第四章抗生素效價(jià)的微生物檢定法

1、第四章：抗生素效價(jià)的微生物檢定法,授課人:汪穗福(高級(jí)講師) 蘇惠虹(助理講師) 廣州市醫(yī)藥中專學(xué)校,教學(xué)目標(biāo)： １.解釋抗生素概念、敘述醫(yī)療用抗生素特點(diǎn)、 了解抗生素的主要作用機(jī)制 ２.敘述抗生素的效價(jià)和單位及其表示方法 ３.熟知抗生素效價(jià)檢定操作流程與基本要求 ４.述說測(cè)定原理。,教學(xué)重點(diǎn)： 抗生素概念、醫(yī)療用抗生素特點(diǎn)、抗生素的效價(jià)和單位及其表示方法 抗生素

2、效價(jià)檢定操作方法與基本要求,教學(xué)難點(diǎn)：抗生素效價(jià)檢定操作方法二劑量法效價(jià)計(jì)算公式抗生素的主要作用機(jī)制,第一節(jié) 概述第二節(jié) 抗生素的效價(jià)和單位第三節(jié) 管碟法測(cè)定操作第四節(jié) 二劑量法總結(jié)及作業(yè),第一節(jié) 概述 一、抗生素的主要作用機(jī)制 １、抑制細(xì)胞壁的合成 ２、影響細(xì)胞膜的功能 ３、干擾蛋白質(zhì)的合成 ４、抑制核酸的合成 二、抗生素的概念:抗生素主要是由微生物所產(chǎn)

3、生的極微量便具有選擇性地殺死或抑制它種生物或腫瘤、細(xì)胞生長的一類天然有機(jī)化合物。 三、醫(yī)藥用抗生素的特點(diǎn)： (1)有較大的差異毒力 ：差異毒力越強(qiáng)，越有利于臨床應(yīng)用?！?(2)抗菌活性強(qiáng)：MIC值越小，表示活性越強(qiáng)。 　 (3)抗菌譜廣：廣譜抗生素、窄譜抗生素 (4)不產(chǎn)生副作用和不良反應(yīng),四、抗生素效價(jià)微生物測(cè)定技術(shù) （一）概述 效價(jià)測(cè)定技術(shù)方法： 1、物理、化學(xué)法：簡(jiǎn)便、

4、快速，本身純度不高，采用該法會(huì)引起偏差，因此只有在純度較高情況下可采用 2、微生物法：原理和臨床應(yīng)用的要求相一致，直接反映出抗生素的療效，且靈敏度較高，需用量較小，因此被廣泛使用。,微生物法： 依據(jù)抗生素最小抑菌濃度而設(shè)計(jì)的稀釋法；根據(jù)不同濃度的抗生素對(duì)微生物生長速度的不同影響程度而設(shè)計(jì)的比濁法；有依據(jù)抗生素滲透到含敏感菌的瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生抑菌圈而設(shè)計(jì)的管碟法(又稱擴(kuò)散法，杯碟法或垂直擴(kuò)散法)；根據(jù)對(duì)微生物呼吸抑

5、制程度而設(shè)計(jì)的呼吸度量法；根據(jù)對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的影響而設(shè)計(jì)的快速法，對(duì)微生物體內(nèi)酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響的脫氫法。 濁度法：系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長的抑制作用，通過測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長抑制的程度，以測(cè)定供試品效價(jià)的種方法。 管碟法：是利用抗生素在含敏感試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基中的球面擴(kuò)散滲透作用，從而形成一定的抑菌圈。通過瓊脂培養(yǎng)基，可觀察并測(cè)量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，對(duì)

