庫特氏華癸菌漆酶在畢赤酵母中的高效表達及其酶學性質研究.pdf

1、漆酶是一種酚氧化酶，屬于多銅氧化酶家族，4個Cu2+作為輔因子與酶的催化活性中心結合。漆酶的底物包括多種酚類和非酚類物質，且催化氧化的過程中所需能量少，不額外產生有害的副產物，故漆酶作為一種經濟環(huán)保的綠色催化劑，廣泛應用于環(huán)境保護、織物印染、紙漿漂白、生物能源、食品制造、生物傳感器、化學合成等諸多領域。本實驗研究了Kurthia huakuii漆酶在畢赤酵母中的高效表達及其基本酶學性質，并驗證了其在染料脫色應用中的可行性。
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2、.將來源于Kurthia huakuii LAM0618的漆酶基因通過密碼子、GC含量及mRNA二級結構優(yōu)化后，克隆到基于pPIC9K改造的載體pPIC9K-NTS上。重組載體經過單酶切線性化后電轉入Pichia pastoris GS115中，通過濃度梯度的遺傳霉素(G418)篩選獲得外源基因高拷貝整合的轉化子。然后通過誘導蛋白表達并檢測酶活進一步篩選得到一株高表達菌株。
　　2.在搖瓶水平優(yōu)化重組畢赤酵母的誘導條件，得出的結論

3、為:該重組菌在28℃下誘導時，誘導培養(yǎng)基中添加1.0％的Tween80，每12h添加誘導劑甲醇的量為發(fā)酵液體積的1.0％，表達產物的酶活性最高，72h酶活可達6877.24U/mL，遠高于目前文獻所提到的最高水平;
　　3.酶學性質實驗表明，以10mmol/L2，6-DMP（2，6-二甲氧基苯酚）作為底物時最適反應溫度65℃;酶的熱穩(wěn)定性較好，在90℃下保溫6h仍有70％以上的酶活;最適反應pH=7.0，但pH適應范圍較窄，pH＜

4、7.0或者pH＞8.0時酶活力迅速喪失;酶反應最適Cu2+濃度0.04mmol/L;1 mmol/L EDTA就能完全抑制酶活力，3mmol/L PMSF使相對酶活降低到60％;1mmol/L Mn2+能促進酶活。除此之外常見的金屬離子無論濃度高低，絕大多數都會抑制酶活力。
　　4.將誘導表達所得的粗酶液進行染料脫色實驗，結果表明在65℃下靜置反應6h，該漆酶對的孔雀綠(10mg/L)和燦爛綠(10mg/L)效果較好，降解率分別可

5、達到86.50％和70.82％;對剛果紅(500mg/mL)、堿性品紅（50mg/mL）和亞甲基藍（10mg/mL）有脫色作用但不甚明顯，脫色率分別為13.95％、23.03％和6.95％;對結晶紫(10mg/mL)和堿性藏紅T（200mg/mL）則幾乎無脫色作用。
　　上述研究表明Kurthia huakuii LAM0618的漆酶在畢赤酵母中能得以高效表達，且未經純化的粗酶液的酶活力可達到6877.24U/mL(65℃，pH=