抗生素效價 的微生物檢定法

1、第四章：抗生素效價的微生物檢定法教學(xué)目標：１.解釋抗生素概念、敘述醫(yī)療用抗生素特點、了解抗生素的主要作用機制 ２.敘述抗生素的效價和單位及其表示方法 ３.熟知抗生素效價檢定操作與基本要求 ４.述說測定原理,教學(xué)重點： 抗生素概念、醫(yī)療用抗生素特點、抗生素的效價和單位及其表示方法 抗生素效價檢定操作方法與基本要求,教學(xué)難點：抗生素效價檢定操作方法二劑量法效價計算公式抗生素的主要作用機制,講授新課：第一節(jié) 概述,一、抗生

2、素的概念:抗生素主要是由微生物所產(chǎn)生的極微量便具有選擇性地殺死或抑制它種生物或腫瘤、細胞生長的一類天然有機化合物。二、醫(yī)藥用抗生素的特點具備以下4個特點才能應(yīng)用到臨床。　(1)有較大的差異毒力 　是由抗生素的作用機制決定的,如青霉素類抗生素能抑制細菌細胞壁的合成，而對人與哺乳動物沒有影響,因而該類抗生素具有明顯的差異毒力?！?2)抗菌活性強 抗菌活性的強弱常用最低抑菌濃度(MIC)來衡量，MIC值越小，表示活性越強。　(3)抗

3、菌譜廣 即指各種抗生素所能抑制或殺滅微生物的范圍，范圍廣譜者稱為廣譜抗生素，即對多種病原菌都有抑制和殺滅作用；范圍窄的為窄譜抗生素，如青霉素主要抑制革蘭陽性菌，多粘菌素只能抑制革蘭陰性菌，而具有抗腫癌作用的抗生素則稱為抗腫瘤抗生素?！?4)不產(chǎn)生副作用和不良反應(yīng) 良好的抗生素應(yīng)對機體無毒性，不引起變態(tài)反應(yīng)，不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性。,,三、抗生素效價微生物測定技術(shù),（一）概述,效價測定技術(shù)方法,,物理、化學(xué)法,微生物法,,,簡便、

4、快速，本身純度不高，采用該法會引起偏差，因此只有在純度較高情況下可采用,原理和臨床應(yīng)用的要求相一致，直接反映出抗生素的療效，且靈敏度較高，需用量較小，因此被廣泛使用。,微生物法,,依據(jù)抗生素最小抑菌濃度而設(shè)計的稀釋法；根據(jù)不同濃度的抗生素對微生物生長速度的不同影響程度而設(shè)計的比濁法[《中國藥典》稱之為濁度法并收載]；有依據(jù)抗生素滲透到含敏感菌的瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)生抑菌圈而設(shè)計的管碟法(又稱擴散法，杯碟法或垂直擴散法)；,根據(jù)對微生物呼吸抑制

5、程度而設(shè)計的呼吸度量法；根據(jù)對微生物代謝產(chǎn)物的影響而設(shè)計的快速法，對微生物體內(nèi)酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響的脫氫法。,濁度法系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的種方法?！」艿ǎ菏抢每股卦诤舾性囼灳沫傊囵B(yǎng)基中的球面擴散滲透作用，從而形成一定的抑菌圈。通過瓊脂培養(yǎng)基，可觀察并測量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，對數(shù)劑量(濃度)

6、與抑菌圈的表面積或直徑成正比,（二）抑菌圈的形成,將不銹鋼小管(俗稱為牛津杯)放置在含敏感試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基上，將抗生素溶液注入小鋼管中，抗生素分子隨溶劑向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀放射狀擴散。同時將培養(yǎng)基置入適宜試驗菌生長的培養(yǎng)箱中，瓊脂培養(yǎng)基中的試驗菌開始生長。抗生素分子在瓊脂培養(yǎng)基中的濃度，隨離開小鋼管的距離增大而降低，離小鋼管愈遠，瓊脂培養(yǎng)基中抗生素分子愈少，相應(yīng)的抗生素濃度愈低。當抗生 素分子擴散到一定時間，在 小鋼管周圍形成一

7、個能有效 的抑制試驗菌生長的范圍， 也就是通常所說的抑菌圈。 抗生素溶液的濃度不同，抑 菌圈的大小亦不同(圖4－1)。,按設(shè)計原理不同分,,管碟法,,一劑量法（標準曲線法）,二劑量法（2·2法）,三劑量法（3·3法）,日常使用多采用二劑量法，對于有爭議結(jié)果，必須使用三劑量法測定的結(jié)果仲裁。另外再介紹濁度法；考慮到一劑量法（標準曲線法）在研制新藥的使用和美國藥典、日抗基均有收載，本教材以選講形式進行介紹

8、。,第二節(jié) 抗生素的效價和單位,一、抗生素的效價和單位 抗生素的含量用效價和單位表示。該詞有時不加區(qū)別統(tǒng)稱為效價單位。 效價（ｐotency）－指檢品的實際單位數(shù)與其標示量的比值。常表示為效價的百分數(shù)。效價是從比較檢品與標準品的生物活性而得。在不同的微生物效價測定中，效價計算的公式見后述。 單位（unit,u）單位是衡量抗生素有效成分的具體尺度。各種抗生素的

