PCR技術(shù)在對典型有害藻類檢測中的應(yīng)用.pdf

1、近二十年來,在我國水域中爆發(fā)有害藻華的次數(shù)呈上升趨勢,其規(guī)模逐年擴大,對人類的生產(chǎn)、生活構(gòu)成極大威脅,構(gòu)建快速檢測方法及預(yù)警機制已是迫在眉睫。本文主要研究了甲藻中不同生態(tài)類群的演化規(guī)律、建立熒光定量PCR和多重PCR方法分別用于對典型有害藻類——利瑪原甲藻和微囊藻的檢測。所得主要結(jié)論如下:
　　1.建立雙重TaqMan探針實時熒光PCR方法用于針對利瑪原甲藻的快速檢測
　　首次建立雙重TaqMan探針實時熒光PCR方法用于針

2、對利瑪原甲藻的快速檢測。實驗中,先對純系培養(yǎng)的利瑪原甲藻的rDNA ITS和聚酮合酶(PKS)基因進(jìn)行擴增。測序后,再根據(jù)所獲取的基因序列分別設(shè)計特異性引物和探針,初步建立雙重TaqMan探針快速檢測方法。結(jié)果顯示,該方法檢測精度較高、重復(fù)性較好,基本滿足實際檢測的需求。這為今后建立對有害藻類的預(yù)警機制提供有力支持。
　　2.綜合利用PCR技術(shù)對微囊藻的檢測
　　針對有害藻類——微囊藻,建立多重PCR和熒光定量PCR檢測方法

3、。選擇微囊藻毒素合成基因mcy、藻藍(lán)蛋白基因PC及ropC1作為目標(biāo)檢測片段,并通過對PCR最佳反應(yīng)條件的探尋、穩(wěn)定性測試、靈敏度測試及背景水樣干擾實驗測試,建立一整套成熟的多重PCR和熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果顯示,常規(guī)多重PCR方法最低可檢測到1.146g/L的微囊藻基因組DNA,全細(xì)胞多重PCR方法檢測范圍在藻液濃度為10~1×106個/mL;在實時熒光定量PCR檢測中,針對 PC、ropC1和mcyDJ序列,最低都可以檢測到1

4、個藻細(xì)胞。
　　綜合利用上述建立的兩種檢測方法,對采集自上海周邊的三大湖泊的水樣進(jìn)行檢測。對結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn),三大湖泊中所檢測出的微囊藻mcy基因主要集中在太湖流域和滴水湖,而在淀山湖中未被發(fā)現(xiàn)。
　　3.從SSUrDNA和線粒體cox1序列的層面初步分析甲藻中不同生態(tài)類群的演化規(guī)律。
　　應(yīng)用SSUrDNA和線粒體cox1序列研究甲藻中不同生態(tài)類群的演化關(guān)系。通過PCR擴增和測序獲取4株甲藻SSUrDNA及其線粒體co

5、x1部分片段,結(jié)合GeneBank中24株甲藻的相關(guān)序列,以Plasmodium falciparum為外群,構(gòu)建ML樹和NJ樹,并采用自展支持度評估進(jìn)化樹分支結(jié)構(gòu),通過計算后驗概率評估進(jìn)化樹整體結(jié)構(gòu),應(yīng)用1sKH、SH、ELW和2sKH等方法評估兩株ML樹間的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,在由上述兩序列構(gòu)建的進(jìn)化樹上,底棲原甲藻均未與浮游原甲藻聚類,且前溝藻具有獨特演化地位。表明聯(lián)合選擇SSU rDNA和線粒體cox1序列構(gòu)建的進(jìn)化樹在一定程度