心房纖顫患者血栓前狀態(tài)及心房電重構(gòu)的實驗研究

1、,心房纖顫患者血栓前狀態(tài)及心房電重構(gòu)的實驗研究,在職博士研究生：孫燕淑導(dǎo)師：汪麗蕙教授 祁蕓蕓教授北京大學(xué)第一醫(yī)院,前 言,前 言,心房纖顫是常見的心律失常 房顫并發(fā)的以缺血性腦卒中為主的血栓栓塞嚴(yán)重危害人類健康和生命血栓前狀態(tài)（PTS）作為一種重要的臨床現(xiàn)象近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注及時識別PTS，確定房顫患者中的高危人群，將有助于預(yù)防和減少栓塞事件的發(fā)生,,本研究提出房顫患者的PTS，并通過檢測

2、房顫患血漿中PTS分子標(biāo)志物的水平，探討房顫患者PTS的形成機(jī)制，尋找評估房顫患者栓塞危險性的新手段，以指導(dǎo)抗凝治療。,前 言,,心房纖顫具有自身延續(xù)性，慢性房顫的發(fā)生與維持似乎與房顫本身有關(guān)。據(jù)此，Allessie等提出了房顫引發(fā)房顫的觀點(diǎn)。在房顫的持續(xù)過程中，房顫本身可導(dǎo)致心房電生理學(xué)特性的變化，即心房電重構(gòu)（AER）。研究表明，在AER中心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷起了重要作用肌漿網(wǎng)鈣泵在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度方面起決定作用

3、,前 言,,本研究采用RT-PCR方法，通過在分子生物學(xué)水平測定心房肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的mRNA表達(dá)，探討房顫患者AER的機(jī)制，以加深對房顫本質(zhì)的認(rèn)識，從而使房顫預(yù)防和治療的新的方法成為可能。,前 言,,第一部分,房顫患者血漿中PTS分子標(biāo)志物的測定,,材料與方法,一、研究對象及分組情況,1. 房顫組：共29例，男17例，女12例。年齡39—78（62.4±10.5）歲，為我院住院或急診留觀的非

4、瓣膜病Af患者。Af由多次ECG診斷。根據(jù)Af性質(zhì)又分為：1.1 持續(xù)房顫組：18例。年齡39—79（64.1±11.0）歲，Af發(fā)作持續(xù)時間均≥3個月。1.2 陣發(fā)房顫組：11例。年齡42—74（59.6±9.5）歲，均在Af發(fā)作期，且發(fā)作時間均≥48小時。2. 對照組：共26例，男16例，女10例。年齡45—85（60.9±11.8）歲，均為竇性心律者。,,（1）,房顫組與對照組的所有入選對象均除

5、外心絞痛、心肌梗塞，心電圖及Holter均未見缺血性改變。無明顯高脂血癥、無糖尿病、腦梗塞、心功能不全及腫瘤。房顫組有11人服抗凝藥，為巴米爾0.1Qd或抵克利得0.25Qd，對照組均未服用抗凝藥。,一、研究對象及分組情況,,（2）,二、主要設(shè)備及制劑 （1）,1.主要儀器、設(shè)備流式細(xì)胞儀 美國Becton-Dickinson公司酶標(biāo)儀 美國光度計

6、 美國恒溫水浴箱 上海醫(yī)療器械廠水平混合器 江西醫(yī)療器械廠50—200μl八通道加樣器100—200μl，10、25、50、100、500μl加樣器,,2.試劑CD61抗體 美國Becton-Dickinson公司PAC-1抗體

7、 美國Becton-Dickinson公司鼠IgM 美國Becton-Dickinson公司FITC熒光染料 美國Becton-Dickinson公司1%多聚甲醛血栓調(diào)節(jié)蛋白ELISA法試劑盒 美國ADI公司牛血清白蛋白（BSA） 美國Sigma公司0.5

8、M H2SO4酶標(biāo)TAT微孔板 美國D-二聚體ELISA法測定試劑盒 美國,,二、主要設(shè)備及制劑,（2）,三、實驗方法,血漿血小板膜糖蛋白(GPIIb/IIIa)水平的測定 ——全血法流式細(xì)胞術(shù),,標(biāo)本制備：粗針頭取空腹靜脈血2.7ml，3.8%枸櫞酸鈉抗凝。對照管及測定管各加血5?l， 然后各加CD6110?l。測定管中加PAC-1 10?l，對照管加

9、鼠IgM10?l，混勻。避光20分鐘。1%多聚甲醛1ml固定。 測定：用流式細(xì)胞儀檢測樣本。檢測結(jié)果用特異性熒光抗體結(jié)合陽性血小板的百分率，即GPIIb/IIIa陽性血小板的百分?jǐn)?shù)表示。,血漿血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）水平的測定 ——ELISA法 血漿凝血酶-抗凝血酶III復(fù)合物（TAT）的測定——ELISA法血漿二聚體D（D-dimer）的測定——ELISA法,三、實驗方法,,TM標(biāo)準(zhǔn)曲線,,Y=0.55+0.64lnX,TAT

