗體獨(dú)特性,編碼重鏈和輕鏈的基因重排后，進(jìn)行表達(dá)生成細(xì)胞表面受體并能與抗原發(fā)生作用。只有這些B cell表達(dá)的表面Lg與一個(gè)外源抗原結(jié)合后才會(huì)引發(fā)進(jìn)一步的反應(yīng)。在這些識(shí)別過(guò)程中將自身抗原識(shí)別掉排除。識(shí)別外源抗原的B cell被誘導(dǎo)增殖并分泌抗體，在此過(guò)程中，可變的結(jié)構(gòu)域CDR的特定部位被誘導(dǎo)發(fā)生隨機(jī)突變，B cell在反向于那些與抗原有高親和力的突變抗體的分泌。這個(gè)過(guò)程非常高效，使免疫系統(tǒng)具有產(chǎn)生對(duì)抗任

38、何外來(lái)分子抗體的能力?？勺儏^(qū)這種獨(dú)特的裝配方式叫做抗體的獨(dú)特性。,53,抗體多樣性,體細(xì)胞突變，B細(xì)胞分化過(guò)程中點(diǎn)突變可反復(fù)進(jìn)行，使分化中的B細(xì)胞受抗原壓力選擇。體細(xì)胞內(nèi)重組?；蜣D(zhuǎn)換。核苷酸摻入。,,54,,© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter,抗體多樣

39、性－其他機(jī)制,雜交瘤技術(shù)和單克隆抗體,56,單克隆抗體的概念,雜交細(xì)胞：在誘導(dǎo)物的作用下同一細(xì)胞或不同細(xì)胞間的融合，融合的細(xì)胞具有雙親本細(xì)胞的染色體和全部或部分特性。雜交瘤細(xì)胞：B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后產(chǎn)生的雜交細(xì)胞。單克隆抗體：具有分泌抗體能力的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)無(wú)性繁殖形成的細(xì)胞系分泌產(chǎn)生的活性、親和力均相同的抗體。,57,單克隆抗體的特點(diǎn),多克隆抗體的不足：假陽(yáng)性、制備困難、產(chǎn)量低。單抗中抗體分

40、子在A(yíng)a序列和空間構(gòu)型上均相同。單抗具有高度的特異性。產(chǎn)生單抗的細(xì)胞系可長(zhǎng)期傳代并保存，可持續(xù)生產(chǎn)同一性質(zhì)的抗體。,58,制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體,制備抗原凡具有抗原性的物質(zhì)均可免疫時(shí)抗原純度可不高純度高的抗原利于以后篩選,骨髓瘤細(xì)胞常用的骨髓瘤細(xì)胞系小鼠的BALB/c細(xì)胞系大鼠的Lou細(xì)胞系免疫動(dòng)物應(yīng)與骨髓瘤細(xì)胞供體相一致,59,制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體,一般選40-50%的PEG 進(jìn)行誘導(dǎo)。細(xì)胞融合后培養(yǎng)

41、液中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤、脾、瘤等細(xì)胞。常用的選擇性培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基。,60,制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體,將經(jīng)融合的混合細(xì)胞用HAT培養(yǎng)液懸浮稀釋。一般在含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行。在融合后7d用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，7-14d用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，14d后用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。,61,制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體,選擇培養(yǎng)后，只有雜交瘤細(xì)胞才能生存。但不是所有的雜交瘤細(xì)胞均能產(chǎn)生所需的抗體。產(chǎn)生特定抗原的抗體的B細(xì)胞只占

42、所有脾細(xì)胞的5％左右。用抗原對(duì)所有小孔的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩出能產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞。,62,制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體,將能產(chǎn)生目的抗體的培養(yǎng)小孔中的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行稀釋?？捎糜邢尴♂尫ê蛙洯傊āＳ行♂寱r(shí)，將細(xì)胞稀釋液分加到96孔板中，使每個(gè)小孔在理論上只有一個(gè)細(xì)胞。軟瓊脂法。,63,制備針對(duì)特異抗原的單克隆抗體,培養(yǎng)后，取上清進(jìn)行抗體檢測(cè)，獲得能產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。大量生產(chǎn)目的單克隆抗體。體外培養(yǎng)法，

43、10 μg/ml。動(dòng)物體內(nèi)誘生法， 5-20 mg/ml。,64,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,小結(jié),,1. 用特定的抗原免疫動(dòng)物,2. 從脾中取出B淋巴細(xì)胞,2. 骨髓瘤細(xì)胞,3. 獲得雜交瘤細(xì)胞,,4. 培養(yǎng)并篩選能產(chǎn)生抗體的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞,5. 優(yōu)化培養(yǎng)目的雜交瘤細(xì)胞,6. 純化單克隆抗體,65,單克隆抗體的不足,目前單克隆抗體均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（human antimouse antibo

