精液冷凍概述課件

1、精液冷凍技術(shù)概述,四川大學華西第二醫(yī)院人類精子庫,2,精液冷凍歷史回顧,1776年Spallanzani偶然發(fā)現(xiàn)將人精液埋藏于冰雪仍可存活1886年Mantegazza發(fā)現(xiàn)在－15℃下的精子可以存活較長時間；     1937年Jannel報告人類精子可在-196℃中存活；     1949年P(guān)olge首先發(fā)現(xiàn)甘油對冷凍精子具有特殊保護作用。,

2、3,冷凍精液的臨床意義,供者人工授精（AID）使用方便，并且可以配合女性生殖周期進行；對有先天遺傳疾病和嚴重傳染性疾病的患者可以使用；進行生殖保險；如男性絕育手術(shù)者，腫瘤患者化療前，從事危險行業(yè)者等；對于少、弱精癥者，可多次采集冷凍后加以濃縮；對于取精困難和梗阻性無精癥的患者在ICSI治療時，用凍融精子代替新鮮精子可避免反復抽吸睪丸或附睪，利于醫(yī)患雙方掌握治療進度。,4,冷凍損傷原理,冰晶損傷學說 ice crystal d

3、amage 溶液效應(yīng)學說 solute damage,5,冷凍原理,降溫過程分期：溫度休克期RT~5℃潛熱擴散期5～0℃ 冰晶形成期0～－15℃再結(jié)晶期－15～－79℃保存期－80～－196℃,6,冷凍損傷原理,精子,示意圖：,精子細胞外冰晶形成,胞內(nèi)冰晶形成,細胞脫水,冰晶損傷,溶液損傷,,,,,,降溫,快速,慢速,7,冷凍對精子產(chǎn)生的損傷,超微結(jié)構(gòu)的損傷： 冷凍復溫后的精

4、子外膜變薄，波浪狀改變或破損，胞漿、頂體內(nèi)和線粒體內(nèi)透光度增加，頂體增寬，線粒體外形變圓，軸絲增粗，提示細胞腫脹是形態(tài)改變得主要征象。 精子功能： 日本學者研究根據(jù)精子頂體功能和穿透率無顯著變化，發(fā)現(xiàn)冷凍精子授精能力無下降。染色體： 目前對冷凍保存精子染色體自然畸變率報道不多，仍存在爭論,8,冷凍保護原理,冷凍保護液 滲透性 增加細胞內(nèi)外的滲透壓，降低細胞內(nèi)外液的冰點，減少冰晶的形成。

5、 非滲透性 調(diào)節(jié)PH，細胞外滲透壓，增加營養(yǎng)不同溫區(qū)最適的冷凍速率 研究表明過快或過慢的降溫都是不合適的，應(yīng)根據(jù)不同的冷凍保護劑選擇各個溫區(qū)最佳的降溫速度。目前還未找到。,9,冷凍保護劑 （CPM）,根據(jù)CPM的特性： 非滲透性CPM：卵黃、葡萄糖、蔗糖 滲透性CPM：甘油根據(jù)CPM種類 : 單一甘油型 復合甘油型 無甘油型,10,冷凍保護劑 （CPM）,各成分的主要作用 :甘

6、油：有滲透性，當進入精子細胞內(nèi)時使精子內(nèi)的含水蛋白質(zhì)穩(wěn)定，降低細胞內(nèi)液冰點，減少冷凍時細胞內(nèi)冰晶的形成。但甘油本身對細胞也有一定的毒性，一般終濃度控制在7～10％。 卵黃：提高細胞外滲透壓，含有卵磷脂，可以穩(wěn)定精子的細胞膜，防止頂體外膜破裂。它的缺點是凍融后有大量的顆粒和碎片，并且有病毒感染和過敏反應(yīng)當可能。,11,冷凍保護劑 （CPM）,各成分的主要作用 :葡萄糖：與調(diào)節(jié)滲透壓有關(guān) 緩沖系統(tǒng)：可以結(jié)合游離的H+和

7、OH－，有助于溶液和精子脫水現(xiàn)在常用CPM: 單一甘油型 G－Y－C型（甘油－卵黃－檸檬酸鈉型） TEST－G－Y－C（TES－Tris緩沖系統(tǒng)＋GYC）型 G－Y－C－G型（GYC＋谷氨酰胺） 改良T－G型（改良Tyrode液－甘油型）,12,冷凍保護劑 （CPM）,改良T－G型，它的優(yōu)點 有：相比有較好的冷凍復蘇率（本精子庫平均62.6％）可準確配制不

