動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)

1、第四章 動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫技術(shù),Contents,,檢驗(yàn)檢疫樣品,,細(xì)菌分離及鑒定,,病毒分離及鑒定,,其它病原微生物分離及鑒定,,寄生蟲檢查,,現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用,第一節(jié) 檢驗(yàn)檢疫樣品,一、病料采集和運(yùn)送(一)病料采集基本原則（1）在采取病料前必須對(duì)被檢動(dòng)物可能患有何種疫病作出初步診斷。（2）采取病料所用容器、手術(shù)器械都應(yīng)事先消毒，確保無(wú)毒，采樣時(shí)應(yīng)無(wú)菌操作。（3）應(yīng)做好人身防護(hù)，嚴(yán)防人畜共患病感染。（4）應(yīng)防止污染環(huán)境，防

2、止疫病傳播，做好環(huán)境消毒和病害肉尸的處理。（5）如果動(dòng)物已死亡，有特殊要求,如果動(dòng)物已死亡，取樣應(yīng)注意急性死亡動(dòng)物, 如懷疑是炭疽，不可隨意解剖，應(yīng)從耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片,染色鏡檢, 萬(wàn)不得已時(shí)局部解剖作脾臟觸片的顯微鏡檢查。排除炭疽后方能剖檢取樣采取病料時(shí)間,原則是越早越好, 內(nèi)臟病料的采取，如患畜已死亡，應(yīng)盡快采集，最遲不超過(guò)6h。夏季要在動(dòng)物死亡后2小時(shí)內(nèi)采取病料；采取病料的種類，根據(jù)不同的疾病或檢驗(yàn)?zāi)康?，采?/p>

3、相應(yīng)的臟器、內(nèi)容物、分泌物、排泄物或其他材料。在無(wú)法估計(jì)病因時(shí)，可進(jìn)行全面的采集。填寫好病料送檢單和剖檢病理變化記錄。,（二）使用器械的消毒刀、剪、鑷子等用具煮沸消毒30min。器皿(玻制等)經(jīng)高壓滅菌或干烤滅菌；或放于0.5%～1%的碳酸氫鈉水中煮沸10min～15min；軟木塞和橡皮塞置于0.5%石碳酸水溶液中煮沸10分鐘載玻片在1%～2%的碳酸氫鈉水中煮沸10min～15min；水洗后用清潔紗布擦干，保存于酒精、乙醚等

4、溶液中備用一般使用一次性針頭和注射器。采取一種病料，使用一套器械與容器；5、采過(guò)病料的用具應(yīng)先消毒后清洗。,（三）病料的采取方法,1、血液 （1）采血部位大的哺乳動(dòng)物可選用頸靜脈或尾靜脈采血，也可采脛外靜脈和乳房靜脈血。毛皮動(dòng)物小量采血可穿刺耳尖或耳殼外側(cè)靜脈，多量采血可在隱靜脈采集，也可用尖刀劃破趾墊0.5cm深或剪斷尾尖部采血。嚙齒類動(dòng)物可從尾尖采血，也可由眼窩內(nèi)的血管叢采血；兔可從耳背靜脈、頸靜脈或心臟采血。禽類通

5、常選擇翅靜脈采血，也可通過(guò)心臟采血。,小鼠,豬前腔靜脈采血,（2）采血方法對(duì)動(dòng)物采血部位的皮膚先剃毛(拔毛)，75%的酒精消毒，待干燥后采血；采血可用針管、針頭、真空管或用三棱針穿刺，將血液滴到開口的試管內(nèi)。禽類等的少量血清樣品的采集，可用塑料管采集。用針頭刺破消毒過(guò)的翅靜脈，將血液滴到直徑為3mm～4mm的塑料管內(nèi)，將一端封口。,（3）血樣種類①全血樣品進(jìn)行血液學(xué)分析，細(xì)菌、病毒或原蟲培養(yǎng)，通常用全血樣品，樣品中加抗凝劑。

6、抗凝劑可用0.1%肝素、阿氏液或4.0~5%枸櫞酸鈉液。采血時(shí)應(yīng)直接將血液滴入抗凝劑中，并立即連續(xù)搖動(dòng)，充分混合。也可將血液放入裝有玻璃珠的滅菌瓶?jī)?nèi)，震蕩脫纖維蛋白。,②血清樣品進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。血液中不加抗凝劑，血液在室溫下靜置2h～4h，待血液凝固，有血清析出時(shí)，用無(wú)菌剝離針剝離血凝塊，然后置4℃冰箱過(guò)夜，待大部分血清析出后取出血清，必要時(shí)經(jīng)低速離心分離出血清。在不影響檢驗(yàn)要求原則下可因需要加入適宜的防腐劑。做病毒中和試驗(yàn)的血

