解毒與活血配伍干預(yù)高脂血癥與動(dòng)脈粥樣硬化的臨床及機(jī)理研究

1、基金項(xiàng)目資助,高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（No.20060441002）中國博士后科學(xué)基金 （20070410622）國家中醫(yī)藥管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目 （04-05LP30）山東省中醫(yī)管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目,研究背景與研究思路,高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化（As）主要的病理基礎(chǔ)As導(dǎo)致的心腦血管疾病是當(dāng)今人類死亡的首位原因As易損斑塊（即“不穩(wěn)定斑塊”）的潰破、出血，隨后血栓形成，是引起急性冠脈綜合征（ACS）、急性腦梗死

2、等心腦血管病急癥的主要內(nèi)因,研究背景與研究思路,如何調(diào)脂、抗As、抑制As斑塊形成和穩(wěn)定斑塊，對于防治心腦血管疾病、改善其預(yù)后有著極重要的價(jià)值多種活血化瘀藥有調(diào)脂作用，活血化瘀防治As性疾病的療效已得到公認(rèn)如何進(jìn)一步提高活血化瘀藥對于此類疾病的療效、尋求更有效的中醫(yī)藥治法？值得我們深思。,研究背景與研究思路,Ross教授1999年提出的“As是一種炎癥性疾病”已得到學(xué)術(shù)界共識。炎癥介質(zhì)在As斑塊的起始、進(jìn)展以及斑塊的易損性（不穩(wěn)定性

3、）和最終破裂過程中，都起著重要作用。,研究背景與研究思路,將這一現(xiàn)代醫(yī)學(xué)新進(jìn)展聯(lián)系中醫(yī)藥理論和臨床，進(jìn)行中西醫(yī)結(jié)合創(chuàng)新性思考，我們認(rèn)為單純的活血化瘀對炎癥病理環(huán)節(jié)作用顯得不足，提出從毒邪致病理論對心血管病急重癥中醫(yī)病機(jī)與治則進(jìn)行創(chuàng)新探討的思路,研究背景與研究思路,7年前提出，不穩(wěn)定型心絞痛作為心絞痛的特殊類型具有毒邪致病的特點(diǎn)，毒損心絡(luò)為不穩(wěn)定型心絞痛的重要病機(jī)，解毒為其重要治法；5年前提出毒邪損心是充血性心力衰竭的重要病機(jī)，通過臨床

4、研究驗(yàn)證了益氣活血解毒的療效優(yōu)勢；后來又提出“毒、瘀致易損斑塊”和“解毒活血法穩(wěn)定易損斑塊”的假說。,研究背景與研究思路,相應(yīng)提出清熱解毒與活血化瘀配伍可望進(jìn)一步提高對相關(guān)疾病的療效。沿著這一思路，進(jìn)行了解毒與活血配伍，以及解毒與益氣活血配伍，防治高脂血癥、頸動(dòng)脈粥樣硬化、不穩(wěn)定型心絞痛等臨床研究和干預(yù)As斑塊、穩(wěn)定斑塊相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。,,C57BL株系,Jackson 實(shí)驗(yàn)室,,美國緬因州，世界上最重要的老鼠遺傳學(xué)研究中心之一,1

5、986-1989年培育出第一只基因敲除小鼠,ApoE基因敲除小鼠于1992年培育成功,,基因敲除小鼠,ApoE基因敲除小鼠,美國科學(xué)家于1992年培育成功的載脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠，在正常飲食下即可形成明顯的高脂血癥及彌漫纖維增殖性As損傷病灶。成為研究As發(fā)病機(jī)理、干預(yù)措施、篩選抗As藥物及機(jī)理研究較理想的動(dòng)物模型。,研究背景與研究思路,本課題組從2000年開始，在國內(nèi)外率先應(yīng)用ApoE基因敲除小鼠開展心血管病中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)

