《體內(nèi)藥物分析》

1、第五章體內(nèi)藥物分析,體內(nèi)藥物分析是指體內(nèi)樣品中藥物、代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)的定量分析。,其中血樣是體內(nèi)藥物分析的主要樣品體內(nèi)藥物分析是測定以上樣品中： 1. 原型藥物 2. 代謝產(chǎn)物 3. 內(nèi)源性活性物質(zhì) 4. 結合物（綴合物） 5. 結合藥物,體內(nèi)藥物分析,體內(nèi)樣品：生物體液、頭發(fā)、臟器和組織。,體內(nèi)藥物分析經(jīng)常用于： 1. 藥代動力學研究（PK） C-

2、t曲線 2. 代謝組學研究 3. 臨床治療藥物檢測（TDM） 4. 新藥研究中藥理、藥效、毒性試驗（臨床前試驗研究）,對體內(nèi)樣品（生物樣品）進行檢驗,研究生物體內(nèi)藥物濃度、存在狀態(tài)、生物利用度.,涉及到藥物體內(nèi)作用機制探討、藥物質(zhì)量、安全性、有效性評價及臨床合理用藥。,體內(nèi)樣品性質(zhì)特點： 1. 采樣量少 數(shù)ml ～數(shù)十 μl 2. 待測濃度低 10-9 ～ 10-6 g/ml,甚至10-12 g/ml

3、3. 干擾物之多 內(nèi)源性物質(zhì),體內(nèi)藥物分析的特點： 1. 樣品需經(jīng)分離和濃集或化學衍生化 2. 要求分析方法靈敏度高、專屬性強 3. 分析工作量大，結果數(shù)據(jù)處理繁雜,主要常用測定方法：色譜法、免疫學法、生物學法,如：GC、HPLC、LC-MS、LC-MS/MS、 LC-TOF-MS,建立可靠的和可重復的定量分析方法是進行體內(nèi)樣品分析的基礎，為保證方法的可行性、可靠性，建立的分析方法在用于實際樣品

4、分析前，必須進行充分地方法學驗證,生物樣本：生物體的任何臟器組織、體液均可作為生物樣本.常用樣本:血液（血漿、血清或全血）、尿液、唾液、毛發(fā),一.體內(nèi)樣品種類,,第一節(jié) 常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏,二、體內(nèi)樣品的采集和制備（一）血樣 適用－藥物藥動學研究、生物利用度、治療藥物檢測等研究與實際工作。,血藥濃度通常指血漿、血清中的濃度。其中的血藥濃度能夠反映藥物在體內(nèi)（靶器官）的狀況。是體內(nèi)藥物分析最常用的樣本,1.血樣采集,動物

5、(采血不得超過總量的1/10）人：靜脈采血1-5ml,2.血漿的制備：將采取的全血置含有抗凝劑（肝素）的試管中，混勻1000×g離心力5-10min，使血細胞分離，分取上清液為血漿,3.血清的制備：采血后在室溫下至少放置30min-1h，凝結出血餅，剝?nèi)パ灒?1000×g離心力離心5-10min，分取上清液為血清。,血漿和血清中藥物濃度值通常是相同的，血漿比血清分離快，且制取量多（全血的50%～60%）,4.全血

6、的制備：加抗凝劑采血不離心，放置室溫后可分層，上層血漿下層血細胞。 測定血細胞內(nèi)、外藥物濃度，血漿藥物濃度波動大、濃度低時應考慮用全血。,貯藏,采血后及時分離。短期保存：4℃長期保存： -20℃或-70~-80℃全血未經(jīng)分離不宜冷凍,適用－藥物劑量回收、腎清除率和生物利用度測定、藥代動力學研究等.,體內(nèi)藥物的清除主要通過尿液的排出。藥物可以原型或代謝產(chǎn)物及綴合物等形式排出。,(二) 尿液,尿液中藥物濃度高，收集量大、方便。但

7、尿液濃度通常變化較大。,采樣后應立即測定。否則應加入防腐劑或冷藏,尿液中藥物濃度與血藥濃度相關性差；不宜采樣的人群：腎功能不良者、兒童,(三) 唾液,唾液pH值在6.2-7.4；含有粘蛋白約為血漿的1/10、電解質(zhì)含量同細胞外液，粘度是水的1.9倍。采樣后經(jīng)放置后除去泡沫后， 以3000r/min離心10min分離，分取上清液作為藥物濃度測定的樣品。,唾液作為樣品測定藥物濃度優(yōu)點：采樣容易；有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物