7、清避免使用化學(xué)防腐劑(如硼酸、硫柳汞等)。若需長(zhǎng)時(shí)間保存，則將血清置20℃以下保存，但要盡量防止或減少反復(fù)凍融。樣品容器上貼詳細(xì)標(biāo)簽。,③血漿的采集 采血試管內(nèi)先加上抗凝劑，血液采完后，將試管顛倒幾次，使血液與抗凝劑充分混合，然后靜止，待細(xì)胞下沉后，上層即為血漿。,2、一般組織（包括內(nèi)臟組織）（1）采樣方法 用常規(guī)解剖器械剝離死亡動(dòng)物的皮膚，體腔用消毒的器械剝開，所需病料按無(wú)菌操

8、作方法從新鮮尸體中采集。剖開腹腔后，注意不要損壞腸道。,（2）采樣種類①病原分離樣品的采集 用于細(xì)菌分離的樣品的采集，首先以燒紅的刀片燙烙臟器表面，在燒烙部位刺一孔，用滅菌后的鉑耳伸入孔內(nèi)，取少量組織或液體，作涂片鏡檢或劃線接種于適宜培養(yǎng)基上②組織病理學(xué)檢查樣品的采集 采集包括病灶及臨近正常組織的組織塊，立即放入10倍于組織塊的10%福爾馬林溶液中固定。組織塊厚度不超過(guò)0.5cm，切成1cm2～2cm2 。組織塊

9、切忌擠壓、刮摸和用水洗。如作冷凍切片用，則將組織塊放在0℃～4℃容器中，盡快送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。,3、液體病料 采集膽汁、膿、粘液或關(guān)節(jié)液等樣品時(shí)，用燙烙法消毒采樣部位，用滅菌吸管、毛細(xì)吸管或注射器經(jīng)燙烙部位插入，吸取內(nèi)部液體材料，然后將材料注入滅菌的試管中，塞好棉塞送檢。也可用接種環(huán)經(jīng)消毒的部位插入，提取病料直接接種在培養(yǎng)基上。供顯微鏡檢查的膿、血液及粘液抹片的制備方法:先將材料置玻片上，再用一滅菌玻棒均勻涂抹或另用一玻片推抹。組織塊、

10、致密結(jié)節(jié)及膿汁等亦可在兩張玻片中間，然后沿水平面向兩端推移。用組織塊作觸片時(shí)，持小鑷將組織塊的游離面在玻片上輕輕涂抹即可。,4、皮膚 病料直接采自病變部位，如病變皮膚的碎屑、未破裂水泡的水泡液、水泡皮等。采取病變局部的皮膚(10cm×10cm左右)，放入甘油鹽水緩沖溶液中，或10％飽和鹽水溶液中，或10％福爾馬林液中。,5、腸內(nèi)容物或糞便 腸道只需選擇病變最明顯的部分，將其中的內(nèi)容物棄去，用滅菌

11、生理鹽水輕輕沖洗；也可燒烙腸壁表面，用吸管扎穿腸壁，從腸腔內(nèi)吸取內(nèi)容物，將腸內(nèi)容物放入盛有滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中送檢。或者，將帶有糞便的腸管兩端結(jié)扎，從兩端剪斷送檢。,6、胃液及瘤胃內(nèi)容物（1）胃液采集 胃液可用多孔的胃管抽取。將胃管送入胃內(nèi)，其外露端接在吸引器的負(fù)壓瓶上，加負(fù)壓后，胃液即可自動(dòng)流出。（2）瘤胃內(nèi)容物采集 反芻動(dòng)物在反芻時(shí)，與食團(tuán)從食道逆入口腔時(shí)，立即開口拉住舌頭，另一只手深入口腔即可取出少

12、量的瘤胃內(nèi)容物。,7、呼吸道應(yīng)用滅菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉或氣管內(nèi)的分泌物，蘸取分泌物后立即將拭子浸入保存液中，密封低溫保存。常用的保存液有pH7.2～7.4的滅菌肉湯或磷酸鹽緩沖鹽水。一般每支拭子需保存液5mL。,8、眼睛眼結(jié)膜表面用拭子輕輕擦拭后，放在滅菌的30%甘油鹽水緩沖保存液中送檢。有時(shí)，也采取病變組織碎屑，置載玻片上，供顯微鏡檢查。,9、小家畜及家禽將整個(gè)尸體包入不透水塑料薄膜、油紙或油布中，裝入木箱內(nèi)，送往實(shí)驗(yàn)

