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1、第三章 DNA的復(fù)制,第一節(jié)半保留復(fù)制的驗(yàn)證 半保留模型(semioconservetive model) 全保留復(fù)制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。,驗(yàn)證半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn),一、Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn) 二、Taylar實(shí)驗(yàn) 三、姐妹染色單體差別染色方法(sister- chromatid differential s
2、taining) 5溴脫氧尿嘧啶(5-Bromodeoxy uridine,簡(jiǎn)稱BUdR) 斑色染色體(Harlequin chromosome) 四、Cairns復(fù)制模型—θ型復(fù)制,圖11-4 Taylor 蠶豆根尖放射自顯影實(shí)驗(yàn)。(a)按半保留復(fù)制預(yù)期DNA在復(fù)制過程中標(biāo)記情況;(b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果染色體放射自顯影的圖示。,,第二節(jié)復(fù)制的起點(diǎn)、方向和終點(diǎn),一. 研究方法: 1. 用同位素標(biāo)記電
3、鏡觀察及變性法2. 用噬菌體插入標(biāo)記法 同步培養(yǎng) 不同步培養(yǎng) 3. 變性定性法(denaturation mapping) 4. 雙向電泳法,圖11-11不同步培養(yǎng)時(shí)各標(biāo)記的拷貝數(shù)不同 復(fù)制起點(diǎn)標(biāo)記的拷貝數(shù)應(yīng)最多,二、原核的復(fù)制起點(diǎn)和方向,E.coli定點(diǎn)、雙向?qū)ΨQ復(fù)制。 T7在近一端的17%處開始,向兩端延伸。 枯草桿菌有固定的起始點(diǎn),雙向不對(duì)稱復(fù)制。 質(zhì)粒R6K早期為
4、單向復(fù)制,復(fù)制了約1/5基因組 進(jìn)行時(shí)雙向復(fù)制。 質(zhì)粒Col E1有固定起始點(diǎn),但卻為單向復(fù)制。 mt DNA進(jìn)行D(displaced loop)環(huán)復(fù)制 真核有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)(i),雙向等速?gòu)?fù)制。,D環(huán)復(fù)制,第三節(jié)DNA復(fù)制突變型的篩選,根據(jù)溫度敏感性篩選同位素標(biāo)記法篩選5-溴尿嘧啶摻入法質(zhì)粒溫度敏感性的篩選根據(jù)抗藥性篩選根據(jù)與突變有關(guān)的生物學(xué)功能篩選快停突變與慢停突變
5、,,,第四節(jié)原核生物復(fù)制的酶系統(tǒng),DNA合成酶DNA聚合酶的共同特點(diǎn)是: (1)需要提供合成模板; (2)不能起始新的DNA鏈,必須要有引物提供3'-OH; (3)合成的方向都是5’→3’; (4)除聚合DNA外還有其它功能。,表11-1 E.coli 中的三種DNA多聚酶,,,(一). DNA聚合酶I的結(jié)構(gòu),DNA聚合酶有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn):(1) 模板結(jié)合位點(diǎn);(2) 引物結(jié)合位點(diǎn);
6、(3) 引物3’-OH結(jié)合位點(diǎn);(4) 底物dNTP結(jié)合位點(diǎn);(5) 5’→3’外切酶結(jié)合位點(diǎn);(6) 3’→5’校正位點(diǎn)。,,(二). DNA聚合酶Ⅰ的功能,1. 5’→3’聚合功能 2. 3’→5’外切活性 3. 5’→3’外切活性 (1)切口平移(nick translation); (2)鏈的置換; (3)模板轉(zhuǎn)換(template-swi
7、tching) 4. 內(nèi)切酶活性,,(三)DNA多聚酶Ⅲ的結(jié)構(gòu),,全酶在DNA上的裝配分為三個(gè)階段:,(1)一個(gè)β二聚體加上一個(gè)γ復(fù)合體識(shí)別引物模板形成一種前起始復(fù)合物。(2)DNA在于β,γ復(fù)合體結(jié)合的位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變,而對(duì)核心酶產(chǎn)生了高親和。使核心酶能與DNA結(jié)合。(3)τ二聚體結(jié)合核心聚合酶,使其二聚化。,二. DNA連接酶,其作用機(jī)制是分三步進(jìn)行:1. 在真核生物中, E+ATP→E-AMP+ppi 在E