6、數(shù)劑量(濃度)與抑菌圈的表面積或直徑成正比。,（二）抑菌圈的形成 1、抑菌圈： 將不銹鋼小管(俗稱為牛津杯)放置在含敏感試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基上，將抗生素溶液注入小鋼管中，抗生素分子隨溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀放射狀擴(kuò)散。同時(shí)將培養(yǎng)基置入適宜試驗(yàn)菌生長的培養(yǎng)箱中，瓊脂培養(yǎng)基中的試驗(yàn)菌開始生長?？股胤肿釉诃傊囵B(yǎng)基中的濃度，隨離開小鋼管的距離增大而降低，離小鋼管愈遠(yuǎn)，瓊脂培養(yǎng)基中抗生素分子愈少，相應(yīng)的抗生素濃度愈低。當(dāng)

7、抗生素分子擴(kuò)散到一定時(shí)間，在小鋼管周圍形成一個(gè)能有效的抑制試驗(yàn)菌生長的范圍，也就是通常所說的抑菌圈。,2、影響抑菌圈大小的因素： 抑菌圈的半徑(大小)與最小抑菌濃度C，瓊脂層厚度H，抗生素在瓊脂內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)D，抗生素在小鋼管中的量M，以及抗生素的擴(kuò)散時(shí)間T有關(guān)：這些因素的改變，常會(huì)影響抑菌圈的大小和清晰度。,按設(shè)計(jì)原理不同分:,,管碟法,,一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）,二劑量法（2·2法）,三劑量法（3·3

8、法）,日常使用多采用二劑量法，對(duì)于有爭(zhēng)議結(jié)果，必須使用三劑量法測(cè)定的結(jié)果仲裁。,3、管碟法常用的三種方法：,第二節(jié) 抗生素的效價(jià)和單位,一、抗生素的效價(jià)和單位 抗生素的含量用效價(jià)和單位表示。該詞有時(shí)不加區(qū)別統(tǒng)稱為效價(jià)單位。 效價(jià)（ｐotency）：指檢品的實(shí)際單位數(shù)與其標(biāo)示量的比值。常表示為效價(jià)的百分?jǐn)?shù)。效價(jià)是從比較檢品與標(biāo)準(zhǔn)品的生物活性而得。 單位（unit,u）：是衡量抗

9、生素有效成分的具體尺度。,二、抗生素的效價(jià)單位的表示方法,,１、質(zhì)量單位 以抗生素的生物活性部分質(zhì)量作單位，１微克（ｕｇ）＝１單位，１毫克＝１０００單位。,２、類似質(zhì)量單位 以特定的純粹抗生素鹽類的質(zhì)量作為１單位。如純粹金霉素鹽酸鹽及四環(huán)素鹽酸鹽（包括無生物活性的鹽酸根在內(nèi)）１微克（ｕｇ）＝１單位，１毫克＝１０００個(gè)單位。,３、質(zhì)量折算單位 以特定的純抗生素鹽的質(zhì)量為單位而加以折算。,４、特定單位 以特定的抗生素樣品的某一質(zhì)量

10、定為一單位。,復(fù)習(xí)舊課:,1、抗生素是指主要由_____生成的————————________________________一類________化合物稱之。2、作為醫(yī)療用抗生素應(yīng)具有————、————、————、————特點(diǎn)。3、抗生素效價(jià)的微生物檢定法常用————、————方法進(jìn)行。4、表示抗生素的效價(jià)和單位有————、————、————、————等方法。5、中國藥典規(guī)定的應(yīng)用方法中2．2法中第1個(gè)與第2個(gè)2是分別表示＿＿＿

11、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，而兩個(gè)2則是分別表示＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿意思。,教學(xué)目標(biāo)： 熟知抗生素效價(jià)檢定操作流程與基本要求教學(xué)重點(diǎn)： 抗生素效價(jià)檢定操作方法與基本要求教學(xué)難點(diǎn)： 抗生素效價(jià)檢定操作方法,第三節(jié) 管碟法測(cè)定操作,第三節(jié) 管碟法測(cè)定操作,1. 試驗(yàn)用菌液、緩沖液、培養(yǎng)基的制備 按藥 典規(guī)定進(jìn)行制備。,,2. 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品