13、室。小動(dòng)物,禽和魚等可整體送檢。在距離實(shí)驗(yàn)室很近,又有隔離運(yùn)輸條件時(shí),也可將發(fā)病小動(dòng)物直接送檢。,10、腦、脊髓（1）全腦、脊髓的采集 采取腦、脊髓做病毒檢查，可將腦、脊髓浸入30%甘油鹽水液中或?qū)⒄麄€(gè)頭部割下，包入浸過(guò)消毒液的紗布中，置于不漏水的容器內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室。,（2）腦、脊髓液的采集 ①采樣前的準(zhǔn)備：專用穿刺針 ②采樣方法： 頸椎穿刺 、腰椎穿刺 ③采樣數(shù)量： 大

14、型動(dòng)物頸部穿刺一次采集量35mL～70mL，腰椎穿刺一次采集量15mL～30mL。,二、病料的保存1、細(xì)菌檢驗(yàn)材料的保存 將采取的器臟組織塊，保存于滅菌液體石蠟、飽和氯化鈉溶液或30％甘油緩沖鹽水溶液中，容器加塞封固。液體裝在封閉的毛細(xì)管或試管運(yùn)送。寄送腸道時(shí)，先清除腸內(nèi)糞團(tuán)，用滅菌鹽水清洗后，置于盛有上述保存劑的試管中即可。糞便可移入滅菌容器中寄送。,2、病毒檢驗(yàn)材料的保存 將采取的器臟組織塊，保存于50％甘油緩沖鹽水溶液，容

15、器加塞封固。3、病理組織學(xué)檢驗(yàn)材料的保存將采取的器臟組織塊放入10％福爾馬林溶液或95％酒精中固定，固定液的用量為送檢病料的10倍以上。為防病料凍結(jié)，可將固定好的組織塊取出，保存于甘油和10％福爾馬林等量混合液中,三、病料的記錄、包裝和運(yùn)送1、送檢樣品的記錄送往實(shí)驗(yàn)室的樣品應(yīng)有一式三份的送檢報(bào)告，一份隨樣品送實(shí)驗(yàn)室，一份隨后寄去，另一份備案2、送檢樣品包裝和運(yùn)送所采集的樣品以最快最直接的途徑送往實(shí)驗(yàn)室。 24h內(nèi)的放

16、在4℃左右的容器中運(yùn)送。24h內(nèi)不能運(yùn)送的，把樣品冷凍，并以此狀態(tài)運(yùn)送,四、病料的處理 1、性狀觀察　　 采集的病料，在接種培養(yǎng)前,應(yīng)對(duì)其性狀進(jìn)行觀察，如是否膿性帶血或腐敗，有何異味,并作記錄2、涂片 各種病料在分離培養(yǎng)前均應(yīng)制備涂片,作革蘭氏染色,鏡檢,以了解細(xì)菌的形態(tài),染色特性,并大致估計(jì)其含菌量。通過(guò)肉眼觀察和顯微鏡下看到的結(jié)果,對(duì)病料中可能含有的病原菌作最初步的估價(jià)。,3、污染病料抑菌培養(yǎng) 如果

17、病料被雜菌污染嚴(yán)重,則需采用一些對(duì)病原菌無(wú)害,但對(duì)雜菌有殺滅或抑制作用的方法,以抑制雜菌生長(zhǎng)。4、集菌處理 有些病料含菌太少,則應(yīng)先作集菌處理,然后接種,以提高檢出率,其集菌方法有離心法和過(guò)濾法.,第二節(jié) 細(xì)菌分離及鑒定,一、細(xì)菌的分離與接種 1、平板劃線接種法 通過(guò)平板劃線后,可使細(xì)菌分散生長(zhǎng),形成單個(gè)菌落,有利于從含有多種細(xì)菌的標(biāo)本中分離出目的菌。,A 分區(qū)劃線法首先將接種環(huán)滅菌后,沾取標(biāo)本均勻涂布于平板培養(yǎng)

18、基邊緣一小部分(第一區(qū)),將接種環(huán)火焰滅菌,待冷卻后只通過(guò)第一區(qū)3-4次后連續(xù)劃線(為第二區(qū)),依次可共劃線3-5區(qū),每一區(qū)細(xì)菌數(shù)可逐漸減少,直到分離出單個(gè)菌落為止.,B 連續(xù)劃線法首先將標(biāo)本均勻涂布于平板培養(yǎng)基邊緣一小部分,然后由此開始，在培養(yǎng)基表面自左向右連續(xù)劃線并逐漸向下移動(dòng)，直到下邊緣。,2、斜面接種法 采用該法目的是進(jìn)行純培養(yǎng)。其方法是從平板分離培養(yǎng)物上用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落或者是取純種,移種至斜面培養(yǎng)基上,先從斜面底部自下

