臨床微生物學(xué)概論

1、臨床微生物學(xué)概論（第一部分）,復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所,2,標(biāo)本采集細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定抗菌藥物敏感性試驗,主要內(nèi)容,3,正常菌群,在正常人體體表與外界相通的腔道：口腔、鼻咽腔、腸道、泌尿生殖道存在的多種微生物。在機體免疫功能正常時對人體有益無害，屬人類正常微生物群或環(huán)境中通常不致病的微生物，因以細(xì)菌和真菌為主，故稱“正常菌群”。正常菌群的存在是保持人體健康的重要因素反映出在正常情況下，宿主、正常菌群和外界環(huán)境相互適

2、應(yīng)，保持平衡狀態(tài)。,4,5,病原微生物,病原微生物(pathogen)： 引起人類感染性疾病的微生物稱為病原微生物或致病微生物。細(xì)菌：如痢疾志賀菌、腸桿菌科細(xì)菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌屬等病毒：如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、乙型肝炎病毒等真菌：如念珠菌屬、曲霉屬、毛霉屬以及新型隱球菌等其他：如支原體、衣原體、螺旋體,6,臨床常見的病原微生物,革蘭陽性菌：葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腸球菌革蘭陰性菌：需氧球菌： 腦膜炎和淋病奈瑟

3、球菌、卡他莫拉菌需氧桿菌： 不動桿菌、假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、嗜血桿菌需氧和兼性厭氧：腸桿菌科細(xì)菌如大腸桿菌、肺桿、傷寒、志賀菌。厭氧細(xì)菌：脆弱擬桿菌、痤瘡丙酸桿菌等,7,苛 養(yǎng) 菌,定義：是一類生長需要特殊營養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)菌，與許多感染性疾病有關(guān)，其分離培養(yǎng)較為困難。營養(yǎng)要求高肺炎鏈球菌：培養(yǎng)基內(nèi)要加入血或血清流感嗜血桿菌：X、V因子比較嬌嫩、對干燥、對寒冷的抵抗力均較弱。培養(yǎng)條件：5～10％CO2、35℃培養(yǎng)、24

4、～ 48h呼吸道其他快生長細(xì)菌的覆蓋使分離率非常低,8,厭 氧 菌,是一群專性厭氧，必須在無氧環(huán)境下才能生長繁殖的細(xì)菌。根據(jù)能否形成芽胞，可將厭氧菌分成兩大類。厭氧芽胞梭菌屬無芽胞厭氧菌厭氧芽胞梭菌屬：破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、肉毒梭菌、艱難梭菌無芽胞厭氧菌：擬桿菌屬、梭桿菌屬、丙酸桿菌屬、消化鏈球菌屬等,9,標(biāo)本的采集,抗菌藥使用前正確的部位正確的時間足夠的數(shù)量無菌的容器特殊要求應(yīng)在化驗單上注明,10,主要

5、的臨床標(biāo)本種類,標(biāo)本類型呼吸道標(biāo)本深部咳出痰、支氣管灌洗液咽拭子、鼻氣管吸出液、氣管吸出液尿液 血液 腦脊液傷口、膿液其它體液胸水、心包液、引流液、腹水、滑囊液,11,標(biāo)本的處理,涂片光鏡檢查診斷病原最基本和快速的方法：腦脊液直接形態(tài)學(xué)檢查革蘭染色或特殊染色分離培養(yǎng)和鑒定動物接種免疫學(xué)檢查,12,痰標(biāo)本主要病原菌：肺炎鏈球菌，克雷伯菌屬，流感嗜血桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌。非病原菌：酵母菌，

6、草綠色鏈球菌，凝固酶陰性葡萄球菌,病人需用水清潔口腔，深咳肺部痰，不要唾液,#1,進行革蘭染色以評價標(biāo)本是否適于接種。向臨床醫(yī)生盡快報告重要的革蘭染色結(jié)果,#2,#3,,好：很少扁平上皮細(xì)胞,奧普托欣紙片,CO2中孵育48小時,#4,接種巧克力平皿，血平皿和麥康凱平皿,#5,拒絕：大量 扁平上皮細(xì)胞,,肺炎克雷伯菌,對重要病原菌進行鑒定&藥敏試驗,金黃色葡萄球菌,肺炎鏈球菌,膽汁溶菌＋,奧普托欣＋,,流感嗜血