6、合基礎(chǔ)研究，得到多項(xiàng)基金資助 山東省自然科學(xué)基金（Y2001C14）國家自然科學(xué)基金（30472275）山東省科技項(xiàng)目（[2005]71-6）高校博士點(diǎn)科研基金（20060441002）,研究背景與研究思路,進(jìn)行血脂康、脂欣康、脈心康和多種單味活血化瘀、清熱解毒中藥以及多種解毒活血配伍藥對對ApoE基因敲除小鼠降脂、抗As及穩(wěn)定As易損斑塊作用與機(jī)理研究，為中醫(yī)藥防治高脂血癥、As及穩(wěn)定易損斑塊提供了科學(xué)依據(jù)，也為解毒與活血配伍

7、抗As研究奠定了基礎(chǔ)。,研究背景與研究思路,在此實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，結(jié)合長期臨床經(jīng)驗(yàn)，重點(diǎn)研究了若干解毒與活血配伍的創(chuàng)新藥對:虎杖與山楂配伍大黃與紅曲配伍虎杖與芎芍膠囊配伍,虎杖與山楂,虎杖具有解毒消腫、利濕等功效山楂擅長活血行滯而消積兩者配伍不僅有前期實(shí)驗(yàn)論證的基礎(chǔ)，而且已經(jīng)應(yīng)用于臨床科研，療效顯著。,虎杖與山楂,虎杖,,解毒消腫,利 濕,虎杖苷,,,,,,,抗炎作用,保護(hù)血管內(nèi)皮,抑制血小板聚集,抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖,抑制

8、血管平滑肌細(xì)胞增殖,,抗As,山楂,,活血行滯,消 積,山楂提取物,,,調(diào)節(jié)血脂作用,抗氧化作用,,,降壓作用,抑制血小板聚集,,,,為了深入研究解毒（虎杖）與活血（山楂）配伍的調(diào)脂、抗As、穩(wěn)定斑塊作用及其作用機(jī)制臨床研究——高脂血癥 頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊實(shí)驗(yàn)研究——ApoE基因敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞試驗(yàn),第一部分解毒與活血配伍干預(yù)高脂血癥與動(dòng)脈粥樣硬化的臨床研究

9、,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）治療中老年高脂血癥合并脂肪肝的臨床研究二、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）對頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及其穩(wěn)定性干預(yù)作用研究,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）治療中老年高脂血癥合并脂肪肝的臨床研究,,,研究方法與內(nèi)容,參照《血脂異常防治建議》標(biāo)準(zhǔn)、《非酒精性脂肪性肝病診斷標(biāo)準(zhǔn)》及《腹部疾病超聲診斷》制定。,,,本研究納入病例來自濟(jì)南市機(jī)床二廠集團(tuán)職工及家屬。,符合上述高脂血癥及脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)者。年齡在40～

10、69歲之間者。,診斷標(biāo)準(zhǔn),病例來源,納入標(biāo)準(zhǔn),,空白對照組 20例,,,山楂虎杖配伍組（活血解毒配伍組）,虎杖組（解毒組） 20例,山楂組（活血組） 20例,洛伐他汀組 20例,分組及治療方法,山楂提取物,虎杖提取物,山楂提取物及 虎杖提取物,洛伐他汀,不給予藥物,20例,A,B,C,D,E,,,,空白組,山楂組,,,觀察項(xiàng)目,安全性觀察,療效性觀察,臨床癥狀總療效,

11、,,對血脂的影響,,,,,降脂療效,,,對肝功能的影響,,對脂肪肝超聲聲像分度改善療效,,,,對炎癥因子的影響,,,,結(jié) 論,解毒活血配伍（虎杖山楂配伍）方案治療高脂血癥合并脂肪肝療效可靠，優(yōu)于單純解毒（虎杖）或活血（山楂），其作用機(jī)制與降脂、抗炎和保肝等有關(guān)。,二、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）對頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及其穩(wěn)定性干預(yù)作用研究,頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊檢測意義,,頸動(dòng)脈粥樣硬化的病變程度與心腦血管疾病的發(fā)生有直接的相關(guān)性