19、而上劃一條直線,再?gòu)牡撞块_始向上劃曲線接種,盡可能密而勻,或者直接自下而上劃曲線接種。,3、傾注培養(yǎng)法 此法適用于乳汁和尿液等液體標(biāo)本的細(xì)菌計(jì)數(shù)。其方法是取原標(biāo)本經(jīng)適當(dāng)稀釋，置于無(wú)菌平皿內(nèi),傾入已融化并冷至50℃左右的培養(yǎng)基約立即混勻待凝固后倒置培養(yǎng)。,4、穿刺接種法 多用于雙糖,明膠等具有高層的培養(yǎng)基進(jìn)行接種方法是用接種針挑取菌落或培養(yǎng)物,由培養(yǎng)基中央直刺到距管底約0.3-0.5cm處.然后沿穿刺線退出接種針；若為雙糖等含高

20、層斜面的培養(yǎng)基則光穿刺高層部分,退出接種針后直接曲線接種斜面部分。,5、液體接種法 多用于普通肉湯,蛋白胨,水等液體培養(yǎng)基的接種方法是接種環(huán)沾取菌種,傾斜液體培養(yǎng)基管,先在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體能淹沒接種物為準(zhǔn)),然后再在液體中擺動(dòng)2-3次接種環(huán),塞好棉塞后輕輕混合即可。,二、細(xì)菌的培養(yǎng)方法,需氧培養(yǎng)法 二氧化碳培養(yǎng)法 厭氧培養(yǎng)法,形態(tài)學(xué)特征生理學(xué)特征生態(tài)學(xué)特征,生物分類的傳統(tǒng)指標(biāo),三、細(xì)菌的鑒定,1

21、、微生物分類鑒定的經(jīng)典方法 純培養(yǎng)的病原微生物可進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。 系統(tǒng)鑒定就是通過(guò)病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)特征、抗原性和病原性等檢測(cè)，并用已知標(biāo)準(zhǔn)血清確定分離細(xì)菌的屬、種和型。 微生物鑒定程序通常是根據(jù)其形態(tài)生長(zhǎng)、生化特征等定種，最后根據(jù)抗原的免疫血清檢查定型,常用的形態(tài)學(xué)特征有培養(yǎng)特征細(xì)胞形態(tài)染色特性特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)性等,（1）形態(tài)學(xué)特征,（2）生理生化特征,營(yíng)養(yǎng)類型 與氧的關(guān)系對(duì)溫度的適應(yīng)性對(duì)pH的適應(yīng)性對(duì)滲

22、透壓的適應(yīng)性代謝產(chǎn)物 細(xì)菌毒力,細(xì)菌毒力,病原性細(xì)菌致病能力的強(qiáng)弱程度稱為毒力。測(cè)定微生物毒力大小系用遞減劑感染易感動(dòng)物來(lái)進(jìn)行。試驗(yàn)時(shí), 須注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種別,年齡與體重,試驗(yàn)材料和劑量,感染途徑以及其它因素。通常用來(lái)表示微生物毒力大小的單位有：最小致死量 (M.L.D): 能使特定動(dòng)物感染后,在一定時(shí)限內(nèi)發(fā)生死亡的最少活的微生物量或毒素量半數(shù)致死量 (LD50 )： 在一定時(shí)限內(nèi)能使半數(shù)動(dòng)物發(fā)生感染死亡所需的活的微生物量

23、或毒素量。,2、微生物分類鑒定中的現(xiàn)代方法,,（1）核酸分析鑒定微生物遺傳型特點(diǎn)：直接比較不同微生物之間基因組的差異,DNA的堿基組成(G+C mol%),核酸的分子雜交法,,主要方法,計(jì)算機(jī)鑒定微生物基于數(shù)值分類法 即通過(guò)廣泛比較分類單位的性狀特征，然后計(jì)算它們之間的相似性，再根據(jù)相似性的數(shù)值劃分類群的一種分類方法。,（2）應(yīng)用計(jì)算機(jī)鑒定微生物學(xué),第三節(jié) 病毒分離及鑒定,一、檢材的采集與處理發(fā)病初期從感染部位采集足量標(biāo)本，低溫