7、桿菌,13,革蘭染色評估呼吸道標(biāo)本是否合格？,有代表性的好標(biāo)本中性粒細(xì)胞多白細(xì)胞>25/低倍視野鱗狀上皮細(xì)胞少＜ 10/低倍視野,14,痰標(biāo)本>10鱗狀上皮細(xì)胞/每低倍視野=拒收,,,,,,,,,19,,,#1,b,a,b,尿培養(yǎng)主要病原菌：大腸埃希菌，變形桿菌，克雷伯菌，其他革蘭陰性桿菌，腸球菌，腐生葡萄球菌，純的金葡球菌,#2,接種血平皿和麥康凱平皿,,#3,空氣孵育24小時,收集中段尿,a,#4,菌落計數(shù),

8、0.001ml接種環(huán),若? 2 種菌生長，對每種菌進行鑒定和藥敏試驗；若>2種菌生長，報告“混合菌群”,#5,注意:,革蘭陰性桿菌在血平皿和麥 康凱平皿上均生長良好革蘭陽性球菌僅在血平皿上生長良好,GNR,,,#6,,,,,,75,000 cfu/ml,50,000 cfu/ml,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

9、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,100,000 cfu/ml,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,GPC,20,膿，吸取物或組織標(biāo)本主要病原菌：金葡菌，化膿鏈球菌，其他β溶血鏈球菌，綠膿，其他革蘭陰性桿菌。非病原菌：凝固酶陰性葡萄球菌

10、，少量的棒狀革蘭陽性桿菌,用酒精消毒傷口周圍皮膚最好的標(biāo)本是吸取物和組織最差的標(biāo)本是拭子,#1,接種血平皿和麥康凱平皿如果是吸取物或組織，進行革蘭染色，將重要結(jié)果通知臨床醫(yī)生,#2,#3,銅綠假單胞菌,中孵育48小時,#4,對1或2種重要病原菌進行鑒定&藥敏試驗,金黃色葡萄球菌為主,β溶血鏈球菌,肺炎克雷伯菌,混合的2種腸道革蘭陰性桿菌：2種均報告；,當(dāng)檢出3種或更多病原菌時，報告“混合菌叢”并描述性列出假單胞菌，金葡

11、菌，變形桿菌，腸道革蘭陰性桿菌等。,#5,21,,,血培養(yǎng)主要病原菌：沙門菌、布氏桿菌、其他革蘭陰性桿菌、金葡菌、肺鏈、流感以下菌應(yīng)視為非病原菌(除非>1次血培養(yǎng)分離出)： 芽孢桿菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌、草綠色鏈球菌、棒狀革蘭陽性桿菌,,,從兩個獨立的皮膚位點采血，每瓶采集10ml,#1,35℃ 自動化儀器中孵育5天每天檢查濁度并翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,#2,#3,18小時后傳進行次代培養(yǎng)當(dāng)培養(yǎng)瓶顯示細(xì)菌

12、生長時進行革蘭染色和傳代培養(yǎng),,,革蘭陽性球菌?接種血平皿＋奧普托欣試驗,,革蘭陰性桿菌?接種血平皿和麥康凱平皿,革蘭陰性雙球菌或球桿菌?接種巧克力平皿和血平皿,,CO2中孵育72h,#5,#4,將重要的革蘭染色結(jié)果盡快通知臨床醫(yī)生,對重要病原菌進行鑒定和藥敏試驗,#6,例如：肺炎克雷伯菌,例如：肺炎鏈球菌,22,細(xì)菌的分離培養(yǎng),,,23,細(xì)菌的分離培養(yǎng),按實驗室常規(guī)接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)條件：35℃ 24-48小時或5%-10%

13、 CO2 35 ℃ 24 - 48小時厭氧培養(yǎng),,,,,,,,,28,具有特殊性狀的細(xì)菌,葡萄球菌,銅綠假單胞菌,溶血性鏈球菌,29,具有特殊性狀的細(xì)菌,矛頭狀,自溶現(xiàn)象,芽胞,,30,細(xì)菌的鑒定,表型分類法以細(xì)菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理、生化和血清學(xué)反應(yīng)等細(xì)菌的表型為主要依據(jù)分子生物學(xué)技術(shù)基因診斷依據(jù)分析DNA的堿基組成，基因片段的大小，與比較DNA的同源性關(guān)系，從而分析 細(xì)菌DNA的親緣關(guān)系。,31,流感嗜血桿菌的衛(wèi)星現(xiàn)象,32,