10、標(biāo)準(zhǔn)曲線,,Y=0.18+0.02X,D-dimer標(biāo)準(zhǔn)曲線,,Y=0.175+0.002X,統(tǒng)計學(xué)處理,應(yīng)用SPSS For Windows 8.0軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗，方差分析，單變量相關(guān)分析，回歸分析等統(tǒng)計學(xué)方法。取<0.05為統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性。,,結(jié) 果,入選對象共55人，其中房顫組29人，對照阻26人。房顫組又分為：持續(xù)房顫組18人，陣發(fā)房顫組11人。,,入

11、選者的一般情況,*房顫組vs對照組P>0.05,入選者的一般情況,,房顫組GPIIb/IIIa測得值明顯高于對照組，差 別具有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),房顫患者血漿GPIIb/IIIa的變化,表2. 房顫組與對照組GPIIb/IIIa比較,*房顫組與對照組相比P<0.01,,房顫組與對照組血漿GPIIb/IIIa比較,,持續(xù)房顫組的GPIIb/IIIa水平明顯高于陣發(fā)房顫組，差別有高度顯著性(P<0.01

12、)，,房顫患者血漿GPIIb/IIIa的變化,表3. 持續(xù)房顫組與陣發(fā)房顫組GPIIb/IIIa比較,*持續(xù)房顫組與陣發(fā)房顫組相比P<0.01,,持續(xù)房顫組與陣發(fā)房顫組GPIIb/IIIa比較,,各組之間GPIIb/IIIa比較,,房顫時間與GPIIb/IIIa水平的相關(guān)性,,房顫患者血漿TM水平的變化,表4. 房顫組與對照組血漿TM水平比較,*房顫組與對照組相比P<0.01,與對照組相比，房顫組的血漿TM水平顯著升高，兩者

13、差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),,房顫組與對照組血漿TM水平比較,房顫患者血漿TM水平的變化,表5. 持續(xù)房顫組與陣發(fā)房顫組血漿TM比較,*持續(xù)房顫組與陣發(fā)房顫組相比P<0.01,持續(xù)房顫組的TM水平高于陣發(fā)房顫組，差異有顯著性(P<0.01),,持續(xù)房顫組與陣發(fā)房顫組TM比較,,房顫患者血漿TM水平的變化,表6. 陣發(fā)房顫組與對照組血漿TM水平比較,*持續(xù)房顫組與陣發(fā)房顫組相比P<0.01,陣發(fā)房顫組的TM水

14、平較對照組高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),,各組之間血漿TM水平比較,,表7. 房顫組與對照組血漿TAT水平比較,*房顫組與對照組比P<0.05,房顫患者的血漿TAT水平比對照組有所升高，二者差別有顯著性(P<0.05),房顫患者血漿TAT水平的變化,,房顫組與對照組血漿TAT水平比較,,表8. 持續(xù)房顫與陣發(fā)房顫組血漿TAT比較,*持續(xù)房顫與陣發(fā)房顫組比P>0.05,持續(xù)房顫組與陣發(fā)房顫組比較，其TAT值

15、無顯著差異(P>0.05),房顫患者血漿TAT水平的變化,,表9. 陣發(fā)房顫組與對照組TAT水平比較,*陣發(fā)房顫組與對照組比P>0.05,陣發(fā)房顫組與對照組相比，血漿TAT水平高于對照組，但差異無顯著性(P>0.05),房顫患者血漿TAT水平的變化,,各組之間血漿TAT水平比較,,# &,*,# P0.05& P<0.05,表10. 房顫組與對照組血漿D-dimer水平比較,*房顫組與對照組相

16、比P>0.05,房顫組與對照組相比，血漿D-dimer水平升高，但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.06),房顫患者血漿D-dimer的變化,,房顫組與對照組血漿D-dimer比較,,*,* P>0.05,表11. 持續(xù)房顫組與對照組血漿D-dimer水平比較,*持續(xù)房顫組與對照組相比P<0.05,持續(xù)房顫組血漿D-dimer水平比對照組明顯升高，差別具有顯著性（P<0.05）,房顫患者血漿D-dimer的變化,,持

17、續(xù)房顫組與對照組血漿D-dimer比較,,表12. 各組血漿D-dimer水平比較,*陣發(fā)房顫組與對照組相比P>0.05#持續(xù)房顫組與陣發(fā)房顫組相比P>0.05,持續(xù)房顫組的D-dimer水平較陣發(fā)房顫組高，但差別無顯著性(P>0.05)；陣發(fā)房顫組的血漿D-dimer水平較對照組高，但差別亦無顯著性(P>0.05),房顫患者血漿D-dimer的變化,,各組之間血漿D-dimer水平比較,,房顫患者心房心肌細(xì)胞

18、肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase mRNA的基因表達(dá),第二部分,,材料和方法,入選者均為我院及安貞醫(yī)院心外科行換瓣術(shù)和冠脈搭橋術(shù)的病人，共28例。標(biāo)本于術(shù)中取材于心房或心耳組織。根據(jù)有無房顫分為：1. 房顫組：15人，其中男9人，女6人。年齡35—67(48.13±8.07)歲，均為持續(xù)房顫患者，且房顫持續(xù)時間均>3個月。2. 對照組：13人，其中男8人，女5人。年齡34—67(51.08±11.89)歲，均為