44、dy, HAMA)人體的排斥反應(yīng)人體內(nèi)半衰期只有5-6小時(shí)到達(dá)靶組織的藥量?jī)H有1％完整的抗體分子的相對(duì)分子量較大，穿透力不強(qiáng)，難以到達(dá)病灶的核心部位,基因工程抗體,67,基因工程改造抗體的目標(biāo),降低免疫原性。降低相對(duì)分子量，增加穿透力。,68,人－鼠嵌合抗體(human-mouse chimeric antibody),在基因水平上將鼠源性單克隆抗體的可變區(qū)和人源性抗體恒定區(qū)連接起來(lái)，并在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)形成的抗體。,69

45、,人－鼠嵌合抗體,,,鼠源性,,,鼠源性,,,人源性,,,,人源性,,,,70,人－鼠嵌合抗體構(gòu)建,能產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞系,,mRNA,,cDNA,根據(jù)VL和VH基因兩端序列設(shè)計(jì)引物,,,PCR擴(kuò)增,,,VH基因,VL基因,,連人Ig的CH基因,,連人Ig的CL基因,,,等量混合后，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞SP2/0,篩選獲得共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,71,人－鼠嵌合抗體不足,雖然人－鼠嵌合抗體與鼠源性抗體相比，在一定程度上減弱了人抗鼠抗

46、體反應(yīng)，但仍不能完全消除。,72,抗體的CDR區(qū),,Sources from Molecular Biology of the Cell   V. Cells in Their Social Context   24. The Adaptive Immune System   B Cells and Antibodies,,框架區(qū),框架區(qū),,CDR,,,73,改形抗體又叫CDR移植抗體。將鼠

47、單抗的CDR移植到人Ig分子的骨架區(qū)中，換下其CDR序列而形成的抗體。,改形抗體(reshaped antibody),74,具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。抗體分子中鼠源部分只占很小的比例，可基本消除免疫原性。到目前，約有100種鼠單抗通過(guò)CDR移植獲得人源化的改形抗體，其中超過(guò)40種已進(jìn)行或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。,改形抗體的特點(diǎn),75,構(gòu)建改形抗體除較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力外，最大的問(wèn)題是人Ig分子的框架區(qū)中的一些氨基酸與鼠單抗的CD

48、R區(qū)不協(xié)調(diào)，從而使改形抗體的親和力下降，甚至喪失活性。,改形抗體的不足,76,在人－鼠嵌合抗體的基礎(chǔ)上，將來(lái)自鼠單抗可變區(qū)中決定免疫原性的暴露于抗體表面的Aa，用相應(yīng)位置的人Ig的Aa代替而形成的抗體。,鑲面抗體（resurfacing antibody）,77,1991年，Padlan等分析了大量鼠單抗可變區(qū)Aa和人抗體可變區(qū)Aa的表面暴露情況，發(fā)現(xiàn)抗體表面所暴露的Aa位置和數(shù)量都很保守，不因種屬和型別而改變?？贵w表面暴露的Aa是鼠

49、源可變區(qū)免疫源性的主要來(lái)源。,鑲面抗體的理論基礎(chǔ),78,小分子抗體,79,Fab片段和重組Fab片段,Fab片段由重鏈Fd段和完整輕鏈通過(guò)鏈間二硫鍵形成的異二聚體，整個(gè)分子約占整個(gè)抗體分子的1/3。如果Fab片段的恒定區(qū)為人源性的，則稱(chēng)為重組Fab片段。,,,,,,,S－S,VL,CL,VH,CH,80,小分子抗體－抗體的片段化,Fab: Fragmentation of antigen binding,81,Fv和單鏈抗體(sin

50、gle-chain Fv, scFv),Fv片段由重鏈可變區(qū)VH段和輕鏈可變區(qū)VL通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合在一起，是抗體中具有抗原結(jié)合活性的最小功能片段。scFv是指在DNA的水平上用一段長(zhǎng)度合適的寡核苷酸序列將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接起來(lái)，形成單一鏈的分子。,,VH,,,82,雙體分子(diabody),一條單鏈抗體分子上的VH和VL與另一條相同的單鏈抗體分子上的VL和VH分別配對(duì)形成的雙價(jià)抗體分子。,83,單域抗體,比Fv更小的亞單位結(jié)