14、菌種鑒定—鑒定到種,根據(jù)純分細(xì)菌的形態(tài)、菌落特征，特征性的生化反應(yīng)，選擇合適的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。如手工的API條和半自動的ATB腸桿菌科細(xì)菌：API 20E非發(fā)酵革蘭陰性桿菌：API 20NE葡萄球菌屬：Slidex Staph Plus、API Staph鏈球菌屬：Slidex Strepto Kit、API Strep奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬：API NH厭氧菌：API 20A,33,菌種鑒定—鑒定到種,自動細(xì)菌鑒定/藥敏儀

15、VITEK 2 CompactBD Phoenix System MicroScanBIOMIC V3微生物鑒定系統(tǒng)BIOFOSUN微生物鑒定系統(tǒng)鑒定到種葡萄球菌？金黃色葡萄球菌！,細(xì)菌鑒定和藥敏試驗快速化是未來的趨勢,張嶸教授課件內(nèi)容,,,張嶸教授課件內(nèi)容,,,,張嶸教授課件內(nèi)容,CTX-M-14（+）,生理鹽水,頭孢噻肟,CTX-M-14（-）,質(zhì)譜檢測黏菌素耐藥鮑曼不動桿菌,Clinical Infectious D

16、iseases 2015; 60(9):1295–303,敏感株,耐藥株,,,張嶸教授課件內(nèi)容,39,抗菌藥物敏感性試驗,40,抗菌藥物和藥敏試驗,抗菌藥物是指具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學(xué)合成藥物。前者是真菌、放線菌、細(xì)菌等的代謝產(chǎn)物，后者是經(jīng)化學(xué)改造的半合成抗生素和化學(xué)合成藥物。測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法稱為藥物敏感性試驗（Antimicrobial Susceptibility Testing, A

17、ST），簡稱藥敏試驗。,41,抗菌藥物敏感性試驗的意義,無法推測敏感或耐藥病人個體化治療指南提供經(jīng)驗治療的依據(jù)建立當(dāng)?shù)鼗驀姨幏秸弑O(jiān)測流行病學(xué)趨勢監(jiān)測細(xì)菌耐藥性測試新抗菌藥物的抗菌活性 檢測新耐藥機制的方法,42,抗菌藥物敏感性試驗分類,定量方法 (MIC, mg/L)瓊脂稀釋法肉湯稀釋法E-test定性方法 (SIR)紙片擴散法自動化儀器,稀釋法的定義,以一定濃度的抗菌藥與含有被試菌株的培養(yǎng)基進行一系列對倍

18、數(shù)稀釋，經(jīng)培養(yǎng)后肉眼觀察未見細(xì)菌生長管內(nèi)所含的最低藥物濃度為該藥對該試驗菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)稀釋法的最大優(yōu)點是可以精確測得藥物最低抑菌濃度，但需耗費較多材料、人力和時間。,稀釋法的分類,稀釋法藥敏試驗因介質(zhì)不同可分為液體稀釋法和瓊脂稀釋法。因容器不同分為試管稀釋法和微量稀釋法，或稱常量法和微量。前者使用無菌的13mm×100 mm試管，每一濃度抗菌

19、藥的量至少為1ml；后者使用8×12的U型底小孔的微量稀釋板，小孔內(nèi)裝有0.1ml肉湯。瓊脂稀釋法又因在平皿中進行而稱為平皿稀釋法。微量稀釋法的優(yōu)點為試劑材料較節(jié)省，而且微量板中可預(yù)先配制好抗菌藥和培養(yǎng)基，冷藏后一定時期內(nèi)使用，較為方便。與試管稀釋法相比，瓊脂稀釋法配合多點接種器使用，可同時進行大量菌株的藥敏試驗，實驗結(jié)果重復(fù)性好，缺點是不能進行最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentra

20、tion, MBC)的測定。,與稀釋法藥敏試驗有關(guān)的指標(biāo)有哪些？,MIC：最低抑菌濃度MBC：最低殺菌濃度MIC50：抑制50%受試菌株的MIC值MIC90：抑制90%受試菌株的MIC值MBC50：殺死50%受試菌株的MBC值MBC90：殺死90%受試菌株的MBC值,瓊脂稀釋法,瓊脂選擇法是將藥物混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制含不同濃度藥物平板，使用多點接種器接種細(xì)菌。經(jīng)孵育后觀察細(xì)菌生長情況，以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板

21、所含藥物濃度為最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC ）試驗菌的結(jié)果報告可用MIC（ug/ml ）或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報告。,8,16,,,,,,,,,,,多點接種儀,試管稀釋法,試管稀釋法,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,16,32,,MIC＝1ug/ml,微量稀釋法,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,16,32,64,1

22、28,A,B,C,D,E,F,G,H,微量稀釋法,微量稀釋法結(jié)果閱讀,E-試驗,E試驗原理,E試條（E-test）是一條 5mm×50mm的無孔試劑載體，一 面固定有預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。將E試條放在細(xì)菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗菌藥物對細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）,結(jié)果判斷和報告,讀取橢圓抑菌環(huán)與E試驗試條的

23、交界點刻度值,E-試驗結(jié)果閱讀,紙片擴散法,58,紙片擴散法原理,將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。,59,紙片擴散法結(jié)果圖,60,規(guī)范化的藥敏試驗方法-擴散法(紙片法),原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散，因此敏感細(xì)菌在

24、紙片周圍一定距離內(nèi)的生長受到抑制，根據(jù)抑菌圈的大小即可推知該藥物的最低抑菌濃度（MIC）。,61,如何正確挑取細(xì)菌？,菌落？ 至少3個菌落，為什么？,可能丟失耐藥細(xì)菌(攜帶有耐藥質(zhì)粒的耐藥菌株) ….,62,正確的接種菌量,擴散法：0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?.5×108CFU/ml）,Select colonies,Prepare inoculumsuspension,63,充分混勻,標(biāo)準(zhǔn)濁度,菌苔厚度的要求,,,,,,Clin

25、Microbiol Infect 2014; 20: O831–O839,J Antimicrob Chemother, 2010; 65: 249-251,,接種菌量升高導(dǎo)致MIC升高,接種菌量升高導(dǎo)致改良Hodge試驗假陽性升高,,DMID,2004; 49: 41-46.,67,合適的培養(yǎng)基厚度,普通細(xì)菌MH瓊脂培養(yǎng)基（Mueller－Hinton Agar）培養(yǎng)基厚度：4mm肺炎鏈球菌及其他鏈球菌5％脫纖維羊血＋MH瓊脂

26、培養(yǎng)基嗜血桿菌屬嗜血桿菌培養(yǎng)基（HTM）＋SR158添加劑,錯誤做法：采用血瓊脂做腸球菌的藥敏試驗,68,4.合適的培養(yǎng)條件,需氧菌： 35℃ ±2 ℃ ，16-18小時嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌：20-24小時葡萄球菌：33-35 ℃ ，苯唑西林、萬古霉素 24小時腸球菌：萬古霉素-24小時溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、奈瑟氏菌屬等：20-24小時,69,5.正確閱讀結(jié)果（紙片法）,工具：游標(biāo)卡尺，尺子光

27、源：反射光、透射光閱讀： 藥敏平皿背襯不反光的黑色背景用肉眼觀察也可用機器閱讀抑菌圈直徑抑菌圈邊緣微弱生長的、僅能在放大鏡下才能觀察到的細(xì)小菌落應(yīng)忽略,,70,正確測量苯唑西林、萬古霉素和利奈唑胺對葡萄球菌；以及萬古霉素對腸球菌的抑菌圈直徑,透射光,反射光,,,70,不要用反射光,要使用透射光,抑菌圈內(nèi)有菌落，怎么辦？,,大腸埃希菌污染有腸球菌菌落再次純分,銅綠假單胞菌有耐藥菌落,,73,CLSI文件：我國部頒標(biāo)準(zhǔn),74,結(jié)