19、竇性心律者，且既往無心律失常病史。兩組之間年齡、性別無顯著差異（P>0.05）。,,病人來源及分組,高速恒溫離心機(jī)RC5C 德國Dupont 公司低溫離心機(jī)J6-B 美國Beckman 公司UV-2100紫外分光光度計 日本島津公司PE2400 PCR儀 美國激光圖像分析儀 瑞典Pha

20、rmacia 公司電泳儀 北京科普儀器廠10μl、20μl、200μl及1000μl加樣器,主要設(shè)備,,異硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate） GiBCO公司十二烷基肌氨酸鈉（Sarcosyl） 美國Sigma公司ß-巰基乙醇

21、 美國Sigma公司重蒸酚 岳泰公司逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV） 美國Promega公司dNTPs 美國Promega公司隨機(jī)引物

22、 美國Promega公司焦碳酸二乙酯（DEPC） 美國Sigma公司Taq聚合酶 華美公司TaqⅠ(Buffer E )

23、 華美公司其余均為國產(chǎn)分析純,試劑、藥品,,實驗方法,RT-PCR,實驗步驟,反應(yīng)過程：RNA 2μg隨機(jī)引物 2μl70℃反應(yīng)5分鐘后立即將管取出并置于冰浴中，加入以下試劑：5×轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 5μldNTP(10mM) 1.25μlM-MLV(

24、200u/μl) 1μl 加DEPC水至總體積25μl混勻后于37℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1小時。75℃反應(yīng)10分鐘使酶滅活。,,,,一步法提取總RNARNA逆轉(zhuǎn)錄,PCR（1）,引物序列肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase：正義鏈 5’ TTGCATTGCAGTCTGGATCA反義鏈 5’ TCCAAAGCAGAGTCATTACA合成片段長度為477bpß-actin（對照）：正義連

25、 5’ ATCTGGCACCACACCTTC反義鏈 5’ GCCAGGTCCAGACGCA合成片段長度288bp,,PCR（2）,反應(yīng)體系（50μl）10×聚合酶緩沖液 5μldNTP(10mM) 1μl引物（ß-actin、Ca2+-ATPas

26、e）上游 12.5pmol 下游 12.5pmolDNA 1μlTaq酶(3u/μl) 0.5μ

27、l 加水至總體積50μl,,,PCR（3）,反應(yīng)條件及循環(huán)參數(shù)94℃×5min→94℃×30s→57℃×30s→72℃×45s→72℃×7min   30cyclesPCR產(chǎn)物行電泳及染色后采用激光圖像分析儀測定條帶積分光密度（IOD）,,,,,統(tǒng)計學(xué)分析,采用SPSS Fo

28、r Windows 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)按樣本性質(zhì)分別進(jìn)行t檢驗，方差分析等，取P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。,,結(jié) 果,房顫組房顫時間均大于3個月，對照組均為竇性心律者，且既往無心律失常史。,*房顫組與對照組比較P>0.05,兩組一般情況比較,,*與對照組相比P<0.05,兩組心房肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase mRNA表達(dá)量的比較,,房顫組與對照組肌漿網(wǎng)Ca2+

29、-ATP酶mRNA表達(dá)量比較,,*兩組相比P>0.05 (P=0.13),不同取材部位的標(biāo)本Ca2+_ATPasemRNA表達(dá)量的比較,,*兩組相比P>0.05 (P=0.86),不同性別的標(biāo)本Ca2+-ATPasemRNA表達(dá)量的比較,,房顫組與對照組肌漿網(wǎng)Ca2+ -ATP酶mRNA表達(dá)量比較,,討 論,討 論（1）,房顫患者血漿GPIIb/IIIa水平的變化房顫患者血漿TM水平的變化房顫患者

30、血漿TAT及D-dimer水平的變化檢測房顫患者血漿中PTS分子標(biāo)志物的意義,,討 論（2）,細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷與心房電重構(gòu)（AER）房顫患者肌漿網(wǎng)Ca2+ -ATP酶 mRNA水平變化與細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷的關(guān)系房顫的離子通道重構(gòu)及其分子機(jī)制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷對房顫離子通道重構(gòu)的影響,,結(jié) 論,結(jié) 論（1）,房顫可引起內(nèi)皮細(xì)胞功能的損傷和血小板激活，血小板激活程度與房顫的持續(xù)時間呈正相關(guān)房顫

31、可激活全身凝血系統(tǒng)，并引起繼發(fā)纖溶亢進(jìn)房顫患者處于血栓前狀態(tài)（PTS）檢測房顫患者血漿中PTS分子標(biāo)志物水平可成為評估房顫患者栓塞危險性的手段之一。這對指導(dǎo)抗凝治療，減少栓塞事件的發(fā)生有重要意義,,結(jié) 論（2）,持續(xù)房顫患者心房心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase的mRNA表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)鈣泵對Ca2+的攝取減少。這加重了房顫患者細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷 細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷及與其相關(guān)的膜離子通道重構(gòu)是心房電重構(gòu)（AE