12、通過觀察頸動(dòng)脈粥樣硬化程度，可客觀地估計(jì)以As為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病的發(fā)病危險(xiǎn)性及治療效果,頸動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊的診斷,頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度（IMT） 是指動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜平滑肌的厚度，即由管腔內(nèi)膜面的前緣到中膜平滑肌與外膜交界面前緣的垂直距離。,穩(wěn)定性斑塊,,,,扁平斑,硬斑,,,,,軟斑,潰瘍斑,,,不穩(wěn)定性斑塊,解毒組（虎杖提取物組， A組）活血組（山楂提取物組 ，B組）解毒活血配伍組（虎杖提取物與山楂提取物配伍組， C組）

13、洛伐他汀對照組（D組）空白對照組（E組）各30例，療程6個(gè)月,,,,,,,,,各組病例治療后臨床癥狀總療效比較,,,,各組病例治療前后中醫(yī)癥狀積分比較,,*,*,*,*,頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標(biāo)比較,,,,,*,*,#,#,#,#,#,#,#,#,#,*,*,,頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標(biāo)比較,,*,#,#,#,,*,頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標(biāo)比較,,頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊超聲檢測指標(biāo)比較,,*,*,頸動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)檢測比較

14、,,,,,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,頸動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)檢測比較,,,,,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,,斑塊穩(wěn)定性血清指標(biāo)檢測,,*,*,*,*,,斑塊穩(wěn)定性血清指標(biāo)檢測,,*,*,*,*,#,#,,#,*,*,斑塊穩(wěn)定性血清指標(biāo)檢測,第二部分 研究結(jié)果,斑塊穩(wěn)定性血清指標(biāo)檢測,,#,*,*,,血壓水平比較,,*,*,*,*,,,血脂水平比較,*,*,*,*,小 結(jié),解毒與活血配伍顯著改善患者

15、癥狀顯著減小頸動(dòng)脈IMT、IMTarea、MIMT、斑塊積分，增大管腔內(nèi)徑，緩解管腔狹窄程度，改善頸動(dòng)脈斑塊超聲病理分型及頸動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)具有調(diào)脂、降壓、抗炎（降低hs-CRP、sICAM-1、sVCAM-1）、減少細(xì)胞外基質(zhì)降解（降低MMP-1及MMP-1/TIMP-1比值）等作用,小 結(jié),解毒與活血配伍具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、穩(wěn)定斑塊的作用解毒與活血配伍療效優(yōu)于單純解毒組、活血組及洛伐他汀組,第二部分解毒與活血配伍干預(yù)載

16、脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化泡沫化細(xì)胞形成機(jī)制研究,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化泡沫化細(xì)胞形成的炎癥機(jī)制研究 二、從PPARγ、ABCA1、CD36途徑探討解毒活血中藥配伍干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的分子機(jī)制,,ApoE基因敲除小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞較普通小鼠更容易攝取ox-LDL而形成泡沫細(xì)胞，是進(jìn)行體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞研究的理想選擇。單核巨噬細(xì)胞經(jīng)外

17、源性致炎物質(zhì)脂多糖（LPS）激活，攝取ox-LDL，并吞噬大量脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，是早期As的標(biāo)志。,,一、解毒與活血配伍（虎杖山楂配伍）干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化泡沫化細(xì)胞形成的炎癥機(jī)制研究,ApoE（-/-）小鼠,,腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng),,,分為B-G組與ox-LDL+LPS共孵育，并分別加藥干預(yù),B虎杖苷,C山楂提取物,D虎杖苷山楂提取物組,E洛伐他汀組,F羅格列酮組,G

18、模型組,A空白對照,,分別觀察0、24、48h三個(gè)不同時(shí)相的以下指標(biāo)變化,Westernblot,ELISA,TLR4NF-?B,TNF-αIL-1β,,,,,,,,,,,,,,,,,數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析,技 術(shù) 路 線,這部分工作明天上午將由劉美霞、劉龍濤博士匯報(bào),,,,IL-1β含量,,TNF-α含量,NF-κB蛋白表達(dá),TLR4蛋白表達(dá),結(jié) 論,解毒活血中藥配伍能顯著減少ox-LDL、LPS誘導(dǎo)的Ap