9、單位含義不同，在習(xí)慣上根據(jù)它們的實際發(fā)展情況而定，抗生素效價單位的具體表示方法見后述。 標準品與國際單位(international unit,iu) 抗生素微生物測定用的標準品，除國內(nèi)的新品種外，凡已制備國際標準品的品種，在制備國家標準品時，均與國際標準品比較而定出效價。,二、抗生素的效價單位的表示方法,,１、質(zhì)量單位 以抗生素的生物活性部分質(zhì)量作單位，１微克（ｕｇ）＝１單位，１

10、毫克＝１０００單位。,２、類似質(zhì)量單位 以特定的純粹抗生素鹽類的質(zhì)量作為１單位。如純粹金霉素鹽酸鹽及四環(huán)素鹽酸鹽（包括無生物活性的鹽酸根在內(nèi)）１微克（ｕｇ）＝１單位，１毫克＝１０００個單位。這是根據(jù)國際使用習(xí)慣而來的。,３、質(zhì)量折算單位 以特定的純抗生素鹽的質(zhì)量為單位而加以折算。,４、特定單位 以特定的抗生素樣品的某一質(zhì)量定為一單位。,第三節(jié) 管碟法測定操作,1. 試驗用菌液(見表4-4)、緩沖液、培養(yǎng)基的制備 按藥典規(guī)

11、定進行制備。,,2. 標準品與供試品溶液的制備 按藥典規(guī)定制備標準品與供試品高低不同濃度溶液。(見表4-3和4-11)。,3. 雙碟的制備 制備底層及含一定量試驗菌的菌層，并安置小鋼管。,4. 滴加藥液到小鋼管內(nèi) 將標準品、供試品溶液滴入相應(yīng)的小鋼管中。,5. 培養(yǎng) 在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至規(guī)定時間。,6. 測量抑菌圈 可用手工測量或儀器測量。,7. 計算結(jié)果 先進行可靠性測驗,符合規(guī)定,再進行效價計算,標準品的稱量 →標準品的稀

12、釋→標準品溶液,供試品的稱量 →供試品的稀釋→供試品溶液,緩沖液的制備,培養(yǎng)基的制備→,,,底層20 ml─→菌層5ml ─→,┌───平板的制備────┐,凝固后 　 凝固后,↓ ↓,菌液的制備,加菌液,,加小鋼管,--─┐,,,─┐,,可靠性測驗，計算結(jié)果 ←──測量抑菌圈←─培 　養(yǎng),,抗生素效價檢定管碟法操作流程,第三節(jié)

13、 管碟法測定操作,加陶瓦園蓋,二、影響因素的控制,1．直線斜率的控制　　　斜率小，即抗生素濃度差異小，而抑菌圈的直徑差異大，靈敏度的準確性高。,2．直線截距的控制　　　直線截距決定于C、D、T、H諸因素，其中D、T值一般相當穩(wěn)定，所以C、H是決定截距的主要因素。如將培養(yǎng)基厚度H減小，截距也隨之減小，抑菌圈增大。據(jù)此可設(shè)計薄層培養(yǎng)基，可大大提高檢驗的靈敏度,3．抑菌圈大小的控制　　抑菌圈的大小受L、H、C、D、T及A等諸因素的影響?？股?/p>

14、總量M＝CV＝CAL，（A為管底面積、L為高度、V為管內(nèi)體積、C為抗生素濃度）,可見抗生素濃度是影響抑菌圈大小的，若C不變，則r²隨V而變化，那么L或A均影響抑菌圈大小。因此抗生素濃度應(yīng)準確，包括稱量、稀釋均應(yīng)準確，稀釋用的儀器、容器均應(yīng)標準。,4．培養(yǎng)基的厚度H、試驗菌敏感度C、擴散系數(shù)D的影響,H增大，r縮??；H減小，r增大。C常受加菌量及對抗生素耐藥性等因素的影響而有所改變，從而影響r大小。T受細菌生長快慢的影響而引起r

15、改變。D擴散快慢亦可使r改變，因此應(yīng)注意選用敏感性的試驗菌并保持其不變異，特別要防止染菌，制備菌層時含菌濃度要適宜，可采用預(yù)試驗來確定；向小鋼管內(nèi)滴加標準溶液和供試溶液時要交叉進行，以免偏向。,5. 劑量反應(yīng)直線范圍控制 　　　直線范圍在下列情況下會縮短：管徑小、裝量?。粷舛鹊?；因培養(yǎng)基或試驗菌吸附或破壞抗生素等因素使小鋼管中抗生素量下降，導(dǎo)致直線范圍縮短，常使呈弧形。為此可用調(diào)整緩沖液的pH值，使抗生素穩(wěn)定；調(diào)整培養(yǎng)基pH值；調(diào)整培養(yǎng)