8、濃度。但與血漿藥物濃度相比易變動；濃度低需高靈敏度監(jiān)測儀器。,一些藥物的唾液濃度S與血漿濃度P呈密切相關，因此在TDM中測S替代 P。,(四) 組織常用的臟器組織：胃、肝、腎、心、腦等 1. 樣品的制備 先制成勻漿液━━萃取藥物 2.樣品處理 ①沉淀蛋白法 ②酸水解或堿水解法 ③酶水解法,,(五) 毛發(fā)（頭發(fā)）,適用：微量元素測定方法：有機破壞法 濕法破壞 干法破壞

9、 氧瓶燃燒法,測定方法為原子吸收分光光度法和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法。,第二節(jié)、體內(nèi)樣品分析的前處理技術,1. 使藥物游離，使蛋白結合型的藥物中釋出來測定,2. 滿足測定方法的要求 分離與濃集,3. 改善分析環(huán)境 保護儀器性能，如HPLC色譜柱,方法：（1）去蛋白質(zhì) （2）分離、純化、濃集　　?。?）綴合物水解 （4）化學衍生化,一、體內(nèi)樣品預處理的目的,二、常用體內(nèi)樣品處理方法,一般在測定前

10、預處理:分離、濃集或改性,（一）蛋白質(zhì)的去除,① 溶劑沉淀法 加入與水混溶的有機溶劑（1:2~3） ——溶液D 、蛋白質(zhì)分子間靜電引力 而聚集；與蛋白質(zhì)氫鍵變化而凝聚；親水性溶劑的水和作用使蛋白質(zhì)脫水而析出，使藥物釋放。 常用溶劑乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃等離心分離，高速離心機（ ～15000×g ，5min） 上清液偏堿（pH8.5 ～ 9.5）,,,② 中性鹽析法

11、 加入中性鹽（1:2混合）——“鹽析”沉淀蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)脫水而沉淀；離子強度發(fā)生變化使蛋白質(zhì)分子間電排斥作用減弱而凝集。 常用的中性鹽有：硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等。 高速離心機離心約2min分離上清液近中性pH7.0 ～ 7.7,③ 加入強酸（1:0.6混合） ——與蛋白質(zhì)陽離子(銨基)形成不溶性鹽沉淀常用的強酸：10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等。（高速離心機離心約2min ）上清液近呈酸

12、性pH 0 ～ 4。不適宜在酸性中分解的藥物。,④ 熱凝固法 要求藥物熱穩(wěn)定好，通常加熱至90℃ ，使熱變性蛋白沉淀，高速離心或過濾法除去。 方法最簡單，只能除去熱變性蛋白。,（二）分離純化與濃集,①液相萃取法（LLE)　新方法新技術： ②固相萃?。⊿PE)　 ③超濾法,一般濃集方法：①使被測組分提取體積?、趽]去提取溶劑（使用尖錐形試管）殘渣復溶于小體積 通入氮氣（氮吹儀）

13、；減壓揮干溶劑,,1.液-液萃取法（LLE）,對有機溶劑的要求:①對藥物分子未電離的可溶、電離的不溶 ②沸點低易揮發(fā)③與水不相溶④無毒、不乳化。⑤較高穩(wěn)定性、惰性⑥不影響紫外檢測 常用：乙醚、三氯甲烷、異丙醇,多數(shù)藥物：弱極性、親脂性強。多為堿性內(nèi)源性雜質(zhì)：強極性、水溶性強。酸性 根據(jù)溶劑、藥物、內(nèi)源性雜質(zhì)的極性、酸堿性，選擇合適

14、的溶劑分離雜質(zhì)、純化樣品。,注意的問題,①pH值影響：多數(shù)藥物是親脂性的堿性物質(zhì)。內(nèi)源性雜質(zhì)多為酸性，故在堿性條件（pH高于pKa1～2 pH單位)下乙醚提取 ；酸性藥物則在酸性條件 （pH低于pKa1～2 pH單位)下提取，可使90%的藥物以非電離形式存在。但一般多在堿性條件下提取，減少內(nèi)源性物質(zhì)干擾。,②有機相與水相樣品溶劑比（1:1~2）,③一般只提一次。若雜質(zhì)不易除去，可將有機相再用堿水（酸性藥物）或酸水（堿性藥物）反提。再用

15、有機溶劑提取。,對堿性中不穩(wěn)定的藥物或中性藥物，在中性pH處用三氯甲烷和異丙醇提取。,①選擇性和低廉的運行成本（有機溶劑選擇性高，本法的選擇性亦高）②可對樣品凈化和濃集（能與多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)分離）③易乳化,LLE法的特點：,2. 固相萃?。⊿PE）——規(guī)模縮小的柱色譜,將具有吸附、分配、交換性質(zhì)的擔體作為萃取劑填入小柱制成,體內(nèi)樣品處理。,微型柱的使用：溶劑淋洗 生物樣品上柱（藥物及內(nèi)源性物質(zhì)同時被保留到固定相上）,