8、.coli中, E+NAD→E-AMP+NMN(煙酰胺單核苷酸)2. E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5’-PO4上使其活化3. 活化的5’-PO4與相鄰的3’-OH作用形成 3’-5’磷酸二酯鍵,并釋放出AMP。,三. 單鏈結(jié)合蛋白(SSB),又稱為雙螺旋去穩(wěn)定蛋白(helix destabilizing protein)由177個(gè)aa組成在E.coli 中以四聚存在分子量為74KDa在原核中SSB與
9、DNA結(jié)合表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。(1)SSB之間的相互作用;(2)第一個(gè)SSB和DNA的結(jié)合改變了DNA的結(jié)構(gòu)。,四.解旋酶(helicase),第五節(jié) 原核生物,噬菌體和病毒的復(fù)制起始和終止,一.環(huán)狀DNA的復(fù)制,復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是:,(1)富含A-T,這可能和雙鏈易于解開起始 復(fù)制有關(guān);(2)含有多個(gè)回文結(jié)構(gòu)(9-14個(gè)GATC) 8個(gè)GATC較保守,CATC中的“ A”已甲基化;(3
10、)具有 4個(gè)反向重復(fù)順序,作為蛋白結(jié)合 位點(diǎn);(4)此順序的右側(cè)毗鄰區(qū)域有兩個(gè)啟動(dòng)子,其可能的作用是:①轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生引物;②產(chǎn)生復(fù)制必要的蛋白;③產(chǎn)生調(diào)節(jié)功能的RNA;④起轉(zhuǎn)錄激活作用。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
11、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1968年Gilbert提出滾環(huán)復(fù)制模型:,(1)共價(jià)延伸;(2)模板鏈和新合成的鏈 分開;(3)不需RNA引物,在正 鏈3‘-OH上延伸(4)只有一個(gè)復(fù)制叉;(5)形成多聯(lián)體(concatemer );,,,滾環(huán)復(fù)制的電鏡照片,哪些DNA進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制?,真核rDNA的擴(kuò)增;F因子DNA的轉(zhuǎn)移;λ裂解途經(jīng)的復(fù)制; φX174,M13.G4等;
12、單鏈環(huán)狀DNA噬菌體第二階段復(fù)制都是進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制的。,二.DNA末端起始復(fù)制,線性雙鏈DNA的復(fù)制有的是從一端開始的: 腺病毒(Adenovirus) φ29 DNAs 脊髓灰質(zhì)病毒(poliovirus)腺病毒DNA全長(zhǎng)35937 bp,線性雙鏈,兩端各有反向重復(fù)順序103~162 bp,兩末端各有50 bp為復(fù)制起點(diǎn)。其復(fù)制是以單鏈置換(strand displacement)形成一個(gè)大的莖環(huán)
13、或叫平鍋形結(jié)構(gòu)來進(jìn)行的。,三.復(fù)制的終止,E.coli的復(fù)制終止現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)終止區(qū)域(terE,D,A和ter C,B),位于相遇點(diǎn)的另一側(cè)100Kb處。每一終止順序?qū)δ骋环较蛞苿?dòng)的復(fù)制叉來說是特異的。ter順序有一個(gè)23bp的區(qū)域,在體外可導(dǎo)致復(fù)制的終止,但其功能顯示了一定的方向性。終止需要tus(terminus utilization substance)基因的產(chǎn)物Tus(36kD),Tus能識(shí)別ter保守順序,并阻止復(fù)制
14、叉繼續(xù)前進(jìn)。ter-Tus復(fù)合物可能通過抑制螺旋酶來實(shí)行終止。,,,,第六節(jié) 復(fù)制的過程,一.半不連續(xù)復(fù)制,E.colidUTPase,它能使dUTP變成dUMP,dUMP是不能作為DNA合成的底物,這樣它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶(uracil N-glycosylase),它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵,形成無Pu和Py位點(diǎn)(apurinic or apyrimidinic ,AP),再由AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)切出一個(gè)缺
