抗菌藥物敏感試驗(yàn)

1、第四章 抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)的意義1、可預(yù)測(cè)抗菌治療的效果2、指導(dǎo)臨床抗菌藥物的使用3、發(fā)現(xiàn)或提示細(xì)菌耐藥機(jī)制，幫助臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物4、監(jiān)測(cè)細(xì)菌的耐用性，分析耐藥菌的變化，預(yù)防和控制耐藥菌感染的發(fā)生和流行,抗菌藥物的敏感性試驗(yàn),常用方法：,紙片擴(kuò)散法微量液體稀釋法E-TEST法,原理： 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周?chē)鷶U(kuò)

2、散形成遞減的梯度濃度，在紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥?nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。,紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法）,操作方法 ：1.將在約56℃恒溫的無(wú)菌M-H（水解硌蛋白）瓊脂傾注直徑為90mm的平板，其厚度 4mm。,2.無(wú)菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5個(gè)菌落。,3.置于無(wú)菌生理鹽水中，校正其濁度于Mc

3、Farland No 0.5管。,4.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。棉簽在三個(gè)方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。,5.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置3~10分鐘 后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。,6.根據(jù)選擇的菌株挑選相應(yīng)的抗菌紙片。腸桿菌科：氨芐西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、亞胺培

4、南、氨曲南、慶大霉素；銅綠假單胞菌：頭孢他啶、慶大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、亞胺培南；葡萄球菌屬：頭孢西丁、青霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉 素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平 ；,腸球菌屬：青霉素 、萬(wàn)古霉素 、甲氧芐啶/磺胺異 噁唑 、慶大霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氨芐西林不動(dòng)桿菌屬：頭孢他啶 、亞胺培南、阿米卡星、哌拉 西林/他唑巴坦、頭孢吡肟 、頭孢曲松 、環(huán)丙沙

5、 星、米諾環(huán)素；洋蔥伯克霍德菌：頭孢他啶 、米諾環(huán)素、甲氧芐啶/磺 胺異噁唑 、美羅培南 ；,嗜麥芽窄食單胞菌：甲氧芐啶/磺胺異噁唑、左氧氟沙 星、米諾環(huán)素 ；嗜血桿菌屬：氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、頭孢 他啶、美羅培南、阿奇霉素、環(huán)丙沙星、頭孢克洛；淋病奈瑟菌：頭孢曲松、環(huán)丙沙星、青霉素、大觀霉素、 四環(huán)素 ；肺炎鏈球菌：紅霉素 、苯唑西林 、甲氧芐啶/磺胺異噁唑、克林霉素

6、、左氧氟沙星、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素 ； 除肺炎鏈球菌外的其他鏈球菌：紅霉素、青霉素、克林霉素、萬(wàn)古霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星。,7.用無(wú)菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂 的表面，一旦紙片貼上，不能移動(dòng)；各抗菌紙片中 心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。,8.經(jīng)過(guò)35℃16～24h孵育。,9.取抑菌環(huán)直徑，根據(jù) CLSI（clinical and laboratory sta

7、ndards institute ）標(biāo)準(zhǔn)，報(bào) 告細(xì)菌對(duì)該抗生素 敏感(susceptible,S)、 耐藥(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。,原理： 聚乙烯板內(nèi)含有各種稀釋度的抗菌藥物，實(shí)驗(yàn)時(shí)加入100μl濃度為105 CFU/ml的菌液，蓋上蓋板，35℃16～20h觀察結(jié)果?？椎撞壳逦怀霈F(xiàn)細(xì)菌沉淀的最低抗菌藥物濃度即為該抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度，通過(guò)CLSI標(biāo)

8、準(zhǔn)判斷其敏感和耐藥。再取0.01ml容量接種環(huán)取肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的液體接種于血瓊脂平板作次代培養(yǎng)，經(jīng)35℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀察最低抗菌藥物濃度能殺死99.9％原始種入的細(xì)菌即為該菌的最低殺菌濃度(MBC)。,微量液體稀釋法 (microdilution test),操作方法：1.抗菌藥物的稀釋和融解,2.抗菌藥物母液的稀釋,3.在微量聚乙烯微板孔中加入各種不同濃度的抗生素 100μl，從低濃度往高濃度加樣，不需要更換吸管。,4.挑選

