獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)之妊娠期疾病

1、第五章 繁殖輔助技術(shù),Assisted Reproduction Technology,第一節(jié) 人工授精,Artificial Insemination （AI）,一 人工授精的概述二 采精三 精液品質(zhì)檢查四 精液的稀釋五 精液的保存六 輸精操作七 精液冷凍保存技術(shù),第一節(jié) 人工授精,一、人工受精的概述,1 定義2 優(yōu)越性3 AI主要技術(shù)環(huán)節(jié),,第一節(jié) 人工授精,人工授精是指用器械采集公畜（禽）精液，經(jīng)

2、過檢查處理，再用器械將一定量的精液注入到發(fā)情母畜生殖道的一定部位，以人工操作代替公母畜本交的一種畜牧技術(shù)。,1 定義,一、人工受精的概述,在1780年意大利生理學(xué)家Spallanzani將犬的精子注入母犬體內(nèi)，獲得3只小犬；1890年，法國獸醫(yī)，馬人工授精；1914年，意大利，Amantea設(shè)計了假陰道；1921年，俄國人Ivanoff，擴(kuò)大到牛、羊、家禽；1937年，丹麥獸醫(yī)發(fā)明了牛直腸把握輸精；1949年，Polge，甘油

3、，冷凍精液。 中國從1950年以后開始。,發(fā)展簡史,一、人工受精的概述,2人工授精優(yōu)越性,公畜利用率節(jié)約經(jīng)濟(jì)加快改良防病提高受胎率遠(yuǎn)距離交流和運輸,就本交的幾種方式而言的優(yōu)越性有：,一、人工受精的概述,3 AI主要技術(shù)環(huán)節(jié),,采精,,精液品質(zhì)檢查,,精液稀釋保存,,精液運輸,,母畜發(fā)情鑒定,,,,輸精,一、人工受精的概述,二、采精,1 采精的方法種類及評價標(biāo)準(zhǔn) 2 采集技術(shù),,第一節(jié) 人工授精,1 采精的方

4、法種類及評價標(biāo)準(zhǔn),（1）假陰道法,二、采精,（2） 手握或筒握法,1 采精的方法種類及評價標(biāo)準(zhǔn),二、采精,（3）電刺激或按摩法,1 采精的方法種類及評價標(biāo)準(zhǔn),二、采精,（4）陰道收集法,（5）海綿、集精袋法,（6）外科瘺管法,1 采精的方法種類及評價標(biāo)準(zhǔn),二、采精,評價標(biāo)準(zhǔn),全 量,無損傷,簡 便,原 質(zhì),1 采精的方法種類及評價標(biāo)準(zhǔn),二、采精,2 采集技術(shù),二、采精,2.1 采精前準(zhǔn)備（以假陰道為例）,場地：采精室要求寬暢、明亮

5、、地面平整，安靜，清潔，設(shè)有采精架、臺畜、假臺畜和精液操作室等必要設(shè)施,二、采精,臺畜,,1、健康、溫順、衛(wèi)生,2、設(shè)計合理、方便,假陰道：,公畜性欲,體況適中,定期檢疫,定期清洗,飼料全價,適當(dāng)運動,二、采精,2.2 公畜采精調(diào)教法,外 激 素 法,偷 梁 換柱 法,榜 樣 示 范 法,二、采精,2.3 采精須知,①采精者在公畜的右后側(cè)（站?。虎隈R性反射慢，壓力重要；③牛、羊性反射快，溫度重要，勿觸及陰

6、莖，可觸包皮；④豬性反射慢，壓力為節(jié)律性收縮；⑤兔可用羊假陰道，倒向一側(cè)并叫一聲，表示射精；⑥雞按摩手法要準(zhǔn)確實在。,二、采精,2.4 采精頻率,馬、牛和豬每周2-6次，雞每3天停1天，羊在春分之前最差，秋分時可達(dá)7～14次/周。 牛：每周2天采精，當(dāng)日采2次 豬：隔日一次，最好3天一次 羊：每周3天，當(dāng)日采2次。 犬：隔日一次 主要根據(jù)精液品質(zhì)與公畜的性機(jī)能狀況而定。,二、采精,在人

7、工授精技術(shù)中，我們要采集公畜的精液，并在體外進(jìn)行一系列的處理。那么精液的質(zhì)量必然要受到公畜本身的生精能力、健康狀況，以及采集方法、處理方法的影響。因此，檢查精液品質(zhì)是人工授精技術(shù)中一個非常重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。,三、精液品質(zhì)檢查,第一節(jié) 人工授精,（一）重要性（二）精液品質(zhì)檢查項目（三）精液品質(zhì)檢查方法,三、精液品質(zhì)檢查,第一節(jié) 人工授精,（一）重要性,1.檢查種公畜的配種能力 2.公畜的飼養(yǎng)水平和性機(jī)能 3.確定精液可稀釋的

8、倍數(shù) 4.檢查精液的處理方法是否正確 5.檢查精液產(chǎn)品的質(zhì)量 6.反映技術(shù)操作水平,三、精液品質(zhì)檢查,（二）精液品質(zhì)檢查的項目,1.直觀項目 2.微觀項目,三、精液品質(zhì)檢查,1.直觀檢查項目,射精量色澤氣味云霧狀PH值美蘭退色試驗,三、精液品質(zhì)檢查,A 射精量的測定方法B 射精量不正常的原因,射精量,三、精液品質(zhì)檢查,A 射精量的測定方法,概念: 射精量是指每次射精的體積測定: 以連續(xù)3

9、次以上正常采集到的精液的平均值代表測定方法: 可用體積測量容器如刻度試管或量筒,也可用電子秤稱重近似代表體積,三、精液品質(zhì)檢查,B 射精量不正常的原因,三、精液品質(zhì)檢查,色澤,三、精液品質(zhì)檢查,云霧狀分級標(biāo)準(zhǔn),+++ 翻滾明顯而且較快++ 翻滾明顯但較慢+ 仔細(xì)看才能看到精液的移動- 無精液移動,三、精液品質(zhì)檢查,2.微觀檢查項目,2.1 精子活力估測2.2 密度測定:計數(shù)板計數(shù)、比色計測定2.