24、運(yùn)送、保存，盡快送檢，分離培養(yǎng)前去除標(biāo)本中的沉渣、細(xì)菌、真菌和毒性物質(zhì)等，必要時(shí)需濃縮、提純。,二、病毒的分離及鑒定病毒檢驗(yàn)的大致程序：臨床標(biāo)本→分離培養(yǎng)→初步鑒定→最后鑒定病毒分離培養(yǎng)方法：包括組織培養(yǎng)、雞胚接種、動(dòng)物接種,3、病毒的初步鑒定依據(jù)動(dòng)物感染范圍及潛伏期、對(duì)雞胚的敏感性、細(xì)胞形態(tài)變化類型、紅細(xì)胞吸附、病毒干擾現(xiàn)象、血凝性質(zhì)、理化性質(zhì)（核酸類型測(cè)定、大小形態(tài)、乙醚敏感試驗(yàn)、耐酸試驗(yàn)）,4、病毒的最后鑒定依據(jù)主要是血清

25、學(xué)方法（中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)）和分子生物學(xué)方法。,5、分離病毒的病原學(xué)意義從組織、腦脊液、血液、眼部、水泡液分離到任何病毒均可認(rèn)為具有高度病原學(xué)意義。尿液中檢出病毒也具有病原學(xué)診斷意義從呼吸道、陰道、腸道標(biāo)本分離病毒，需要考慮這些病毒是否有無(wú)癥狀攜帶者和長(zhǎng)期排毒者。,第四節(jié) 其它病原微生物分離及鑒定,一、螺旋體,1、形態(tài)結(jié)構(gòu)及染色特征螺旋體是一類菌體細(xì)長(zhǎng)、柔軟、彎曲呈螺旋狀、能活潑運(yùn)動(dòng)的原核單細(xì)胞微生物、它的基本結(jié)

26、構(gòu)于細(xì)菌類似。革蘭氏染色陰性，但大多不易著色。在普通顯微鏡下難以看到，常用鍍銀染色法染色。,2、生物學(xué)特性螺旋體多為需氧菌，對(duì)熱、酸、干燥和一般消毒劑均敏感。鉤端螺旋體是唯一可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)的螺旋體。,,電鏡下的鉤端螺旋體,3、致病性主要傳播途徑是接觸傳播。鉤端螺旋體具有較強(qiáng)的侵襲力，能通過(guò)皮膚微小傷口、眼結(jié)膜、鼻或口腔粘膜而侵入人體。其次，也可以通過(guò)消化道傳播，如進(jìn)食了排泄物污染的食物，螺旋體就從消化道粘膜侵入體內(nèi)。首先

27、發(fā)生鉤端螺旋體敗血癥，出現(xiàn)高燒頭痛，隨著鉤端螺旋體侵入肝、腎、肺、腦等引起多種臟器的損害。臨診表現(xiàn)形式多樣，主要有發(fā)熱、黃疸、血紅蛋白尿、流產(chǎn)、皮膚和粘膜壞死、水腫等。,4、微生物診斷,（1）病料的采集與檢查發(fā)病早期以采取病畜的血液為宜，發(fā)病后期腎臟中的病原體大量增加，宜采取尿液。死后采樣肝、腎、腎上腺等實(shí)質(zhì)器官，研磨后取上清制片鏡檢。暗視野顯微鏡檢查 以上材料制成壓滴標(biāo)本片，用暗視野顯微鏡檢查。螺旋體在暗視野顯微鏡

28、下似一串發(fā)亮的小珍珠，運(yùn)動(dòng)活潑標(biāo)本染色鏡檢 用姬姆薩染色或方氏鍍銀法和鉤端螺旋體媒染法。,（2）分離培養(yǎng) 常用柯氏培養(yǎng)基和捷氏培養(yǎng)基培養(yǎng)。接種量要大，血液直接接種，尿液過(guò)濾后接種。,（3）動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn),（4）血清學(xué)檢驗(yàn)動(dòng)物感染鉤端螺旋體發(fā)病早期，其血清中即有特異性抗體出現(xiàn)，此抗體長(zhǎng)期存在。診斷用已知抗原檢查動(dòng)物血清中的抗體。最常用的方法是凝集溶解實(shí)驗(yàn)，暗視野檢查。,二、立克次氏體,1、形態(tài)結(jié)構(gòu)立克次氏體形

