葡萄糖耐量的試驗

1、實驗目的,掌握測定血清葡萄糖濃度的原理掌握血糖變化的臨床生理意義掌握口服葡萄糖耐量試驗的原理，適用人群和臨床意義。,,臨床上OGTT主要適用于下列情況：（1）無糖尿病癥狀，空腹血糖異常，或偶爾出現糖尿，或有明顯糖尿病家族史者；（2）有糖尿病癥狀，血糖水平不夠糖尿病診斷標準者；（3）妊娠期或甲狀腺功能亢進出現糖尿者；（4）不明原因腎病與視網膜病者。,實驗原理,葡萄糖耐量試驗（OGTT）是一種葡萄糖負荷試驗，用于檢查人體胰島素B細胞功能

2、和機體對糖的調節(jié)能力。正常人進食后血糖都會暫時性升高，30~60分鐘后可升到最高峰，但一般不超過8.9mmol/L，2小時左右又會回到空腹水平。這種現象稱為耐糖現象。若內分泌失調或神經系統功能紊亂，則調節(jié)功能失常，食入大量糖后血糖濃度可急劇上升，短時間不能恢復到原值，稱為耐糖失?，F象。所以觀察耐糖現象可以了解調節(jié)血糖的各種機能是否健全。,,血清葡萄糖濃度測定方法1、GOD-POD法：以過氧化物酶作指示酶的偶聯酶反應定量法。葡萄糖氧化

3、酶（GOD）利用氧將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，同時釋放過氧化氫。過氧化物酶（POD）催化過氧化氫氧化色素原（如4-氨基安替比林和苯酚），并使色素原氧化成色素，即Trinder反應。紅色醌類化合物的生成量與葡萄糖含量成正比。,反應方程式：,GOD 葡萄糖+O2+H2O———— 葡萄糖酸+2H2O2 POD2H2O2+4-氨基安替比林+苯酚————紅色

4、醌類化合物,,葡萄糖氧化酶法是利用葡萄糖氧化酶氧化β葡萄糖產生葡萄糖酸和雙氧水的反應而建立。血糖的酶法測定是利用酶的特異性催化而建立起來的，具有高度的特異性，同時，可以避免使用化學方法中的一些有害試劑等。操作過程簡便，便于自動化檢測,,2、鄰甲苯胺法：葡萄糖為一含醛基的己糖，在酸性條件下加熱，可脫水生成5-羥甲基-2-呋喃甲醛，后者與鄰甲苯胺縮合成青色的Suchiff堿。 Suchiff堿顏色的深淺與樣品中葡萄糖的含量成正比與進行同

5、樣處理的標準葡萄糖液相比較，即可求出樣品中葡萄糖的含量。由于鄰甲苯胺只與醛糖作用顯色，故此種測定方法不受血液中其他還原物質的干擾，測定時也無需除去血漿或血清中的蛋白質。,反應方程式：,[H+]葡萄糖——5-羥甲基-2-呋喃甲醛+3H2O 加熱5-羥甲基-2-呋喃甲醛+鄰甲苯胺——Schiff堿+H2O

6、 青色,3、其他方法舉例 福林—馬爾露斯（Folin-Malmors）超微量法：在熱堿溶液中的葡萄糖可將高鐵氰化鉀還原為低鐵氰化鉀，后者再與硫酸高鐵鹽作用生成亞鐵氰化鐵（普魯士藍），與同樣處理的葡萄糖標準液進行比色，即可求出血糖含量。 其反應如下：,血糖測定方法歸納,血糖的測定方法按測定原理可分為無機化學方法、有機化學方法和生物化學方法三類。此外，還有固相酶法、電化學法及質譜法等。常用的是分光光度法和酶學方法。分光光度