12、溶液的制備 按藥典規(guī)定制備標(biāo)準(zhǔn)品與供試品高低不同濃度溶液。,3. 雙碟的制備 制備底層(每個(gè)培養(yǎng)皿20ML)及含一定量試驗(yàn)菌的菌層(每個(gè)培養(yǎng)皿5ML)，并安置小鋼管。,4. 滴加藥液到小鋼管內(nèi) 將標(biāo)準(zhǔn)品、供試品溶液滴入相應(yīng)的小鋼管中。,5. 培養(yǎng) 在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間。（注意更換成瓦蓋）,6. 測(cè)量抑菌圈 可用手工測(cè)量或儀器測(cè)量。,7. 計(jì)算結(jié)果 先進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn),符合規(guī)定,再進(jìn)行效價(jià)計(jì)算,抗生素效價(jià)檢定管碟法操作流程

13、:,二、影響因素的控制 1．直線斜率的控制　　　 2．直線截距的控制　　　 3．抑菌圈大小的控制　　 4．培養(yǎng)基的厚度 5. 劑量反應(yīng)直線范圍控制 　　　 6. 抑菌圈圓整及清晰度的控制,三、抗生素操作要求,（1）防止抗生素污染（2）操作次數(shù)序安排上的誤差 （3）測(cè)量抑菌圈應(yīng)避免誤差,教學(xué)總結(jié)：抗生素效價(jià)檢定管碟法操作流程,抗生素效價(jià)檢定管碟法操作流程:,布置作業(yè)： P92

14、 綜合測(cè)驗(yàn)題 一、填空題 7、8 二、填圖題,第四節(jié) 二劑量法,二劑量法的原理與測(cè)定方法： 　　該法系將抗生素的標(biāo)準(zhǔn)及檢品各稀釋成一定比例(2:1或4:1)的二種劑量，即高劑量和低劑量。在同一培養(yǎng)基平皿上進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)它們所產(chǎn)生的抑菌圈大小計(jì)算檢品的效價(jià)。,一、效價(jià)計(jì)算公式 二劑量法效價(jià)計(jì)算公式經(jīng)推導(dǎo)可得出供試品的效價(jià)計(jì)算公式。 V=T1 +T2 －S1 －S2

15、 　 （4－3） W=T2 －T1 + S2 －S1 （4－4） LgR=(W/V).I （4－5） R=lg－1[(W/V).I] 　 （4－6） pT =AT.R

16、 （4－7） Lgθ=(V/W).I （4－8） θ=lg-1.(V/W).I （4－9）,二、操作方法基本要點(diǎn)： ① 高劑量抗生素溶液所形成的抑菌圈直徑在20～24 mm，個(gè)別抗生素的抑菌圈可在18～24 mm； ② 高、

17、低劑量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差數(shù)可較?。?③ 高、低劑量之比一般用2:1，當(dāng)高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時(shí)，可用高低劑量之比為4:1的比率。,操作步驟： 1. 稱量 2. 稀釋 3. 雙碟的制備 4. 放置鋼管 5. 滴加抗生素溶液　 6. 抑菌圈測(cè)量,圖4－6：鋼管放置器（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)開發(fā)）,教學(xué)總結(jié)：

18、抗生素概念、醫(yī)療用抗生素特點(diǎn)、抗生素的主要作用機(jī)制。 布置作業(yè)： P91-92 綜合測(cè)驗(yàn)題,標(biāo)準(zhǔn)品的稱量,標(biāo)準(zhǔn)品,返回,試驗(yàn)用菌液、緩沖液、培養(yǎng)基、 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的制備,制備過程,返回,抽提,加入乙醚進(jìn)行抽提,共抽提三次(取其下層),返回,雙碟的制備,制備底層,制備菌層,放置小鋼管,返回,滴加藥液到小鋼管內(nèi),返回,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間 （蓋上陶瓷蓋）,返回,