29、態(tài)為細(xì)胞多形，可呈球形、球桿形、桿形，甚至啞鈴形或絲狀等，但主要是球桿狀。單個(gè)或成對(duì)排列，有時(shí)呈短鏈狀。革蘭氏染色陰性，但不易著色,2、生物學(xué)特性專性細(xì)胞內(nèi)寄生 大小介于細(xì)菌和病毒之間 革蘭氏染色陰性，姬姆薩染色呈紫或藍(lán)色對(duì)理化因素抵抗力不強(qiáng)，尤對(duì)熱敏感，一般在56℃，30min即被滅活。對(duì)一些廣譜抗生素敏感，但磺胺藥不敏感且反有促進(jìn)立克次體生長(zhǎng)作用，不能用于治療。,立克次氏體,3、致病性致人畜疾病的立克次氏體，多寄生于網(wǎng)狀內(nèi)

30、皮系統(tǒng)、血管內(nèi)度細(xì)胞或紅細(xì)胞，并常天然寄生在虱、蚤、蜱、螨等節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)叮咬、抓傷或吸入，從一個(gè)宿主傳播到另一個(gè)宿主動(dòng)物或人體。,4、微生物診斷病料采集：立克次氏體分離培養(yǎng)的病料，應(yīng)采自未用抗生素的急性期或發(fā)熱期患病動(dòng)物，已死亡的動(dòng)物應(yīng)盡早采集。病料-70℃保存。根據(jù)需要可采取急性期或發(fā)熱期患病動(dòng)物的血液；病死動(dòng)物的脾、肝、腎、腦、脊髓及胎盤、乳汁等。,病原檢查分離 將所采病料制成血片或組織抹片，經(jīng)適當(dāng)方法染色后鏡檢。或?qū)⒉×?/p>

31、處理后接種于雞胚卵黃囊內(nèi)或適宜的易感動(dòng)物或接種細(xì)胞，培養(yǎng)出立克次體?？贵w檢查 可用已知抗原作凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)或中和試驗(yàn)，以證實(shí)患病動(dòng)物血清中的相應(yīng)抗體，從而診斷該病。中和試驗(yàn)可用豚鼠或雞胚進(jìn)行。由于某些變形桿菌菌株可與某些立克次體多糖抗原的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，故在醫(yī)學(xué)上，常用這些變形桿菌菌株制成凝集抗原，用凝集試驗(yàn)檢查某些立克次體病。這種凝集試驗(yàn)稱為魏-裴二氏反應(yīng),三、支原體,1、形態(tài)結(jié)構(gòu)及染色特性支原體是目前發(fā)現(xiàn)的最小的最

32、簡(jiǎn)單的，也是唯一一種沒有細(xì)胞壁的原核細(xì)胞，細(xì)胞柔軟具有高度的多形性。常呈球形、桿狀和絲狀，偶見有梨狀、分枝狀、環(huán)狀、螺旋狀等不規(guī)則的形狀。,支原體的大小為0.2～0.3um,可通過(guò)濾菌器革蘭氏染色呈陰性，通常著色效果不好，故常用姬姆薩染色染色法將其染成淡紫色,2、生物學(xué)特性 支原體基因組為一環(huán)狀以雙鏈DNA，分子量?。▋H有大腸桿菌的五分之一）支原體的生物合成能力較弱，雖然能夠在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但營(yíng)養(yǎng)要求比一般細(xì)菌高，常常需要在培

33、養(yǎng)基中加入膽固醇、血清、腹水、牛肉浸膏和酵母浸汁等特殊成分。 對(duì)環(huán)境滲透壓敏感,3、致病性與免疫性除了少數(shù)的支原體為腐生或共生菌，大多數(shù)為寄生菌。病原性支原體常常定居于多種動(dòng)物的呼吸道、泌尿生殖道、消化道黏膜表面、乳腺以及眼等部位，并且對(duì)胸腺、腹膜、關(guān)節(jié)滑液囊膜的間質(zhì)細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的親和力較強(qiáng)。,4、微生物學(xué)診斷,直接鏡檢意義十分有限，應(yīng)該取病料進(jìn)行分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)，做生理生化以及血清學(xué)試驗(yàn)方能進(jìn)行鑒定。,（1）病料采集

34、和保存由于支原體侵害動(dòng)物的黏膜表面，一般可用滅菌棉花拭子涂抹取樣。也可根據(jù)病變部位，取其肺、胸水、乳汁、鼻咽分泌物、關(guān)節(jié)液、淋巴結(jié)等，病料可經(jīng)濾器除菌后再接種。,（2）培養(yǎng)方法培養(yǎng)基中培養(yǎng)雞胚接種培養(yǎng)動(dòng)物接種培養(yǎng),（3）菌落形態(tài)和染色觀察支原體在適宜的固體培養(yǎng)基上能長(zhǎng)出具有“油煎蛋狀”或“桑葚狀”菌落,肺炎支原體菌落,電子顯微鏡鏡下肺炎支原體呈現(xiàn)多型性,四、衣原體,1、形態(tài)結(jié)構(gòu)革蘭氏陰性，圓形或橢圓形體；,姬姆薩染色 ，胞