10、3 畸形率：形態(tài)畸形率、頂體畸形率,三、精液品質(zhì)檢查,2.1 活力的估測,A 概念:精子活力是指在37℃下,精液中前進(jìn)運動精子占總精子數(shù)的百分率。B 主要測定方法:估測法,三、精液品質(zhì)檢查,活力測定時精液的稀釋用品,三、精液品質(zhì)檢查,例：牛精子活力檢查的程序,載玻片預(yù)溫,精液稀釋,取樣檢查,鏡檢,活力估測,活力記錄,,,,,,將恒溫加熱板放在載物臺上，打開電源并調(diào)整控制溫度至37℃，然后放在載玻片,將生理鹽水與精液等溫后，按1:10稀

11、釋,取10ul放在預(yù)溫后載玻片中間，蓋上蓋玻片,用100倍和400倍觀察,判斷視野中前進(jìn)運動精子占的百分率,按10級制評分和記錄,三、精液品質(zhì)檢查,2.2 密度測定20111020091,A 密度的概念及表示方法,單位體積精液中所含的精子數(shù)表示方法:個/ml 或億/ml,也可以用個/ul表示,B 各種家畜精液的精子密度,三、精液品質(zhì)檢查,C 精子密度的測定方法,精子密度計數(shù)板(器)簡介精液的稀釋精液注入計數(shù)室精子計數(shù)精子

12、密度計算,2.2 密度測定,三、精液品質(zhì)檢查,a 精子密度計數(shù),精子計數(shù)室長寬各1mm,面積1mm2高度0.1mm,體積0.1mm3由雙線或三線組成25個(5X5)中方格每個中方格內(nèi)有16個小方格(4X4)共計400個小方格,三、精液品質(zhì)檢查,精子計數(shù)室及一個中方格,,三、精液品質(zhì)檢查,b、精液的稀釋,將精液注入計數(shù)室前必須對精液進(jìn)行稀釋,以便于計數(shù)稀釋的比例根據(jù)動物精液的密度范圍確定稀釋方法:用5-25ul移液器和10

13、0-1000 ul移液器,在小試管中進(jìn)行組合不同的稀釋.如牛精液稀釋100倍,為5ul原精+500ul稀釋液稀釋液:3%氯化鈉溶液,用以殺死精子,便于計數(shù),三、精液品質(zhì)檢查,注入計數(shù)室前各種家畜精液建議稀釋比例,b、精液的稀釋,三、精液品質(zhì)檢查,c、精液注入計數(shù)室,將潔凈的計數(shù)板放在載物臺上固定好,蓋上干凈的蓋玻片取25ul稀釋后的精液,將吸咀放于蓋玻片與計數(shù)板的接縫處緩慢注入精液,使精液依靠毛細(xì)作用吸入計數(shù)室,三、精液品質(zhì)檢查,

14、注意：讓稀釋后的精液通過毛細(xì)作用自行吸入！,用吸管稀釋后精液注入計數(shù)室,共有兩個對稱的計數(shù)室,用移液器注入精液,b、精液的稀釋,三、精液品質(zhì)檢查,d、精子計數(shù)20111008081,將計數(shù)板固定在顯微鏡的推進(jìn)器內(nèi)，用100倍放大找到計數(shù)室，再用400倍找到計數(shù)室的第一個中方格。計數(shù)左上角至右下角五個中方格的總精子數(shù)，以精子的頭部為準(zhǔn)，依“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則進(jìn)行計數(shù)格線上的精子。,三、精液品質(zhì)檢查,,,,,,,,,,,進(jìn)行精

15、子計數(shù)的中方格數(shù)可以是四角一中心共5個中方格,也可以是從左角到右下角五個中方格,,,,,,,,以圖示次序計數(shù)，精子的頭部為準(zhǔn)，依“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則進(jìn)行計數(shù)格線上的精子。白色精子不計數(shù),三、精液品質(zhì)檢查,計算精子密度,精子密度=5個中方格總精子×5×10×1000 × 稀釋倍數(shù),b、精液的稀釋,三、精液品質(zhì)檢查,例：牛精子密度測定程序,放計數(shù)板于載物臺上,取樣稀釋精液,精液注入計

16、數(shù)室,鏡檢,精子計數(shù),密度計算,,,,,,計數(shù)板和蓋玻片一定要清潔,取500ul 3%氯化鈉于小試管中,加入5ul原精液,混合均勻,取25ul小心地從計數(shù)板與蓋玻片的接縫中加入,使其自行吸入計數(shù)室中,用100倍和400倍觀察,計數(shù)五個中方格的總精子數(shù),計數(shù)以頭部為準(zhǔn),在格線上的數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右,精子密度= 5個中方格總精子數(shù)5×10×1000 × 100,將載玻片放在400或600倍的顯微鏡下進(jìn)行觀察

17、，共記錄若干個視野100-200個左右的精子。,附圖，正常精子的結(jié)構(gòu)模式圖,畸形率=畸形精子數(shù)/總精子數(shù),2.3 畸形率,三、精液品質(zhì)檢查,畸形精子（右）,2.3 畸形率,三、精液品質(zhì)檢查,視野中的畸形精子,四、精液的稀釋,第一節(jié) 人工授精,（一）精液稀釋的目的,精液稀釋是向精液中加入適宜于精子存活的稀釋液。其目的有兩個：1.擴(kuò)大精液容量，從而增加輸精頭數(shù)，提高公畜利用率。2.延長精子的保存時間及受精能力，便于精液的運輸，使精液得

18、以充分利用。,四、精液的稀釋,（二）精液稀釋液的成分及作用,1．營養(yǎng)物質(zhì) 2．保護(hù)性物質(zhì) 1)緩沖劑 ：檸檬酸鹽，磷酸鹽2)防冷抗凍物質(zhì)：卵黃，甘油 3)抗菌物質(zhì) ：短期保存，青霉素，鏈霉素；長期保存，慶大霉素，先鋒，頭孢3.稀釋劑 ：氯化鈉4.其它添加劑 1)酶類 2)激素類 3)維生素類 ：VB12，VB6，VE 4)有機(jī)酸、二氧化碳等,四、精液的稀釋,（三）稀釋液的配制方法,用品的清洗與消毒藥品的稱量