19、oE基因敲除小鼠腹腔巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)TLR4的表達(dá)，抑制NF-?B的激活，進(jìn)而減弱TLR4/NF-?B信號途徑及IL-1β、TNFα的合成與釋放，抑制炎癥反應(yīng)，干預(yù)巨噬細(xì)胞泡沫化，延緩As的發(fā)生與發(fā)展；解毒活血配伍的上述作用優(yōu)于羅格列酮，也優(yōu)于單純解毒或活血。,,二、從PPARγ、ABCA1、CD36途徑探討解毒活血中藥配伍干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的分子機(jī)制,PPARγ、 CD36與ABCA1,

20、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）調(diào)控體系是目前As研究中的熱點(diǎn)之一。PPARγ屬于核受體超家族中PPARs家族的成員，是配體依賴性的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪細(xì)胞分化和能量代謝中起關(guān)鍵性作用。,PPARγ、 CD36與ABCA1,B類清道夫受體CD36、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1 (ABCA1)都是PPARγ轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因。 PPARγ配體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已被證實(shí)具有抗As作用。近年研究表明PPARγ可通過其活化后對下游靶

21、基因CD36、ABCA1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控及相關(guān)細(xì)胞因子的釋放來影響As泡沫細(xì)胞的形成。,研究方法,ApoE（-/-）小鼠,,腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng),,,分為B-G組與ox-LDL+LPS共孵育，并分別加藥干預(yù),B虎杖苷,C山楂提取物,D虎杖苷山楂提取物,E洛伐他汀,F羅格列酮,G模型組,A空白對照,,分別觀察0、24、48h三個(gè)不同時(shí)相的以下指標(biāo)變化,RT-PCR,PPARγCD

22、36ABCA1,,,,,,,,,,,,數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計(jì)分析,PPARγ上游引物為5?-CCC TGG CAA AGC ATT TGT AT -3?， 下游引物為5?-AAT CCT TGG CCC TCT GAG AT-3?（403bp）； ABCA1上游引物為5?-CAG ATG CCC TAC CCC TGT TA-3?， 下游引

23、物為5?- GGG AGA AGA GCG TGC TAA TG-3?（364bp）； CD36 上游引物為5?-CCT TAA AGG AAT CCC CGT GT -3?，下游引物為5?-CCA ATG GTC CCA GTC TCA TT-3?（418bp）； β-actin上游引物為5?- TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA -3?，下游引物為5?- TCA GGA GGA

24、 GCA ATG ATC TTG -3?（302bp）。,各引物序列,細(xì)胞總RNA提取及RT-PCR反應(yīng)均采用RT-PCR檢測細(xì)胞因子試劑盒（購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司）。 收集10^7細(xì)胞沉淀提取細(xì)胞總RNA，取1ug逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行）。,RNA提取和RT-PCR反應(yīng),擴(kuò)增條件 94度1分鐘，58度1分鐘，72度 1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72度延長7分

25、鐘。 取各基因擴(kuò)增產(chǎn)物10ul，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，多功能紫外投射反射分析儀下觀察并拍照，采用美國Kodak凝膠分析系統(tǒng)，應(yīng)用1 D Image Analysis Software進(jìn)行產(chǎn)物灰度圖像分析，以各基因與β-actin的電泳條帶光密度值的比值作為各基因的相對表達(dá)量。,,研究結(jié)果1,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細(xì)胞PPARγmRNA表達(dá)的影響,研究結(jié)果 1,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)

26、小鼠巨噬細(xì)胞PPARγmRNA表達(dá)的影響,,,,,#,#,#,,#,與模型組比較,與解毒活血配伍組比較,研究結(jié)果2,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細(xì)胞ABCA1mRNA表達(dá)的影響,研究結(jié)果2,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細(xì)胞ABCA1mRNA表達(dá)的影響,,,,,,,#,#,#,與解毒活血配伍組比較,與模型組比較,#,,研究結(jié)果3,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細(xì)胞CD36mRNA表達(dá)的影響,研