15、口,進(jìn)一步進(jìn)行切除修復(fù)。,以下實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這個(gè)解釋:,(1)在dut -突變體(dUTPase缺失)中岡崎片段比在dut +中為短。這是因?yàn)閁摻入機(jī)會(huì)增加;(2)在ung- (尿嘧啶N-糖苷酶缺失)突變體中,新合成的DNA約有一半由片段組成。(3)因?yàn)槟蜞奏-糖苷酶缺失,不會(huì)切除U的糖苷鏈,也就不會(huì)出現(xiàn)AP位點(diǎn),所以堿沉淀時(shí)不易斷裂,從而保持了半不連續(xù)的原貌。 在dut-, ung-雙突變體中,結(jié)果和實(shí)驗(yàn)(2)相同,更進(jìn)一步
16、證實(shí)了此推測(cè)。,,,,,,酵母的自主復(fù)制區(qū),ARS(autonomously replicationg sequence)發(fā)揮復(fù)制起點(diǎn)的功能,但是過量的;酵母染色體Ⅳ的著絲粒附近為ARS1序列;ARS1分為A,B,C三個(gè)功能區(qū), A,B起主要作用,C起次要作用;A區(qū)為15bp,其中11個(gè)保守,稱ACS (ARS consensus sequence)。有復(fù)制起始子的功能;B區(qū)約為80bp,含B1,B2,B3三個(gè)功能區(qū);B3是
17、ABF1(ARS-binding factor 1)結(jié)合區(qū)。,酵母的復(fù)制,,ORC:由6個(gè)亞基組成相當(dāng)于DnaA和λ的O蛋白,與 A/B1結(jié)合,結(jié)合于游離的DNA Cdc6:相當(dāng)于DnaC,及λ的P蛋白,使Mcm蛋白結(jié)合到復(fù)合體上。此對(duì)在Origin上起始復(fù)制是必須的。 Mcm: DnaB 螺旋酶。即 licensing factorABF1(轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合于B3,,原核和真核生物復(fù)制體系的比較,E.coli λ
18、 SV40/人 酵母 功能 DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白 DnaB DnaB T抗原 MCM 解旋酶 DnaC
19、 P ? Cdc6 裝配因子 DnaG DnaG Polα-引發(fā)酶 Polα-引發(fā)酶 引發(fā)酶 PolⅢ的 α亞基 Polδ Polδ,Polε 聚合酶 PolⅢ的ε亞基
20、 Polδ Polδ,Polε 校正 PolⅢ的?亞基 PCNA PCNA 滑動(dòng)鉗 ? 復(fù)合體 RF-C RF-C 滑動(dòng)鉗裝配器 SSB RF-A RF-A 單鏈結(jié)合蛋白,,,,Pvu Bg1 Bam H1 Ba
21、m pBR322 TEL TEL 四膜蟲rDNA ARS Pvu Bg1
22、 Bam H 連接 Pvu 轉(zhuǎn)化酵母
23、 Pvu 傳幾代酵母DNA Pvu Pvu
24、 連接 轉(zhuǎn)化酵母 傳幾代 圖 11-56 四膜蟲與酵母TEL的拼接以及酵母細(xì)胞將其特有的TEL加到四膜蟲
25、 的TEL上(參考Shampg,J and Blackburn et al: 《Nature》1984,310:154-157),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,真核生物與原核生物DNA合成的區(qū)別,真核DNA復(fù)制和原核DNA復(fù)制的區(qū)別,1、 真核DNA復(fù)制為多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。
26、2 、真核DNA復(fù)制時(shí)DNA聚合酶有五種(α、β、γ、δ和ε),其中只有δ酶具有3′→5′外切酶活性;而原核生物只有三種DNA聚合酶(polⅠ、Ⅱ、Ⅲ),且都具有3′→5′外切酶活性。真核的polδ和α分別負(fù)責(zé)合成前導(dǎo)鏈和后滯鏈,而原核的polⅢ是兩者兼顧。3、真核細(xì)胞內(nèi)DNA引物酶和polα緊密偶聯(lián),而在原核細(xì)胞內(nèi)引發(fā)酶是和解旋酶偶聯(lián)在一起,形成復(fù)制體的一部分。,,作業(yè):1、圖示說明DNA半保留復(fù)制的機(jī)制證明。2、DNA復(fù)制
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