19、、水的量取基礎(chǔ)液的配制：溶解—過濾—消毒（水浴或直接加熱）—放涼稀釋液的配制：基礎(chǔ)液按比例加入抗生素、卵黃 Ⅰ液：按比例加入卵黃和抗生素的稀釋液 Ⅱ液：按比例加入抗凍劑,四、精液的稀釋,（四）稀釋倍數(shù)和稀釋方法,四、精液的稀釋,1．稀釋倍數(shù)確定,精液適宜稀釋倍數(shù)與家畜種類和稀釋液種類有關(guān)。確定稀釋倍數(shù)應(yīng)根據(jù)原精液的質(zhì)量，尤其是精子的活率和密度、每次輸精所需的精子數(shù)、稀釋液的種類和保存方法。一般牛4-6倍，豬1-3倍，兔3-5

20、倍，雞5-10倍。,四、精液的稀釋,正確的表示方法： N倍稀釋：即1份精液:N份稀釋液1:N稀釋：意思同上 實際應(yīng)用表示方法： 稀釋后體積是原精液體積的多少倍。因此所謂的N倍稀釋，實際上是1:(N-1)，但這種方法有利于進(jìn)行相關(guān)計算。如N倍稀釋后，精子密度為原來的1/N，體積為原精液體積的N倍，可分裝的份數(shù)為： 原精液體積×稀釋倍數(shù)/每份精液體積,1．稀釋倍數(shù)確定,四、精液的稀釋,2.普通稀釋倍

21、數(shù)的計算,,,稀釋倍數(shù)=原精液精子密度×原精液活力×稀釋后每份精液的體積/稀釋后每份精液中所含的有效精子數(shù),四、精液的稀釋,3.冷凍精液稀釋倍數(shù)的計算,,四、精液的稀釋,4．稀釋方法,1）精液經(jīng)檢查合格后應(yīng)立即進(jìn)行稀釋，越快越好。2）稀釋時，稀釋液的溫度和精液的溫度必須調(diào)整一致，以30-35℃為宜。3）稀釋時，將稀釋液沿精液瓶或插入的滅菌玻璃棒緩慢倒入，防止劇烈震蕩。4）若作高倍稀釋，應(yīng)先低倍后高倍，分次進(jìn)

22、行稀釋。5）稀釋后立即鏡檢，活力應(yīng)和稀釋前一樣。6）稀釋后精液立即進(jìn)行分裝（一般按一頭母畜的輸精量）保存。,四、精液的稀釋,5.冷凍精液稀釋,第一次稀釋倍數(shù)的計算：應(yīng)為最終稀釋后體積的50%。第二次稀釋為1:1稀釋 意義：總稀釋倍數(shù)受總有效精子密度的影響，第二次稀釋時，稀釋液中含有防凍劑，而防凍劑應(yīng)在稀釋后在精液中含有固定的濃度。最后一次稀釋時，1:1稀釋，可以保證稀釋后防凍劑的濃度為Ⅱ液的1半。這樣無論總稀釋倍數(shù)

23、是多少，最終精液中含的防凍劑濃度是不變的。,四、精液的稀釋,五、精液保存,第一節(jié) 人工授精,（一）精液的保存方法,現(xiàn)行精液保存的方法按保存的溫度分：常溫保存（15-25℃）低溫保存（0-5℃）冷凍保存（-79- -196℃）三種。按精液的狀態(tài)分：液態(tài)保存：常溫保存和低溫保存溫度都在0℃以上，故稱液態(tài)精液保存冷凍保存：超低溫保存精液以凍結(jié)形式作長期保存，故稱冷凍精液保存。,五、精液保存,（二）低溫保存,原理：低溫能抑制精子的

24、代謝和微生物的繁殖，但迅速降溫會使精子遭受冷休克，加低溫保護(hù)劑和緩慢降溫并保持較低溫度，可使精液保存數(shù)天。稀釋液主要成分：抗生素、15-25%的卵黃、基礎(chǔ)液保存方法：用紗布包數(shù)層于裝冰塊的保溫瓶中或冰箱中保存。保存溫度： 2-5℃,五、精液保存,低溫保存的關(guān)鍵性環(huán)節(jié),1、含卵磷脂、抗生素的稀釋液2、等溫稀釋3、緩慢降溫4、保持恒溫（2-4 ℃）5、在保質(zhì)期內(nèi)使用，用前進(jìn)行活力檢查,（二）低溫保存,五、精液保存,（三）常溫保

25、存,原理：精子自身所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)和稀釋液中的酸性物質(zhì)使精液的pH降低到一定的水平，能夠抑制精子的代謝，從而延長精子的存活時間?？股啬軌蛞种莆⑸锏姆敝场Ｏ♂屢撼煞郑嚎股?、單糖、緩沖劑保存溫度： 15-25℃,五、精液保存,常溫保存的關(guān)鍵,1、含緩沖劑、營養(yǎng)、抗生素的稀釋液2、等溫稀釋及緩慢降溫3、保持恒溫（15-25℃）4、防止精子沉淀堆積時間過久5、在保質(zhì)期內(nèi)使用，用前進(jìn)行活力檢查,（三）常溫保存,五、精液保存,六、

26、輸精操作,第一節(jié) 人工授精,（一）輸精前的準(zhǔn)備,六、輸精操作,1. 輸精器械的準(zhǔn)備,與精液接觸的用品，必須經(jīng)過清洗、消毒滅菌，并且不能有任何不利于精子存活的化學(xué)物質(zhì)殘留。用前最好用稀釋液或生理鹽水沖洗，確保對精液無毒害作用。 最好一頭母畜準(zhǔn)備一個輸精槍或槍頭，一次性輸精器只能一畜一支。 開膣器最好一畜一個，用前在消毒劑中浸過，用涼開水沖過后，放入干燥箱中干燥后，放涼使用（冬季應(yīng)防止過冷）。,六、輸精操作,2. 精