35、漿內(nèi)有球形和橢圓形的衣原體,2、生物學(xué)特性介于立克次氏體與病毒之間，能通過(guò)細(xì)菌濾器，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生，生物學(xué)特性更接近細(xì)菌而不同于病毒。具有細(xì)胞壁，其組成與革蘭氏陰性菌相似，在顯微鏡下能觀察到；有獨(dú)特的發(fā)育周期，行二分裂方式繁殖。專性寄生，不能在人工培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；對(duì)多種抗生素敏感，衣原體對(duì)熱和常用消毒劑敏感,3、致病性衣原體通過(guò)創(chuàng)面侵入機(jī)體后，原體吸附于易感的柱狀或杯狀粘膜上皮細(xì)胞并在其中繁殖，也能進(jìn)入單核吞噬細(xì)胞繁殖。在宿主

36、細(xì)胞內(nèi)存在原體和始體兩種形態(tài)。具有感染性的原體通過(guò)胞飲作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，逐漸增大成為始體。始體無(wú)感染性，但能在空泡中以二分裂方式反復(fù)繁殖，形成大量新的原體，積聚于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)成為各種形狀的包涵體，宿主細(xì)胞破裂，釋放出的衣原體則感染新的細(xì)胞。,4、微生物診斷衣原體鑒定要點(diǎn)在細(xì)菌培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，衣原體培養(yǎng)方法有雞胚卵黃囊接種、小鼠腹腔、鼻內(nèi)接種和多種細(xì)胞培養(yǎng)。嚴(yán)格胞內(nèi)寄生，在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見衣原體原體和始體，感染細(xì)胞破裂后釋放于

37、胞外,寄生蟲學(xué)診斷技術(shù)包括病原檢查、免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查等三個(gè)方面。一、病原學(xué)診斷 根據(jù)寄生蟲生活史的特點(diǎn)，從病體的血液、組織液、排泄物、分泌物或活體組織中檢查寄生蟲的某一發(fā)育蟲期，這是最可靠的診斷方法病原學(xué)診斷方法檢出率較低，對(duì)于在組織中或器官內(nèi)寄生而不易取得材料的寄生蟲其檢出效果不理想。,第五節(jié) 寄生蟲檢查,糞便檢查,,,寄生蟲病原學(xué)檢查,1,2,3,4,血液檢查,排泄物與分泌物等的檢查,其他器官組織檢查,在動(dòng)物

38、檢疫中，常用的方法有以下幾種：1、蟲卵檢查法相對(duì)密度較小的蟲卵，常用蟲卵漂浮法，以相應(yīng)密度的漂浮液進(jìn)行離心，即可收集漂浮在上的蟲卵；密度較大的蟲卵，多用水洗沉淀法，在沉渣中收集蟲卵。多用于腸道寄生蟲和球蟲的檢查。2、蟲體檢查法 采用剖檢或采集相應(yīng)的標(biāo)本（糞便、血液、陰道分泌物、尿液、痰液、組織活檢或骨髓穿刺等），直接檢出蟲體。,二、免疫學(xué)診斷 　　寄生蟲侵入機(jī)體，刺激機(jī)體引起免疫反應(yīng)，利用免疫反應(yīng)的原理在體外進(jìn)行抗原或抗

39、體的檢測(cè)，達(dá)到診斷的目的。三、生物學(xué)檢查 包括核酸探針技術(shù)和PCR技術(shù)。但這兩種技術(shù)在寄生蟲檢測(cè)中多限于同一蟲種的鑒別。,第六節(jié) 現(xiàn)代生物技術(shù)在動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用,在動(dòng)物疫病診斷中和檢疫中，現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是基于抗原-抗體反應(yīng)的免疫血清學(xué)技術(shù)；二是基于病原核酸檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)。,免疫血清學(xué)技術(shù)主要包括中和試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫熒光抗體技術(shù)、免疫酶標(biāo)記技術(shù)等,分