27、究結(jié)果3,解毒活血中藥配伍對ApoE(-/-)小鼠巨噬細(xì)胞CD36mRNA表達(dá)的影響,,,#,#,#,#,與解毒活血配伍組比較,#,小 結(jié),用ox-LDL、LPS刺激ApoE(-/-)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，可以誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的形成，細(xì)胞內(nèi)PPARγ、ABCA1、CD36的mRNA表達(dá)均顯著增高。,小 結(jié),與模型組比較，以洛伐他汀、羅格列酮作為對照，以解毒中藥虎杖、活血中藥山楂及其配伍作為主要研究藥物進(jìn)行干預(yù)48h后，各用藥

28、組PPARγ、ABCA1的mRNA表達(dá)均顯著增高，各用藥組CD36mRNA的表達(dá)顯著降低，解毒活血配伍組優(yōu)于單純解毒組、活血組及洛伐他汀組，相當(dāng)于或優(yōu)于羅格列酮組。,研究提示,解毒活血中藥配伍具有與羅格列酮相似的PPARγ激動(dòng)作用，可能通過激活PPARγ，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)下游靶基因CD36、ABCA1及炎癥因子的表達(dá)，干預(yù)ox-LDL-PPARγ-CD36與ox-LDL-PPARγ-ABCA1兩條信號通路，使ABCA1mRNA表達(dá)

29、上調(diào)、CD36mRNA表達(dá)下調(diào)，從而起到顯著抑制巨噬細(xì)胞泡沫化過程，最終達(dá)到抗As的作用。解毒活血中藥配伍有望成為中醫(yī)藥領(lǐng)域抗As泡沫細(xì)胞形成的新型藥物。,結(jié) 語,臨床研究表明虎杖與山楂配伍所體現(xiàn)的解毒活血配伍方案，干預(yù)高脂血癥、頸動(dòng)脈粥樣硬化等，臨床療效突出，并具有降脂、抗As、抑制及穩(wěn)定斑塊等作用，初步闡明其抗炎、調(diào)脂、減少細(xì)胞外基質(zhì)降解、降壓與改善血流動(dòng)力學(xué)等作用機(jī)理，顯著優(yōu)于單純活血或解毒。,結(jié) 語,基礎(chǔ)

30、實(shí)驗(yàn)研究表明，該解毒活血配伍藥對抑制巨噬細(xì)胞泡沫化、抗As作用的機(jī)制，一方面是通過抑制泡沫細(xì)胞內(nèi)TLR4的表達(dá)，抑制NF-?B的激活，進(jìn)而減弱TLR4/NF-?B信號途徑及IL-1β、TNFα的合成與釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)；,結(jié) 語,另一方面具有與羅格列酮相似的PPARγ激動(dòng)作用，其可能通過激活PPARγ，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)下游靶基因CD36、ABCA1及炎癥因子的表達(dá)，干預(yù)ox-LDL-PPARγ-CD36與ox-LDL-PPAR

31、γ-ABCA1兩條信號通路，使ABCA1mRNA表達(dá)上調(diào)、CD36mRNA表達(dá)下調(diào)。,結(jié) 語,解毒活血配伍對這兩方面機(jī)制的幾乎所有指標(biāo)的作用均顯著優(yōu)于單純解毒或活血。這些抗炎途徑調(diào)控機(jī)制不僅抑制As形成與發(fā)展，對干預(yù)As斑塊易損性、促使斑塊穩(wěn)定也可望發(fā)揮重要作用。,結(jié) 語,解毒與活血兩者配伍，對提高活血化瘀療法的療效有重要價(jià)值，可望更好地發(fā)揮中醫(yī)藥多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)干預(yù)病理過程的優(yōu)勢，有助于提高其干預(yù)As形成、發(fā)展