27、液的準(zhǔn)備,輸精前應(yīng)將精液準(zhǔn)備好，應(yīng)確定精液品質(zhì)符合要求方可用輸精大劑量低溫或解凍后精液，應(yīng)將溫度升至20-30℃后輸精常溫保存精液不須要升溫小劑量冷凍精液也應(yīng)正確解凍后輸精,六、輸精操作,3. 母畜的準(zhǔn)備,牛、馬、羊等家畜輸精前應(yīng)進(jìn)行保定，以確保順利輸精。大家畜可保定在輸精欄內(nèi)或六柱保定架內(nèi)，羊也可倒提保定。豬輸精前應(yīng)對母豬進(jìn)一步發(fā)情檢查，并刺激相應(yīng)部位，以促進(jìn)母豬產(chǎn)生宮縮，有利順利輸精。由助手將動物的尾部拉向一側(cè)，馬輸精前應(yīng)

28、將尾毛用繃帶扎好，防止帶入陰道內(nèi)。輸精前應(yīng)將母畜外陰部用肥皂水清洗后，用清水洗凈，擦干。母豬的外陰可用干紙巾擦凈即可。,六、輸精操作,4. 輸精人員準(zhǔn)備,輸精人員可戴一次性長臂或PE手套操作，也可洗凈雙手即可。操作人員應(yīng)指甲剪短，銼光馬輸精時手要伸入陰道內(nèi)，手臂應(yīng)用75%酒精消毒涼干后，涂少量石蠟油牛輸精時，手臂要伸入到直腸內(nèi)，應(yīng)清洗雙手，戴長臂手套醮少量水或石蠟油或肥皂水，也可不戴手套操作。,六、輸精操作,（二）輸精操作,1

29、牛的輸精2 羊的輸精3 豬的輸精,,,六、輸精操作,1 牛的輸精,1.1 開膣器法1.2 直腸把握子宮頸深部輸精法,六、輸精操作,,子宮頸口,,尿道口,,,膀胱,,,卵巢,,,子宮頸,,,子宮體,六、輸精操作,,,1 牛的輸精,對母牛進(jìn)行發(fā)情鑒定，母牛發(fā)情結(jié)束，不再爬跨其它母牛，精神趨于穩(wěn)定時輸精。將母牛保定，尾部拉向一側(cè)，外陰用高錳酸鉀水棉球擦拭，并擦干。將冷凍精液解凍，剪去封口端，剪口端向前放外套管中，輸精器通針向后拉出

30、15厘米。將外套管套在輸精器上。分開外陰，將套管連同外塑料膜向前上方伸入陰道10厘米，將輸精器捅透外膜。,六、輸精操作,1 牛的輸精,左手（或右手）戴上長臂手套涂少量石蠟油伸入直腸，排出宿糞。手伸至直腸狹窄部后，將直腸向后移，向骨盆腔底下壓，找到子宮頸（棒狀，質(zhì)地較硬有肉質(zhì)感，長約10-20厘米）。手移至子宮頸后端（子宮頸陰道部），使子宮頸呈水平方向，并用力將子宮頸向前推，使陰道壁拉直，方便輸精器向前推進(jìn)。右手將輸精器前端伸到子

31、宮頸外口附近，左手配合，使前端對準(zhǔn)子宮頸外口。左右手配合，上下調(diào)整，使輸精器前端進(jìn)入子宮體內(nèi)。,六、輸精操作,1 牛的輸精,等確認(rèn)輸精器到達(dá)子宮體時（短距離前后移動時，沒有明顯阻力），不要再向前推送輸精器。將精液緩慢注入，并慢慢抽出輸精器。注意：輸精器插入陰道時，應(yīng)向前上方。當(dāng)遇到阻力時，切忌用蠻力。輸精器插入子宮頸管時，推進(jìn)力量要適當(dāng)，以免損傷子宮頸、子宮體粘膜。如果輸精器后端為膠頭，將精液壓子宮內(nèi)后，不要松開膠頭，以免精液流回輸

32、精器內(nèi)。,六、輸精操作,六、輸精操作,,,,,,,,,,,牛直腸把握子宮頸輸精示意圖,六、輸精操作,直把輸精示意圖,六、輸精操作,,,2 羊的輸精,六、輸精操作,2.1 羊輸精前準(zhǔn)備,用試情公羊?qū)Πl(fā)情母羊進(jìn)行發(fā)情鑒定，發(fā)現(xiàn)允許試情公羊爬跨的母羊應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，并安排輸精時間在母羊允許公羊爬跨后的6-12小時第一次配種將母羊保定在保定架內(nèi)或著將其倒提，前肢著地。消毒外陰部，開膣器上涂以石蠟油。,六、輸精操作,2.2 羊輸精操作,將開膣器

33、側(cè)扁方向與陰道呈同一方向，插入母羊陰道內(nèi)，向下轉(zhuǎn)動開膣器，并保持打開狀態(tài)。將準(zhǔn)備好的輸精器前端對準(zhǔn)子宮頸外口，伸入1厘米或更深。將精液緩慢注入后抽出。注意：開膣器應(yīng)保持開張狀態(tài)，以免夾傷陰道粘膜。如果無法找到子宮頸口，應(yīng)撥動粘液，使子宮頸口暴露。如果仍無法確認(rèn)，可將精液注入顏色較深的區(qū)域。,六、輸精操作,開膣器,,羊的輸精,,,3 豬的輸精,六、輸精操作,3.1 輸精時間掌握,用種公豬試情的，后備母豬發(fā)現(xiàn)發(fā)情，24小時后作第一次輸精

34、，間隔12小時第二次輸精；經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)現(xiàn)發(fā)情12小時后第一次輸精，12小時后第二次輸精。地方品種均推遲6小時。無種公豬試情的，后備豬壓背反應(yīng)后6-12小時，經(jīng)產(chǎn)豬立即輸精，地方品種均推遲6小時。,六、輸精操作,3.2 輸精清單,拿到消毒過的輸精導(dǎo)管存儲精液在16-20℃的恒溫箱中每天都用公豬檢查發(fā)情２次在出現(xiàn)靜立發(fā)情的當(dāng)天進(jìn)行第1次輸精清洗雙手清潔母豬陰戶、潤滑輸精導(dǎo)管，將輸精導(dǎo)管向上、向前插入陰道并按逆時針方向旋轉(zhuǎn)直到鎖定