51、構(gòu)組成的具有抗原結(jié)合活性的分子，重鏈可變區(qū)是典型的單域抗體，其具有較高的抗原結(jié)合活性。,84,最小識(shí)別單位,比單域抗體更小的分子，如CDR3仍能與抗原結(jié)合，只是其親和力相當(dāng)?shù)汀?,,CDR3,85,小分子抗體的優(yōu)點(diǎn),分子質(zhì)量小，免疫原性低。易于進(jìn)入實(shí)體瘤周?chē)奈⒀h(huán)甚至進(jìn)入實(shí)體瘤的內(nèi)部。無(wú)Fc片段，不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合，用于免疫診斷時(shí)成像清晰。構(gòu)建較簡(jiǎn)單，易于操作和改造?？稍诩?xì)菌中表達(dá)，易于大量生產(chǎn)?？膳c多種效應(yīng)分

52、子如毒素、前體藥物轉(zhuǎn)化酶等構(gòu)建多種雙功能抗體分子。,86,小分子抗體的缺點(diǎn),多為單價(jià)抗體，與抗原結(jié)合活性相對(duì)較弱。半衰期短，能很快從血液中清除，從而可能影響治療的有效濃度。,87,抗體庫(kù)技術(shù)(antibody library),用基因克隆技術(shù)克隆全套抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因，然后重組到特定的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化特定的宿主細(xì)胞表達(dá)有功能的抗體分子，并通過(guò)親和篩選獲得特異性抗體可變區(qū)基因的技術(shù)。利用抗體庫(kù)技術(shù)篩選到的抗體可變區(qū)基因可被用

53、于構(gòu)建基因工程抗體。,88,抗體庫(kù)優(yōu)點(diǎn),越過(guò)了細(xì)胞融合的步驟，省時(shí)省力。擴(kuò)大了篩選容量，易于獲得高親和力抗體。不需進(jìn)行人工體內(nèi)免疫。,89,抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展,1989年，組合抗體庫(kù)(combinatorial immunoglobulin library)技術(shù)。1991年，噬菌體抗體庫(kù)展示技術(shù)。最近幾年，核糖體展示抗體庫(kù)。,90,組合抗體庫(kù),克隆抗體輕鏈全套基因,克隆抗體重鏈Fd段全套基因,,,構(gòu)建到λ噬菌體表達(dá)載體,,,輕鏈全

54、套基因庫(kù),重鏈Fd段全套基因庫(kù),,,隨機(jī)重組到同一表達(dá)載體中,,組合抗體庫(kù),,特異性抗體篩選,,具有目的抗原結(jié)合活性的Fab片段,抗體重要應(yīng)用,92,雙功能抗體,是指具有兩種結(jié)合特性的抗體，即兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同的抗原或抗原決定簇，又稱(chēng)雙特異性抗體(bispecific antibody, BsAb) 。廣義上講，雙功能抗體也包括各種抗體免疫偶聯(lián)物。,93,雙功能抗體構(gòu)建的方法,化學(xué)交聯(lián)法生物學(xué)方法（雜種－雜交瘤方法）

55、基因工程方法,,VL,,VH,,VL,94,雙功能抗體應(yīng)用舉例,構(gòu)建一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的表面抗原，另一個(gè)是針對(duì)免疫活性細(xì)胞CTL表面的特征性分子CD3或CD28。這種雙特異性抗體可以識(shí)別并連接腫瘤細(xì)胞和CTL細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷作用。,95,藥物毒素酶同位素,抗體免疫偶聯(lián)物(immunoconjugates),,導(dǎo)向裝置,彈頭,96,與單抗偶聯(lián)的常用的“彈頭”,植物毒素微生物毒素抗代謝類(lèi)藥物蒽環(huán)類(lèi)

56、藥物烷基化類(lèi)藥物抗有絲分裂藥物抗生素,蓖麻毒素、相思豆毒素、皂角苷綠膿桿菌外毒素、白喉毒素氨基喋呤、阿糖胞苷、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、5-氟脫氧尿苷阿霉素、柔紅霉素、去甲氧柔紅霉素、嗎啉阿霉素苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、絲裂霉素C、順鉑長(zhǎng)春花堿、秋水仙堿、鬼臼毒素新制癌菌素、博萊霉素、平陽(yáng)霉素、博安霉素、力達(dá)霉素、加力奇霉素,97,單抗偶聯(lián)物的特點(diǎn),在體內(nèi)顯示特異性分布，在靶組織濃度最高。對(duì)靶細(xì)胞有選擇性的殺傷和治

57、療作用，對(duì)正常細(xì)胞作用弱。比游離藥物有更好的療效并較低的副作用。,98,已上市的治療腫瘤的抗體藥物,抗CD20嵌合抗體Rituxan抗HER2人源化抗體Herceptin抗CD33人源化抗體－抗生素偶聯(lián)物Mylotarg抗17-1A抗獨(dú)特型嵌合抗體Panorex抗CD20人源化抗體－核素偶聯(lián)物Zevalin,99,抗體藥物研究的趨向,尋找新的分子靶標(biāo)抗體人源化抗體藥物的高效化抗體藥物分子的小型化抗體融合蛋白,100,抗