28、果判斷和報告：紙片擴散法—— 1株細(xì)菌1個藥1個標(biāo)準(zhǔn),用精確度為1mm的游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。通常采用CLSI公布的藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用三級劃分制。臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI 是我國的部頒標(biāo)準(zhǔn),腸桿菌科細(xì)菌判斷標(biāo)準(zhǔn),,,結(jié)果判斷和報告：稀釋法—— 1株細(xì)菌1個藥1個標(biāo)準(zhǔn),76,結(jié)果判斷和報告,敏感（Susceptible）：當(dāng)一種細(xì)

29、菌引起的感染，用某種藥物常規(guī)量治療有效，這種細(xì)菌即對該藥高度敏感。中度敏感（Intermediate）：當(dāng)細(xì)菌引起的感染僅在應(yīng)用高劑量抗菌藥物時有效，或者細(xì)菌處于體內(nèi)抗菌藥物濃縮的部位或體液（如尿、膽汁、腸腔等）中時才被抑制，這種細(xì)菌對該藥僅呈中度敏感。耐藥（Resistance）：藥物對某一細(xì)菌的藥敏高于藥物在血或體液內(nèi)可能達到的濃度時，有時細(xì)菌能產(chǎn)生滅活抗菌藥物的酶，則不論其MIC值大小如何，仍應(yīng)判定該菌為耐藥。例如產(chǎn)青霉素酶的

30、金葡菌即應(yīng)認(rèn)為該菌對青霉素耐藥。,77,6.重要的質(zhì)控菌,腸桿菌科細(xì)菌：大腸埃希菌ATCC25922非發(fā)酵菌： 銅綠假單胞菌ATCC27853葡萄球菌： 金黃色葡萄球菌ATCC25923腸球菌： 糞腸球菌ATCC29212肺炎鏈球菌： 肺炎鏈球菌ATCC49619嗜血桿菌： 流感嗜血桿菌ATCC49247,78,改變條件對于質(zhì)控的要求,79,改變條件對于質(zhì)控的

31、要求,80,紙片法藥敏試驗結(jié)果異常分析,81,天然耐藥,82,（二）正確的抗菌藥物組合,原則：針對監(jiān)測細(xì)菌設(shè)計監(jiān)測藥物的品種和數(shù)量CLSI抗菌藥物選擇的原則（A、B、C、U組）根據(jù)病原菌的種類革蘭陽性球菌葡萄球菌、腸球菌 、鏈球菌等革蘭陰性桿菌腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌等根據(jù)本單位臨床實際需要,83,FDA批準(zhǔn)臨床微生物室常規(guī)藥敏試驗分組,抗菌藥：A .為常規(guī)的一級(一線)試驗組合并常規(guī)報告結(jié)果B. 亦可用于

32、一級(一線)試驗，但應(yīng)選擇性報告，即當(dāng)A組藥物耐藥時可以選擇性地報告B組中的同類藥物C. 為補充性藥物，可選擇性報告U. 為補充性藥物,僅用于治療尿路感染的選擇用藥,83,84,補充性藥物選擇性報告的原則,對一線試驗組合的藥物耐藥身體特殊部位患者不能接受一線試驗組合的藥物一線試驗組合的藥物對患者無效復(fù)數(shù)菌感染多部位感染,84,85,腸桿菌科細(xì)菌的抗菌藥物選擇,,,,86,沙門菌屬、志賀菌屬細(xì)菌的抗菌藥物選擇,*腸道內(nèi)沙門菌

33、屬和志賀菌屬常規(guī)；**腸道外的沙門菌屬加報 對于從糞便中分離的沙門菌和志賀菌屬，常規(guī)僅測試和報告氨芐西林，一種喹酮類藥和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑。此外對于胃腸外分離的沙門菌屬還一定要測試并報告氯霉素及其某一種Ⅲ代頭孢菌素的結(jié)果。 警告：氨基糖苷體外可能表現(xiàn)對沙門菌屬和志賀菌屬有活性，但臨床卻無效，故不應(yīng)報它們?yōu)槊舾小?＜16歲骨骼系統(tǒng)未發(fā)育完全的小兒應(yīng)報頭孢曲松的結(jié)果，不報環(huán)丙沙星和氯霉素的結(jié)果,87,葡萄球菌的抗菌藥物選擇,*