35、搖動輸精瓶幾次，充分混合精液，剪掉輸精瓶的頂端慢慢地向輸精瓶加壓：輸精將要持續(xù)5-10分鐘,六、輸精操作,3.2 輸精清單,,精液流出陰戶時，要重新鎖定輸精導(dǎo)管 使用后，立即用清水和去離子水清洗輸精導(dǎo)管記錄公母豬耳號間隔12-24小時后重復(fù)輸精蒸煮10分鐘消毒輸精導(dǎo)管避免使用洗滌劑和消毒劑來清洗人工授精設(shè)備將輸精導(dǎo)管頭部向上掛在有熱空氣處使其干燥當(dāng)輸精導(dǎo)管內(nèi)外部干燥后，保存在清潔的輸精導(dǎo)管袋中第二次輸精時要用不同的、清

36、潔的、干燥的輸精導(dǎo)管,六、輸精操作,3.3 輸精操作,擦拭外陰部,六、輸精操作,3.3 輸精操作,在輸精器上涂潤滑劑,六、輸精操作,分開外陰將輸精器前端向上呈45度角向左旋轉(zhuǎn)插入母豬陰道內(nèi),3.3 輸精操作,六、輸精操作,3.4 輸精過程,六、輸精操作,,,,,六、輸精操作,七 精液冷凍保存技術(shù),第一節(jié) 人工授精,（一）精液冷凍概述,1950年英國科學(xué)家Polge和Smith采用卵黃和甘油作保護(hù)劑，用干冰作冷源進(jìn)行精液的冷凍，解凍后授精

37、成功，開創(chuàng)了世界人工授精的新時代。到90年代，發(fā)達(dá)國家的全部奶牛和絕大多數(shù)肉牛采用凍精輸精。精液冷凍保存成為最可靠的保存方法。精液冷凍保存是目前精液保存最有效的方法。,七、精液冷凍保存技術(shù),（二）精液冷凍的原理,1、超低溫使精子處于零代謝狀態(tài)，升溫后能使精 子復(fù)蘇并且不失去受精能力。2、但精子冷凍過程會由于形成冰晶使精子受到損害，這些損害包括：精子外的水分先形成冰晶，而形成精子內(nèi)外的滲透壓差，導(dǎo)致精子水分外滲，精子內(nèi)滲透壓增高

38、，電解質(zhì)濃度提高，酸堿失去平衡。冰晶的形成造成：產(chǎn)生機(jī)械壓力，導(dǎo)致細(xì)胞表層破壞精子內(nèi)部冰晶，破壞精子結(jié)構(gòu),七、精液冷凍保存技術(shù),3、如果在冷凍過程只形成微小冰晶，即玻璃化狀態(tài)，則精子就不容易受到損傷，解凍后能恢復(fù)活力。4、形成玻璃化狀態(tài)的條件：防凍劑干擾晶格排列，不形成“過冷溶液”快速降溫，使水分子來不及移動和排列，就失去了能量，不形成“過冷溶液”快速降溫使液體只能形成極微小的“微晶”,（二）精液冷凍的原理,七、精液冷凍保

39、存技術(shù),5、保存和解凍過程的變化：冰晶很微小，所以表面能很高，微晶總是力圖合并成大冰晶。一旦吸收一定的能量，冰晶就會合并成大冰晶，從而使精子受到破壞。保存過程中，即使凍精溫度只升高到-60℃，也可能使精子死亡。凍精在解凍時也需要快速升溫，才能保證防止微晶在解凍過程中形成大冰晶。,（二）精液冷凍的原理,七、精液冷凍保存技術(shù),（三）精液冷凍的稀釋液,低溫保護(hù)劑：糖類：蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖卵黃、奶類冷凍保護(hù)劑：甘油、二甲基

40、亞砜、乙二醇抗生素類： 慶大霉素、青霉素、鏈霉素等,七、精液冷凍保存技術(shù),（四）冷凍精液稀釋液的組成,基礎(chǔ)液：由糖類和鹽類、水配制的等滲液第一液：由基礎(chǔ)液和卵黃（15-20%）組成的低 溫保存稀釋液。用于在33℃下稀釋和逐步降溫。第二液：由第一液和甘油或其它防凍劑組成。甘油含量通常比稀釋后濃度高一倍。用于精液的第二次稀釋（2-4 ℃）,七、精液冷凍保存技術(shù),（五）解凍液的配制,一般采用2.9%的檸檬酸鈉作解凍液豬

41、的凍精解凍液用常溫保存稀釋液BTS也可用VB12注射液作解凍液如果解凍液中加入2mmol的咖啡因有利于提高受胎率,七、精液冷凍保存技術(shù),(六) 冷凍精液的程序,1、采集精液。2、品質(zhì)檢查：精液的密度和活力都必須符合要求。3、稀釋前處理：羊、豬的精液在稀釋前進(jìn)行離心或清洗（羊）有利于提高解凍后活力。4、稀釋：可采用一次稀釋也可采用二次或三次稀釋。最常用的是二次稀釋。,七、精液冷凍保存技術(shù),5、稀釋第一次稀釋：在30℃溫度下，根

42、據(jù)計算的稀釋倍數(shù)進(jìn)行第一次稀釋，放在500毫升的燒杯中與第二液一起緩慢降溫至2-5 ℃。第二次稀釋：在2-5 ℃下進(jìn)行6、平衡：是精液與防凍劑（甘油）相互作用的時間。一般2-4小時。7、分裝：凍精的劑型有細(xì)管（0.25ml、0.5ml），安瓿（2.5ml、5ml)、顆粒（0.1ml）、袋裝等。,(六) 冷凍精液的程序,七、精液冷凍保存技術(shù),8、冷凍：冷源：干冰（-79 ℃）、液氮（-196 ℃）冷凍用品：冷凍面：銅網(wǎng)、氟板（