7、法中常見的是鄰甲苯胺法，是利用葡萄糖在加熱的有機酸溶液中與某些芳香族胺類，可生成有色衍生物這一原理建立的。酶學方法有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖脫氫酶法等。(己糖激酶法)原理是用已糖激酶催化葡萄糖同ATP反應，產生葡萄糖－6－磷酸及ADP，葡萄糖－6－磷酸在葡萄糖－6－磷酸脫氧酶存在時，同NADP＋作用．產生NADPH及6—磷酸葡萄糖酸內酯，NADPH在340nm有吸收峰。,應用鄰甲苯胺法測定血糖濃度來檢測葡萄糖耐量,,實驗試劑：

8、,1．鄰甲苯胺試劑   鄰甲苯胺為略帶黃色的油狀液體，易氧化，配置時易重蒸餾，收集199—201℃時無色或淺黃色的餾出液。取硫脲2.5g，溶解于750mL冰醋酸中，再將此溶液移入1000mL容量瓶，加鄰甲苯胺150mL、2.4%硼酸100mL，然后加冰醋酸至刻度。2．12mmol/L苯甲酸溶液 稱取苯甲酸2.5g，加入蒸餾水1000ml,加熱助溶，冷卻后儲存于試劑瓶中。 3.葡萄糖標準貯存液（10mg/

9、mL）  準確稱取無水葡萄糖1.0000g,用飽和苯甲酸溶液溶解，移至100ml容量瓶中，稀釋至刻度。 4．葡萄糖標準應用液（1mg/mL） 用飽和苯甲酸溶液將葡萄糖標準儲存液溶液稀釋10倍。,實驗步驟：,受試者前三天正常飲食，停用影響血糖的各種藥物，如胰島素、腎上腺皮質素、兒茶酚胺等。試驗前1天晚餐后即不再進食（即空腹10~14小時）。次日清晨空腹抽靜脈血2ml（稱為空腹血漿血糖，即FPG），然后將75g葡萄糖

10、溶于200 ~300ml溫開水中（兒童按每千克體重1. 75g），令受試者5min內服 下。服后0.5小時、1小時、1.5小時、2小時各抽一次血，取七支試管按下表操作：,測定血清中血糖濃度方法：取三支試管，按表操作,混勻，置沸水浴中煮沸15分鐘，取出冷卻后用分光光度計在波長630nm處，以空白調零，讀取標準管和測定管的吸光度。,計算公式：,,應用GOD-POD法測定血糖濃度來檢測葡萄糖耐量,實驗器材與試劑：,器材：5ml移液管5

11、0或100ul微量可調式移液器721E分光光度計1cm比色皿37℃恒溫水浴,,試劑：1、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0） 稱取無水磷酸氫二鈉8.67g及無水磷酸二氫鉀5.3g溶于蒸餾水800ml中，調pH7.0，定容至1L。2、酶試劑 取過氧化物酶12000U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，置4℃保存，可穩(wěn)定存放3個月。3、酚溶液 稱取重蒸餾酚100mg溶于

12、蒸餾水100ml中，用棕色瓶貯存。4、酶酚混合試劑 將酶試劑及酚溶液等量混合，4℃可以存放1個月。,,5、12mmol/L苯甲酸溶液 取苯甲酸1.4g，于800ml蒸餾水中加溫助溶，冷卻后加蒸餾水定容至1L。6、葡萄糖標準貯存液（100mmol/L） 稱取已干燥恒重的無水葡萄糖1.802g，溶于約70ml 12mmol/L苯甲酸溶液中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h后方可使用

13、。（防止氧化的作用 ，葡萄糖為單糖，含醛基，易氧化成羧基，加入苯甲酸，平衡向左移動 ）7、葡萄糖標準工作液（5mmol/L） 吸取葡萄糖標準貯存液5.00ml放于100ml容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度，混勻。,實驗步驟：,受試者前三天正常飲食，停用影響血糖的各種藥物，如胰島素、腎上腺皮質素、兒茶酚胺等。試驗前1天晚餐后即不再進食（即空腹10~14小時）。次日清晨空腹抽靜脈血2ml（稱為空腹血漿血糖，即FPG