9、18~24小時(shí)的菌落置M-H肉湯增菌4~6小時(shí)。,5.制備0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，然?:200稀釋，使之最終 濃度105 CFU/ml。,6.用微量加樣器接種100μl 到96孔中，蓋上蓋板。 同時(shí)作陽(yáng)性、陰性對(duì)照。,7.手工看濁度或儀器自動(dòng) 判讀。按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)報(bào) 告細(xì)菌對(duì)某抗菌藥物為 敏感、耐藥和中介。,原理： E試條是一條5mm×50mm無(wú)孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的濃度

10、呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和判別的刻度?？咕幬锏奶荻瓤筛采w有20個(gè)MIC對(duì)倍稀釋濃度的寬度范圍。將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過(guò)夜，圍繞試條明顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細(xì)菌的最小抑菌濃度，對(duì)照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其敏感、耐藥、中介。,E-TEST,1.挑取16～20h的菌落2.用無(wú)菌生理鹽水制備成0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木骸?操作方法：,3.用無(wú)菌棉簽浸入細(xì)菌懸

11、液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過(guò)多的菌液。棉簽在三個(gè)方向平均涂抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。,4.用鑷子將E-TEST試條的抗菌藥物的一面貼向瓊脂表 面，有刻度的一面向外，直徑140mm的平板可放置 6條，90mm平板只能放置1～2試條 。5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。,6.孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交 處的刻度即為抗菌藥物對(duì)該菌的最低抑菌濃度(M

12、IC) 。,第九節(jié) 細(xì)菌的分類命名,一、分類原則:細(xì)菌的分類原則上分為傳統(tǒng)分類和種系分類。,分類方法：（1）人為分類法： 以細(xì)菌形態(tài)和生理生化特征為依據(jù)，分為： 傳統(tǒng)分類法 和 數(shù)值分類法（2）系統(tǒng)分類法：以細(xì)菌大分子物質(zhì)（核酸、蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)的同源程度進(jìn)行分類，稱為種系分類或自然分類,具體到細(xì)菌鑒定和分類的方法包括⒈表型分類：以細(xì)菌的形態(tài)和生理特征為依據(jù)的分類方法，即選擇一些較為穩(wěn)定的生物學(xué)性

13、狀，如菌體形態(tài)與結(jié)構(gòu)、染色性、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)、抗原性等作為分類的標(biāo)記，它奠定了傳統(tǒng)分類的基礎(chǔ)。,⒉分析分類：應(yīng)用電泳、色譜、質(zhì)譜等方法，對(duì)菌體組分、代謝產(chǎn)物組成與圖譜等特征進(jìn)行分析，為揭示細(xì)菌表型差異提供了有力的手段。,⒊基因型分類：分析細(xì)菌的遺傳物質(zhì)，揭示了細(xì)菌進(jìn)化的信息，是最精確的分類方法。包括DNA堿基組成（G+C mol%）、核酸分子雜交（DNA-DNA同源性、DNA-rRNA同源性）和16S rRNA同源性進(jìn)行分析。其中1

14、6S rRNA更為重要，因其在進(jìn)化過(guò)程中保守、穩(wěn)定，很少發(fā)生變異，是種系分類的重要依據(jù)。,國(guó)際上最具權(quán)威性的細(xì)菌分類系統(tǒng)專著《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》（1984）和《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》（第9版，1994）都已反映了細(xì)菌種系分類的研究進(jìn)展。最新出版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》（第2版，2004）已收集了4000余種模式菌株的16S rRNA序列，將原核生物分為兩個(gè)域，即古生菌域和細(xì)菌域，前者分為2個(gè)門(mén)，后者分為24個(gè)門(mén)，依次再分為綱、目、

15、科、屬、種。,細(xì)菌與生物分類相同: 介、門(mén)、綱、屬、種、型,分類：屬（genus）, 種（species） 型（type）， 株（strain）,二、種、型、株的概念,種（species）：生物學(xué)性狀相似的群體 組成，是細(xì)菌分類的最基本單位,型（type）：同一種細(xì)菌也存在有差異 差異小者稱型; 差異大

16、者稱亞種或變種,株（strain）：不同來(lái)源的同一種細(xì)菌稱株,標(biāo)準(zhǔn)株（standard strain ）：　　　　通過(guò)生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定 　的,具有某種細(xì)菌典型特征， 　　 中科院保存的菌株。也稱模式株,命名：拉丁文雙名法即屬名在前,種名在后,Staphylococcus aureus ：金黃色葡萄球菌簡(jiǎn)寫(xiě)：Ｓ． aureus,Mycobacterium tuberculos