43、聚四氟乙烯）、鋁板冷凍槽：廣口液氮罐、液氮槽鋼匙、鑷子、低溫溫度計冷凍方法：干冰埋藏法液氮熏蒸法,(六) 冷凍精液的程序,9、解凍檢查：活力0.3以上,七、精液冷凍保存技術(shù),,精液冷凍儀,七、精液冷凍保存技術(shù),（七）顆粒凍精的制作,七、精液冷凍保存技術(shù),1 冷凍條件,冷源：液氮或干冰冷凍面：可以用銅網(wǎng)、聚四氟乙烯板、鋁板等冷凍溫度：-98—- -110 ℃液氮槽,七、精液冷凍保存技術(shù),2 顆粒凍精制作流程,冷凍面的預(yù)冷：

44、將冷凍面放入液氮中浸數(shù)分鐘，待不再有大量氣體放出時，取出，架在液氮面上1.5cm高處，數(shù)分鐘后即可冷凍。凍前精子活力檢查：平衡的精液應(yīng)進(jìn)行活力檢查，如果活力合格方可滴凍。滴凍：預(yù)冷至2-4 ℃的滴管吸取精液，均勻地滴在冷凍板上，并使之間距為一個顆粒直徑。每個顆粒0.1ml。,七、精液冷凍保存技術(shù),2 顆粒凍精制制作流程,滴凍練習(xí)：每次用取樣器取1ml精液，將其滴成10個大小相等的顆粒。熏蒸：一塊冷凍板滴滿后，可將冷凍板面加蓋（也可

45、不加）。將冷凍板浸入液氮：并用預(yù)冷后的不銹鋼勺將顆粒鏟下，倒入下面的網(wǎng)面上。將紗布袋浸入液氮中，將一塑料漏斗口插入紗布袋中。取出液氮中的紗網(wǎng)將顆粒凍精倒入漏斗中。,七、精液冷凍保存技術(shù),2 顆粒凍精制制作流程,取樣解凍檢查精子活力。將紗布袋口抽緊，在袋口的線上作好標(biāo)記。將提漏從液氮罐中取出，放入液氮槽中，將紗布袋放入提漏中。將提漏迅速放入液氮罐中。,七、精液冷凍保存技術(shù),3 顆粒凍精液制作要求,形狀一致，不連片，大小均勻，體積

46、0.1ml無氣泡（在液氮中不漂浮）解凍后活力0.3以上總有效精子數(shù)1200萬個（牛）每ml中不得檢出大腸桿菌,七、精液冷凍保存技術(shù),（八）細(xì)管凍精的制作,七、精液冷凍保存技術(shù),1 細(xì)管凍精的優(yōu)點,封閉包裝，衛(wèi)生安全：保存、輸精時不與外界接觸便于標(biāo)記取出方便：直接用鑷子夾取解凍方便：直接投入水浴中解凍輸精方便：可安裝在專用的輸精槍內(nèi)輸精,七、精液冷凍保存技術(shù),2 細(xì)管凍精的缺點,制作成本高必須進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)才有意義,七、

47、精液冷凍保存技術(shù),3 細(xì)管分裝,常溫分裝：一次性稀釋后進(jìn)行分裝標(biāo)記，然后 進(jìn)行精液降溫與平衡 優(yōu)點：不需要低溫操作臺 缺點：對精子損害較大低溫分裝：在第二次稀釋后進(jìn)行分裝標(biāo)記，然 后進(jìn)行平衡，最后冷凍。 優(yōu)點：對精子損傷小，解凍后活力大 缺點：對設(shè)備要求高,七、精液冷凍保存技術(shù),4 細(xì)管凍精的冷凍,1、大口徑液氮罐冷凍 將平衡后的細(xì)管用毛巾擦凈，放入銅網(wǎng)上，將銅

48、網(wǎng)降至距液氮面10cm的高度10分鐘后沉入液氮中，取出分裝在提漏內(nèi)，放入液氮罐中。2、程序冷凍儀冷凍,七、精液冷凍保存技術(shù),5 細(xì)管凍精的要求,細(xì)管上要對供精者的場家、號碼、生產(chǎn)日期進(jìn)行標(biāo)記容量0.25,0.5,5ml不等，牛細(xì)管凍精一般為0.25ml每劑有效精子數(shù)1000萬個活力0.3以上其它同顆粒凍精,七、精液冷凍保存技術(shù),（九）凍精的解凍,解凍溫度：有冰水解凍，30-40 ℃解凍，高溫（50-75 ℃）解凍，以第二種方

49、法最常用解凍后溫度：5-8℃解凍后保存：在2-5℃下或冰瓶中可保存12小時以上。,七、精液冷凍保存技術(shù),1、解凍方法,濕解凍法：在試管中加入0.5-1ml解凍液，升溫到30-40 ℃，投入一粒凍精，搖動并取出干解凍法：先將試管預(yù)熱至30-40 ℃，投入凍精顆粒后，至融化一半時，取出加入20-30 ℃的解凍液細(xì)管凍精解凍：將細(xì)管從液氮罐或液氮槽中取出，投入30-40 ℃的水中至融化一半時取出用手搓至完全融化或用體溫解凍,七、精液冷

50、凍保存技術(shù),2、細(xì)管凍精的解凍,將水浴溫度調(diào)整到40 ℃將提漏提至罐口下3-5cm處，用鑷子夾住細(xì)管的超聲波封口端迅速移入水浴中不斷搖動，3-4秒后全部變色后取出，用手搓動使之全部解凍,七、精液冷凍保存技術(shù),3、顆粒冷凍精液的解凍,取2.9%的檸檬酸鈉0.5ml放入滅菌的平底試管中將試管放入40 ℃的水浴中預(yù)溫1分鐘將液氮倒入廣口保溫瓶或泡沫塑料槽中將液氮罐的提漏提至罐口下3-5cm處，看清標(biāo)記后，將紗布袋取出放液氮槽中將鑷

51、子放入液氮中預(yù)冷片刻，夾取顆粒凍精后，迅速投入試管中，并搖動試管，至凍精解凍至綠豆大小時取出，搖動至全部融化。,七、精液冷凍保存技術(shù),（十）冷凍精液的保存,凍精（顆粒）應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記：公畜名（號）、采精日期、容量。保持液氮罐中液氮面高度。接觸冷凍精液的用品都要進(jìn)行預(yù)冷。在凍精進(jìn)行轉(zhuǎn)移時，應(yīng)盡可能減少在空氣中暴露的時間。如果是顆粒凍精應(yīng)先移入液氮槽中再解凍。液氮罐應(yīng)放在涼爽通風(fēng)處，避免放在高溫或通風(fēng)不暢的地方。液氮罐在運輸中應(yīng)防止暴