16、,,,洗脫雜質(zhì) 洗脫藥物,,（1）固相萃取法的原理,常用于SPE填充柱填料大致分為兩類：第一類為親脂型：大型吸附樹脂、親脂性鍵合硅膠,第二類為親水性型：硅膠、硅藻土、棉纖維。,,第三類為離子交換型,例如：Bond Elut微型柱——極性、非極性硅膠 Sep-pak系列微型柱——C18等填料,微型柱使用的一般步驟：步驟１：用有機溶劑如甲醇，預先濕潤微型柱，使增加填料與待測物相互作用的表面積，并

17、可除去可能干擾分析的填料殘留物。步驟２：用色譜純的水或合適的溶劑沖洗，除去過多的甲醇，并為樣品提供表面積。步驟３：進樣，通過微型柱廢液棄去。步驟４：用水或合適溶劑洗柱，選擇性地除去將會干擾后面色譜分析的內(nèi)源性雜質(zhì)步驟5:用合適的溶劑洗脫樣品，收集，洗脫液用于后面的分析測定或進一步研究。,SPE優(yōu)點： （與LLE相比）引入雜質(zhì)少；消除乳化現(xiàn)象；提取效率高；樣品用量小(50 ～ 100 μl)；處理樣品快速；適宜處理揮發(fā)性及不穩(wěn)定

18、性的藥品；溶劑安全。,3.超濾法 ——以多孔半透膜（超濾膜）為分離介質(zhì)的一種膜分離技術。 血清中的游離藥物測定可采用分子量截留值在5萬左右的超濾膜，以加壓過濾或高速離心法將游離藥物和血漿蛋白分離。 簡便快捷，結果穩(wěn)定可靠，已成為首選方法。 優(yōu)點：不引入化學試劑、無相態(tài)變化、對待測藥物破壞小。,,（三）綴合物的水解,尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài).

19、 含羥基、羧基、氨基和巰基的藥物，可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸 葡萄糖醛酸甙綴合物。 含酚羥基、芳胺及醇類藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸 綴 硫酸酯綴合物。 由于綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機溶劑提取。為測定尿液中藥物總量,需將綴合物中藥物釋出.,1. 酸水解 HCl 2. 酶水解 葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶 3. 溶劑解法,,,① 使藥物變成具有被分離的性

20、質(zhì)?、凇√岣邫z測靈敏度?、邸≡鰪娝幬锏姆€(wěn)定性 ④　提高對光學異構體分離能力,,（四）化學衍生化,含有活潑H如： —COOH、 —OH、 — NH2、—NH—、—SH等官能團,化學衍生化對GC和HPLC尤為重要。,１.ＧＣ中化學衍生化法　　衍生化可使藥物分子中的極性基團，如羥基、氨基、羧基等變成無極性的、易于揮發(fā)的藥物，從而使ＧＣ的溫度不必很高即可適合ＧＣ的分析要求。 主要的衍生化反應有硅烷化、?；⑼榛?、不對稱衍

21、生化等。其中以硅烷化用得最廣泛。,具有光學異構體的藥物。具有不同的藥效和藥動學特性，因此，異構體的分離也是十分重要的。采用不對稱試劑，使其生成非對映異構體衍生物，然后用GC法或HPLC法進行分析測定。,當采用HPLC法時，其衍生化的目的是為了提高藥物的檢測靈敏度。一些在紫外、可見光區(qū)沒有吸收或者摩爾吸收系數(shù)小的藥物，可以使其與衍生成對可見－紫外檢測器、熒光檢測器及電化學檢測器等具有高靈敏度的衍生物。,按衍生化反應的方式可分為：

22、 色譜柱柱前衍生和柱后衍生兩種,２.ＨＰＬＣ中化學衍生化法,柱后衍生化： 藥物經(jīng)色譜柱分離之后進行的，可形成對檢測器具有高靈敏度的衍生物，從而提高了選擇性。ＨＰＬＣ常用的衍生化試劑有鄰苯二醛、丹酰氯、熒胺等。,柱前衍生化： 分離前使藥物與衍生化試劑反應，故與藥物具有相同官能團的雜質(zhì)也會同樣生成衍生，這樣就有可能妨礙藥物的檢測。同時，如果雜質(zhì)含量多時，藥物與衍生化試劑的反應率降低，因此應盡可能將藥物進行精制后再衍生化

23、,柱后衍生的例子： 氨基酸分析儀，氨基酸分別從色譜柱分離流出后，與顯色劑茚三酮相遇，在一定條件下，發(fā)生顯色反應，生成有色的衍生物，在440nm和570nm處被檢測。,衍生化方法：1.紫外衍生化 在紫外無吸收或吸收系數(shù)很小的化合物與具有紫外吸收基團的衍生化試劑反應2.熒光衍生化 在紫外無吸收或檢測不靈敏的藥物與熒光試劑反應成強熒光衍生物3.手性衍生化 用手性衍生化試劑將藥物手性異構體變?yōu)榉菍τ钞悩嬻w，用常規(guī)HPL