14、），然后將75g葡萄糖溶于200 ~300ml溫開水中（兒童按每千克體重1. 75g），令受試者5min內服 下。服后0.5小時、1小時、1.5小時、2小時各抽一次血，取七支試管按下表操作：,,,混勻，置37℃水浴中，保溫15min，在波長510nm處比色，以空白管調零，讀取標準管及測定管吸光度。然后分別計算出葡萄糖濃度C0、C1、C2、C3、C4。計算公式: 血清葡萄糖（mmol/L）=（A測定/A標準）*5將各次血

15、糖測定結果，與相應的時間繪制成糖耐量曲線圖，以便進行分析。,注意事項：,實驗前受試者應充分休息，避免體力活動，試驗中亦不能吸煙、喝咖啡，以免影響實驗結果。葡萄糖氧化酶對β-D葡萄糖高度特異，溶液中葡萄糖約36%為α型，64%為β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的變旋反應。新配制的葡萄糖標準液主要是α型，故需放置2h以上（最好過夜），待變旋平衡后方可應用。,,葡萄糖氧化酶法可以直接測定腦脊液葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡萄糖含量。因

16、為尿液中尿酸等干擾性物質濃度過高，可干擾過氧化物酶反應，造成結果假性偏低。因紅細胞的酵解將導致測定結果偏低，建議測定樣品以草酸鉀-氟化鈉做抗凝劑以抑制糖酵解。嚴重黃疸、溶血及乳糜樣血清應先制備無蛋白血濾液，然后再進行測定。,臨床意義：,生理性高血糖可見攝入高糖食物后，或情緒緊張腎上腺素分泌增加時。病理性高血糖 （1）糖尿?。翰±硇愿哐浅Ｒ娪谝葝u素絕對或相對不足的糖尿病患者。 （2）內分泌腺功能障礙：甲狀腺功能亢進、腎上腺

17、皮質功能及髓質功能亢進，引起的各種對抗胰島素的激素分泌過多，或升高血糖的激素增多引起的高血糖，現已歸入特異性糖尿病中。,,（3）顱內壓增高：顱內壓增高刺激血糖中樞，如顱外傷、顱內出血、腦膜炎等，引起血糖增高。（4）脫水引起的高血糖：如嘔吐、腹瀉和高熱等也可使血糖輕度增高。生理性低血糖：見于饑餓和劇烈運動。病理性低血糖：特發(fā)性功能性低血糖最多見，依次是藥源性、肝源性和胰島素瘤等。,臨床判斷：,正常耐糖量：空腹血糖<6.1mm

18、ol/L，口服1小時內血糖值升高至最高峰，但不超過11.1mmol/L，2小時后血糖水平（2hPG）基本恢復空腹水平，即2hPG<7.8mmol/L。各次尿液中均未檢出糖?？崭寡菗p害（IFG）：6.1mmol/L≤FPG＜7.0mmol/L，2小時后血糖水平＜7.8mmol/L。糖耐量減退（IGT）:FPG＜7.0mmol/L以及7.8mmol/L≤2hPG＜11.1mmol/L。,,糖尿?。篎PG≥7.0mmol/L,2h

19、PG≥11.1mmol/L。耐量增加 見于腎上腺皮質功能減退患者，垂體前葉功能減退、甲狀腺功能減退及胰島素分泌過多。其曲線特征是：（1）空腹血糖值低于正常值；（2）服糖后不出現血糖高峰；（3）1小時內血糖即可恢復原值。,,腎性糖尿，耐糖量曲線屬正常，服糖后出現糖尿，此現象稱為腎性糖尿。 16 14mmol/L 12糖耐量正常 10糖耐量減退

20、 8空腹血糖損害 6糖尿病性他糖量 4 2 0 30 60 90 120 測定時間（min）,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,目前國內醫(yī)院多采用葡萄糖氧化酶法和鄰甲苯胺法測定血糖。前