52、曬和碰撞。,七、精液冷凍保存技術(shù),Embryo transfer20111010081,第二節(jié) 胚胎移植,一 胚胎移植概述二 胚胎移植的原理三 胚胎移植的技術(shù)程序四 牛的胚胎移植五 羊胚胎移植,第二節(jié) 胚胎移植,一、 胚胎移植概述,1.胚胎移植的定義2.胚胎移植的歷史3. 胚胎移植技術(shù)的意義,1.胚胎移植的定義,胚胎移植又稱受精卵移植，俗稱人工授胎或借腹懷胎，是指將雌性動物的早期胚胎，或者通過體外

53、受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。,2.胚胎移植的歷史,一、胚胎移植概述,1.1 初始階段：1890-1900 W.Heape將安哥拉兔和荷蘭兔的受精卵分別移植到比利時兔的輸卵管內(nèi)，分別獲得仔兔2只。,1.2 初級階段：1900-1950 主要由英美科學(xué)家在家兔、綿羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右。,,一、胚胎移植概述,1.3 發(fā)展階段：1950-1970

54、日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手術(shù)法移植成功。胚胎移植成功率達(dá)70-80%。,,一、胚胎移植概述,1.4 實用化初始階段：1970-1980 加美開始成立牛胚胎移植公司，1973年牛凍胚移植成功（英）。,,一、胚胎移植概述,1.5 實用化研究階段：1982大規(guī)模胚胎移植、核移植、嵌合體、胚胎分割、性別鑒定、體外受精在英美日德廣泛開展。克隆羊誕生。,,,一、胚胎移植概述,3 胚胎移植技術(shù)的意義,一、胚胎移植概述,從低產(chǎn)母畜

55、得到高產(chǎn)后代。加速引進(jìn)品種的繁殖和新品種的培育。比用現(xiàn)有品種進(jìn)行長期雜交育種更為經(jīng)濟(jì)有效。加速家畜改良進(jìn)度。通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)可使供體繁殖的后代增加7-10倍。增加雙胎率，加速繁殖。,使不孕母畜獲得生育能力，對因解剖或內(nèi)分泌缺陷而不能妊娠的母畜，可以根據(jù)具體情況專門作為供體或受體，繼續(xù)發(fā)揮其繁殖作用。促進(jìn)基礎(chǔ)理論方面的研究，為繁殖生理學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)、動物育種和進(jìn)化等方面開辟了新的試驗研究途經(jīng)

56、。滿足畜牧業(yè)現(xiàn)代化的需要。,3 胚胎移植技術(shù)的意義,一、胚胎移植概述,挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎移植技術(shù)越越來發(fā)揮出重要作用。胚胎移植技術(shù)是許多現(xiàn)代技術(shù)的基礎(chǔ)：如克隆技術(shù)、試管嬰兒、轉(zhuǎn)基因及動物生物反應(yīng)器研究。,3 胚胎移植技術(shù)的意義,一、胚胎移植概述,,,二、胚胎移植的原理,1.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)2.胚胎移植的基本原則,第二節(jié) 胚胎移植,,,激素同期發(fā)情,,,,,,,1 胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ),成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬

57、個卵泡，在外源激素作用下，每個發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達(dá)十多個。早期胚胎處于游離狀態(tài)。胚胎發(fā)育不存在免疫問題。胚胎發(fā)育到一定階段會與子宮發(fā)生生理和組織上的聯(lián)系。胚胎的遺傳性不受受體的影響。,二、胚胎移植的原理,2 胚胎移植的基本原則,胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性；供體和受體在分類學(xué)上的同屬性；動物生理上的一致性；受體和供體在發(fā)情時間上的同期性；動物解剖位置上的一致性；空間環(huán)境的一致性。胚胎的發(fā)育期限：必須處于周期黃體期內(nèi)

58、胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響,二、胚胎移植的原理,三、胚胎移植的技術(shù)程序,1. 供體和受體的選擇2. 供體的超數(shù)排卵3. 同期發(fā)情4. 供體母畜的配種5. 收集胚胎6. 胚胎的保存與培養(yǎng)7. 移植胚胎,第二節(jié) 胚胎移植,,1 供體和受體的選擇,供體應(yīng)具有相當(dāng)高的育種價值。供體生殖機(jī)能應(yīng)處于較高的狀態(tài)：產(chǎn)后60天以上，無生殖系統(tǒng)疾病，體質(zhì)強(qiáng)健。受體應(yīng)容易購買，繁殖性能好，對地方適應(yīng)性強(qiáng)，體

59、型中上等，非優(yōu)良品種。受體健康狀況良好，已進(jìn)入發(fā)情季節(jié)。供受體發(fā)情時間應(yīng)接近或一致。,三、胚胎移植的技術(shù)程序,2 供體的超數(shù)排卵,通常用于單胎家畜，其主要目的是讓優(yōu)良母畜排出大量卵子，充分發(fā)揮繁殖潛能。通常采用PMSG或FSH，以促進(jìn)卵泡的發(fā)育。第一次配種后靜脈注射hCG或LH，可排出多數(shù)卵子。,三、胚胎移植的技術(shù)程序,,3 同期發(fā)情,為了胚胎移植成功，使供體受體發(fā)情同期化，讓兩者的生殖器官處于相同的生理階段是必須的步驟。發(fā)情時間

60、應(yīng)該控制在12h之內(nèi)。誘發(fā)同期發(fā)情的首選理想藥物為PGF2α及其類似物。,三、胚胎移植的技術(shù)程序,4 供體母畜的配種,必須用優(yōu)秀的種公畜進(jìn)行多次配種，一般隔8-12小時進(jìn)行一次配種，直到發(fā)情結(jié)束。配種前應(yīng)對種公畜的精液進(jìn)行質(zhì)量檢查。當(dāng)優(yōu)秀種公畜不足時，可考慮首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。,三、胚胎移植的技術(shù)程序,5 收集胚胎,胚胎沖洗液的配制：杜氏磷酸緩沖液PBS，布林斯特液SOF合成輸卵管液。手術(shù)法收