40、子生物學(xué)技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR、核酸雜交、寡核苷酸指紋圖譜、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性等。,一、免疫血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,1、凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)是指顆粒性抗原例如細(xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)的抗體在適量的電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)一定時(shí)間后凝聚成肉眼可見的凝集物。凝集反應(yīng)廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷和各種抗原性質(zhì)的分析。既可用已知免疫血清來(lái)檢查未知抗原，亦可用已知抗原檢測(cè)特異性抗體。,凝集反應(yīng),直接凝集反應(yīng) ：是指顆粒性抗原與抗體直接結(jié)合而出現(xiàn)的

41、凝集現(xiàn)象,間接凝集反應(yīng) ：指可溶性抗原或抗體吸附于一種與免疫無(wú)關(guān)的、一定大小的不溶性顆粒(即載體顆粒)表面，然后與相應(yīng)抗體或抗原作用而出現(xiàn)的特異性凝集反應(yīng)。,,2、沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電介質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，形成肉眼可見的沉淀物沉淀反應(yīng)的抗原可以是多糖、蛋白質(zhì)、類脂等。同相應(yīng)抗體比較，抗原分子小，單位體積內(nèi)含有的抗原量多，做定量試驗(yàn)時(shí)，為了不使抗原過(guò)剩，應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)

42、沉淀反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法大體可分為環(huán)狀法、絮狀法、瓊脂擴(kuò)散法三種基本類型。,（1）環(huán)狀沉淀試驗(yàn)　　將免疫血清加到直徑小于0.5cm的反應(yīng)管底部；將含有可溶性抗原的材料重疊于上；抗原與抗體在兩液界面相遇，形成白色免疫復(fù)合物沉淀,（2）絮狀沉淀試驗(yàn)　　將抗原與抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在時(shí)，抗原與抗體結(jié)合形成絮狀沉淀物。這種沉淀試驗(yàn)受到抗原與抗體比例的直接影響，通常采用固定抗體稀釋抗原的方法，二者比例適合時(shí)，產(chǎn)生反應(yīng)最快；一種過(guò)剩則沉

43、淀減少，甚至無(wú)沉淀。,（3）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂凝膠內(nèi)擴(kuò)散，二者相遇，在比例合適處形成白色沉淀。瓊脂凝膠形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，抗原和抗體在凝膠內(nèi)可自由擴(kuò)散；Ag-Ab復(fù)合物為超大分子，由于網(wǎng)孔的限度，而被網(wǎng)在瓊脂中；,單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)將抗體混合于瓊脂內(nèi)，傾注于玻片上，凝固后在瓊脂上打孔再將抗原標(biāo)本加入孔內(nèi)，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，在孔的周圍出現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物形成的沉淀環(huán)，環(huán)的大小與抗原含量和擴(kuò)散時(shí)間相關(guān)。,雙向瓊脂擴(kuò)散

44、試驗(yàn)  是將半固體瓊脂傾注于平皿內(nèi)或玻片上，待其凝固后，在瓊脂板上打孔。 將抗原、抗體分別注入小孔內(nèi)，使兩者相互擴(kuò)散。 如果抗原、抗體相互對(duì)應(yīng)，濃度、比例適當(dāng)，則一定時(shí)間后，在抗原、抗體孔之間出現(xiàn)清晰可見的沉淀線。,3、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是應(yīng)用酶標(biāo)記的抗體（或抗原）在固相支持物表面檢測(cè)未知抗原（或抗體）的方法。ELISA的特點(diǎn)是特異性高靈敏度強(qiáng),（1）ELISA的基本原理有三條

45、抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性； 抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性。酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果,（2）常用的ELISA方法有以下兩個(gè)方面：測(cè)定抗原和測(cè)定抗體四種常用方法方法： 直接法測(cè)定抗

46、原；雙抗體夾心法測(cè)定抗原；競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原；間接法測(cè)定抗體；,直接法測(cè)定抗原 將抗原吸附在載體表面；加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物；加底物。 底物的降解量＝抗原量。,雙抗體夾心法測(cè)定抗原 將抗體吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物；加酶標(biāo)抗體； 加底物。 底物的降解量＝抗原量。,競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原將抗體吸附在固相載體表面；加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體； 對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原；加底物。對(duì)照孔

47、與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。,間接法測(cè)定抗體 將抗原吸附于固相載體表面；加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; 加酶標(biāo)抗體；加底物。,測(cè)定底物的降解量＝抗體量,,,病原菌檢測(cè),毒素檢測(cè),藥物殘留檢測(cè),病毒檢測(cè),寄生蟲免疫診斷,血清學(xué)技術(shù)應(yīng)用,二、分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,1、核酸雜交 核酸雜交是指兩條來(lái)源不同但具有互補(bǔ)序列的核酸，按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程。,2、PCR技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DN