8、含卵黃，消除可能的病毒感染和過敏反應(yīng)背景清晰，無大量顆粒和碎片儲存時間長，可達3個月,13,降溫程序,分類： 程序降溫：利用程序降溫儀進行精確降溫。   手工降溫：利用現(xiàn)有降溫設(shè)備和液氮蒸氣分步驟降溫。注：由于現(xiàn)在還沒有找到降溫過程中各個溫區(qū)最佳降溫速率，文獻報道的各種降溫程序精液復蘇率效果不一！降溫前處理： 在室溫中將精液與CPM 1:1混勻，通常是在20min逐量加入，且用振蕩器持續(xù)振

9、蕩，轉(zhuǎn)速約300/min。此過程在提高精液復蘇率中起重要作用之一。,14,降溫程序,程序降溫 得到多數(shù)學者的認同，有精確定降溫速率控制，復蘇率較高。缺點是儀器昂貴，使用和維護費用也較高，不適合普及。,15,降溫程序,手工降溫：25℃（RT下加CPM）—4℃-20min—LV（LN上5cm處）-10min—LN25℃（RT下加CPM）—4℃-60min—－20℃-20min—LN25℃（RT下加CP

10、M）—4℃-20min—－20℃-20min—LV（LN上5cm處）-5min—LN25℃（RT下加CPM）—LV（LN上5cm處）-15min—LN,16,復溫程序,原則：是快凍快復、慢凍慢復 方法：37℃水浴快速復溫復溫損傷機制：Mohammad等連續(xù)觀察精子在冷凍過程中的損傷情況發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的細胞損傷發(fā)生在復蘇期。當快速降溫時使細胞內(nèi)產(chǎn)生小冰晶，如果緩慢復溫，小冰晶將會融合成大冰晶對細胞形成損傷；當慢速降溫時細胞外的水分首先

11、結(jié)冰，胞外溶質(zhì)濃度升高導致精子細胞脫水，快速復溫使胞外的水分來不及回滲，造成精子的皺縮，形成溶質(zhì)性損傷。,17,冷凍復溫后的處理,使用精子營養(yǎng)液可使復溫后的精子在較長時間內(nèi)保持良好的活動率。使用化學物質(zhì)如：己酮可可堿（PF）、2-脫氧腺苷（2-DA）提高冷凍復蘇后的精子的活率和活力。,18,精液研究的新進展,玻璃化低溫保存 最理想化的精液保存方法。指在溶液降溫過程中，相變后直接轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)（玻璃態(tài)）的固態(tài)。由于玻

12、璃態(tài)分子間的關(guān)系和液態(tài)沒有明顯變化，可避免冰晶形成過程中對細胞的損傷。要形成玻璃態(tài)必須有兩個條件：有極大的冷卻速率；極大增加溶液的濃度。,19,精液研究的新進展,冷凍損傷的新理論：活性氧（ROS）的損傷： 精液冷凍過程中產(chǎn)生較多的活性氧，特別是標本中白細胞含量較高時。從樣本中除去白細胞或冷凍前用抗氧化劑處理，可以提高精子的活力和功能。膜穿透性：不同保護劑成分對細胞膜的穿透性，水對細胞膜的穿透性，它們的大小決定了冷凍保護劑

13、與精液混合時平衡的時間及降溫速率。穿透性越大的冷凍保護劑可以得到較高的冷凍復蘇率。,20,精液研究的新進展,冷凍保護劑滲透壓冷凍保護劑滲透壓的大小也是導致精液冷凍損傷的主要因素之一。冷凍保護劑滲透壓>2000mOsm時大部分細胞膜會受到破壞。這一損傷同時也與細胞本身可以承受滲透壓變化的程度，在冷凍和復溫過程中，如果滲透壓變化超過細胞本身承受能力，嚴重的細胞將死亡。冷打擊 精子從室溫降到0℃時會受到損傷，我們稱之為冷打擊。它

14、往往決定于精子本身抗冷打擊的能力。,21,本精子庫冷凍試驗進展,已建立合理的精液冷凍程序共進行精液冷凍試驗169例，平均復蘇率達62.6％隨著條件不斷的摸索，冷凍復蘇率也在不斷地提高；已建立比較穩(wěn)定的精液冷凍方法，冷凍復蘇率完全滿足衛(wèi)生部的要求。,22,精液冷凍研究的方向,尋找更加適合精液冷凍的冷凍保護劑；探討滲透壓對精液冷凍產(chǎn)生的影響；活性氧（ROS）對精液冷凍產(chǎn)生的影響及應(yīng)對方法；根據(jù)冷凍保護劑選擇各個降溫區(qū)最佳降溫速度