61、集胚胎輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚子宮角沖胚非手術(shù)法收集胚胎二路法三路法,三、胚胎移植的技術(shù)程序,收集到的沖洗液靜置，沖洗液分離。揀胚：將胚胎移至培養(yǎng)液或保存液中。胚胎鑒定：根據(jù)透明帶、胚胎細(xì)胞、發(fā)育階段及細(xì)胞在透明帶中的比例確定胚胎級別。,三、胚胎移植的技術(shù)程序,,胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長其體外生存時間。體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育。胚胎冷凍：通過一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后

62、，保存于液氮中。,6 胚胎的保存與培養(yǎng),三、胚胎移植的技術(shù)程序,手術(shù)法移植（羊、犬、豬）非手術(shù)法移植（牛）,7 胚胎移植,三、胚胎移植的技術(shù)程序,1 供體牛的選擇2 超數(shù)排卵處理3 采卵（胚）,4 檢卵（胚）5 胚胎的鑒定和分級6 胚胎的移植,第二節(jié) 胚胎移植,四、牛的胚胎移植,應(yīng)符較高的生產(chǎn)性能。1.5～8歲，體格健壯，無遺傳性疾病，繁殖機(jī)能正常。產(chǎn)犢記錄清楚，無流產(chǎn)史，產(chǎn)后有兩次正常發(fā)情記錄。生殖器官正常，無繁殖疾病

63、。重復(fù)超數(shù)排卵間隔60d左右。最多連續(xù)處理4次后，自然繁殖后再使用。凡2次超數(shù)排卵反應(yīng)差的母牛不再用作供體。應(yīng)選擇性情溫順的母牛作供體，以便于操作。,四、牛的胚胎移植,1 供體牛的選擇,,2 超數(shù)排卵處理,四、牛的胚胎移植,2.1 FSH法,四、牛的胚胎移植,,,2.2 PMSG法,孕馬血清促性腺激素(PMSG)處理法 在情期的11～12d，一次肌注PMSG2500～3000IU，48h后宮注PGF2α2.4mg。發(fā)情后

64、約18h肌注等量的抗PMSG。,四、牛的胚胎移植,2.3 發(fā)情觀察和配種,PGF2α處理后40～48h，大部分處理牛發(fā)情。通常要求從注PG第2天傍晚開始觀察發(fā)情，至少早晚各觀察一次。在觀察到接受爬跨后4～6h進(jìn)行第一次輸精，間隔12h后第二次輸精。每次有效精子數(shù)不得少于50×106，輸入兩側(cè)子宮角或子宮體。注意輸精時不得觸摸卵巢。,,四、牛的胚胎移植,3 采卵（胚）,四、牛的胚胎移植,3.1 采卵時間,以發(fā)情日為第0d，在第5

65、～6d檢查卵巢確定黃體數(shù)，以便于安排受體頭數(shù)。第7d(或第6～8d)非手術(shù)回收卵。,四、牛的胚胎移植,3.2 器械和沖卵液的準(zhǔn)備,滅菌處理過的沖卵管用PBS液沖洗2～3次，插入鋼芯，檢查氣球。在無菌間用導(dǎo)管連接吊瓶和集卵杯灌流裝置。裝入PBS液的吊瓶在37℃水浴中預(yù)溫待用。準(zhǔn)備好必要的麻醉劑、注射器、酒精棉球和沖洗消毒劑等。,四、牛的胚胎移植,3.3 供體牛的保定和麻醉,供體牛保定完畢后，在第一、二尾椎骨間酒精消毒，用2%普魯卡因3～5

66、ml作硬膜外麻醉，或肌注2%靜松靈l ml。,四、牛的胚胎移植,3.4 外陰清洗、消毒,麻醉后將牛尾豎直綁在保定架上，清除糞便，用清水沖洗會陰部及外陰，再用高錳酸鉀液沖洗消毒，用滅菌衛(wèi)生紙擦干，最后用酒精棉球消毒外陰部。,四、牛的胚胎移植,3.5 沖卵管的插入和沖卵部位,助手將準(zhǔn)備好的沖卵管交給術(shù)者的右手，術(shù)者左手食指和拇指壓開陰門插入沖卵管，再將左手伸入直腸，仔細(xì)小心地誘導(dǎo)沖卵管經(jīng)子宮頸進(jìn)入一側(cè)子宮角至大彎處，抽出少許鋼芯，再將沖卵管

67、向前推，使其尖端靠近子宮角深部。由助手持30ml注射器一次推入10ml空氣，然后按術(shù)者要求，以1ml計數(shù)充氣。根據(jù)子宮大小及沖卵管在子宮的位置確定充氣量，一般青年牛充氣14～16ml，經(jīng)產(chǎn)牛為18～25ml。沖卵管固定后抽出鋼芯，開始灌流。,四、牛的胚胎移植,3.6 灌流方法,將吊瓶掛在距外陰部1.0m高處，接通三通管(Y型)和沖卵管。術(shù)者用右手控制進(jìn)流和出流開關(guān)，每次灌注30～50ml，由少到多，每側(cè)總量為300～500ml。左手通過

68、直腸輔助按摩子宮角。每側(cè)子宮角沖8～10次。或者用50ml注射器，每次注入30～50ml的PBS沖卵液，分次沖洗子宮角，回收后注入加蓋量筒。另一側(cè)子宮角的沖洗是由術(shù)者右手拉直沖卵管，助手小心插入鋼芯。術(shù)者的左手在直腸內(nèi)誘導(dǎo)鋼芯插穩(wěn)后，給氣球放氣。術(shù)者再將沖卵管插入另一側(cè)子宮角，用同樣的方法沖洗。全過程需在室溫(20℃左右)操作。,四、牛的胚胎移植,,,,,,,,,,,,四、牛的胚胎移植,3.7 術(shù)后處理,兩側(cè)子宮角沖卵完成后，從氣球放出