24、C分離分析,,第三節(jié)、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗證,一、分析方法的建立（一）分析方法的選擇1.色譜分析法 LC-TOF-MS2.免疫分析法3.生物學方法（二）分析方法建立的一般程序1.色譜條件的篩選2.色譜條件的優(yōu)化3.實際樣品的測試,,1.色譜條件的篩選①取樣：待測藥物、代謝物、內(nèi)標物（內(nèi)標法）等的對照品②測定：按擬定方法（不包括體內(nèi)樣品預處理）測定③調(diào)整色譜條件：色譜柱、流動相、溫度、進樣量、濃度④滿足：良好的

25、色譜參數(shù)（n、R、T）；適當?shù)腞t以避開干擾：選擇檢測器的靈敏度以獲得方法的靈敏度（LOQ）,,2.色譜條件的優(yōu)化（1）試劑與溶劑試驗：取待測藥物的非生物介質(zhì)溶液，按擬定的方法進行衍生化反應、萃取分離等預處理。通過改變條件（衍生化、萃取條件、溶劑極性和配比等） 考察反應試劑對測定的干擾（無衍生化、萃取則不作該考察）（2）生物介質(zhì)試驗：取空白生物介質(zhì)按預處理方法操作?？疾焐锝橘|(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。在“信號窗”內(nèi)不應出現(xiàn)內(nèi)源性

26、物質(zhì)信號。,,（3）質(zhì)控樣品試驗（quality control，QC試驗） 取空白生物介質(zhì)，按實際體內(nèi)預期濃度范圍，加入待測藥物的標準物制成標準樣品和質(zhì)控（QC）樣品，照生物介質(zhì)試驗項下方法試驗。 完成以下各項驗證及評價： ①建立標準曲線；②定量范圍；③準確度；④精密度；⑤靈敏度；⑥提取回收率；⑦樣品穩(wěn)定性 色譜峰的n、R、T是否與水溶液一致；色譜峰是否為單一成分；標準曲線的截距是否顯著偏離零點等，以說明內(nèi)源性

27、物質(zhì)是否干擾。,3.實際樣品的測試：方法建立后，需對實際樣品進行測試，考察實際干擾情況，進一步驗證方法的可行性。,,二、分析方法的驗證（一）特異性（二）標準曲線與定量范圍（三）定量下線（ LLOQ ）（四）準確度與精密度（五）樣品穩(wěn)定性（六）提取回收率 ……（十一）名詞解釋,,（六）提取回收率 指從生物介質(zhì)中回收得到待測物響應值與標準物質(zhì)產(chǎn)生的響應值的比值（%）。 ———用來評價樣品處理方法將體內(nèi)樣品

28、中待測物從生物介質(zhì)中提取出來的能力。,,取空白生物介質(zhì)加入標準溶液，制備高、中、低三個濃度（各5份）的QC樣品，依擬定的方法操作測定，測得Ar 。,測定法：,另取空白生物介質(zhì)，照QC樣品同法處理后，加入等量的標準溶液，同法制備高、中、低三個濃度（各5份）的標準對照樣品，同法測定,測得As 。,提取回收率應一致，結果的精密可重現(xiàn)，而非待測物提取的是否完全。中、高濃度RSD應不大于15%；低濃度RSD應不大于20%。,,（十一）名詞解釋1

29、.標準物質(zhì):用于制備標準樣品、QC樣品的待測物的參比標準物質(zhì)。來源：①法定標準物②市購標準物③自制具有一定純度的標準物。2.生物介質(zhì)：一種生物來源的物質(zhì)，能以可重復的方式采集處理4.標準樣品：空白生物介質(zhì)加入已知量待測物標準物質(zhì)制成樣品，用于建立標準曲線、計算QC樣品和未知樣品中待測物濃度。5.質(zhì)控樣品(QC樣品)：空白生物介質(zhì)加入已知量待測物標準物質(zhì)制成樣品，用于監(jiān)測生物樣品分析方法的效能和評價每一分析批中未知樣品分析結果的完整

30、性和正確性。7.未知溶液（研究樣品）：作為分析對象的體內(nèi)樣品8.制備溶液：待測樣品經(jīng)過各步驟處理制成的直接用于儀器分析的試樣。9.分析批：未知樣品、適當數(shù)目的標準樣品、 QC樣品的完整系列,結合生物樣品性質(zhì)，闡述體內(nèi)樣品分析的特點。 如何制備血清、血漿？在測定血樣時，為何首先應去除蛋白質(zhì)，去除蛋白有哪幾種方法？生物樣品前處理的方法有哪些？色譜法分析生物樣品時，常用的化學衍生化方法有哪些？簡