16、基的處方及除去雜質(zhì)；選用更為敏感的試驗菌加以控制。,6. 抑菌圈圓整及清晰度的控制　　抑菌圈常有破裂不圓，甚至無圈現(xiàn)象。這些情況的產(chǎn)生主要是由于向小鋼管加抗生素溶液時有濺出或漏出；有時也可能因雙碟或小鋼管殘留或污染有抗生素而造成的。如果污染雜菌或因菌層培養(yǎng)基溫度過高，試驗菌被燙死，均會使抑菌圈不圓整或破裂。,(2) 抗生素的培養(yǎng)基內(nèi)抗散系數(shù)不一所引起　　抗生素的培養(yǎng)基內(nèi)抗散系數(shù)不一，如混有幾種類型的抗生素、抗生素受緩沖液或受培養(yǎng)基內(nèi)的雜

17、質(zhì)影響，或使其形成某種化合物，致使抗生素濃度總量發(fā)生變化。因此對培養(yǎng)基的原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及瓊脂等的選用極為重要。這些都可影響仰菌圈的大小和清晰度。,在某些情況下出現(xiàn)抑菌圈邊緣模糊、類似鋸齒狀或雙圈等現(xiàn)象，主要由下列因素所引起：(1) 試驗菌培養(yǎng)物不純所引起　當試驗菌培養(yǎng)物不純，幾種菌株，如菌種中雜有耐藥性菌，使C含有C，、C，，、C，，，等差異含有一同敏感度的，致使擴散系數(shù)紊亂。其次菌種中有不同生產(chǎn)時間的菌體，以致有不同的Ｔ

18、值，這些都能使抑菌圈邊緣不清晰。,(3) 小鋼管內(nèi)的抗生素濃度不斷下降所引起　　當試驗菌能吸附或破壞抗生素時，這種情況就更加嚴重，此時可出現(xiàn)雙圈現(xiàn)象。,,(4) 不適當?shù)匮娱L培養(yǎng)時間所引起　　由于某些抗生素的抑菌圈邊緣的菌群只是被抑制，當延長培養(yǎng)時限后，菌量增加，使抗生素敏感度降低。抑菌圈邊緣菌群繼續(xù)繁殖，導(dǎo)致抑菌圈變小或邊緣模糊不清不整齊，如測定制霉菌素時，培養(yǎng)時間長，其抑菌圈邊緣就不清晰或不整齊。要控制培養(yǎng)時限，使抗生素培養(yǎng)基的濃度

19、，恰當抑制實驗菌，而在抑菌圈邊緣的濃度能刺激試驗菌生長，就能形成清晰的抑菌圈。,此外，對抗生素標準品和供試品同質(zhì)的要求至為重要。 因為效價測定設(shè)計是假定二者劑量反應(yīng)直線是相互平行除操作影響外，無論是標準品中或供試品中若有其他抗菌性物質(zhì)或影響抗菌活性的物質(zhì)（加強或拮抗），均可使二者劑量反應(yīng)直線不平行，對此必須注意。如供試品四環(huán)素制劑中含有維生素C時，在標準品中也應(yīng)加入相應(yīng)的維生素C，以保持標準品供試品的同質(zhì)性，這樣檢驗結(jié)果才是

20、可行的，也才能準確。,三、操作技術(shù)要求,（1）防止抗生素污染 由于管碟法是微量的微生物分析法，故稱量稀釋除應(yīng)滿足用容量分析及儀器分析進行定量分析的一般要求外，還應(yīng)注意效價測定試驗室內(nèi)防止抗生素污染。效價測定滴加鋼管的操作室內(nèi)，地面，水平操作臺，鋼管放置器，鋼管，墻壁以及各項玻璃用具，工作服，工作人員雙手等，都要避免被抗生素污染。即使有微量抗生素的污染，往往使試驗結(jié)果混亂。微量的抗生素還可以附著在塵埃上，隨著空氣流動散落在雙碟培養(yǎng)基平板

21、，鋼管，鋼管放置器上，有時可能是使抑菌圈破裂的原因。因此，要避免將抗生素溶液滴在地上或工作臺上，如被污染時應(yīng)及時清潔。在配制培養(yǎng)基或緩沖液時，亦應(yīng)嚴防被抗生素污染。（2）操作次數(shù)序安排上的誤差　　在一劑量法制備標準曲線時，雙碟數(shù)量較多，滴加抗生素溶液至鋼管的時間，各個雙碟的時間基本一致。如滴加8組稀釋度雙碟，可從中心濃度組開始向高，低二端交叉滴加。如稀釋度為C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7 及 C8 ，滴加次序可C4，C5，C

22、3，C6，C2，C7，C1 及 C8 。這樣 ，可減少各組間抗生素擴散時間及試驗菌生長時間的差異。尤以枯草桿菌在室溫較高時，這種影響更為明顯。此外，標準品與供試品的稱量，應(yīng)在相近的時間內(nèi)稱取，稀釋后的溶液盡量在相同的條件下放置，并使放置的時間也相同，以減少誤差。,滴加雙碟小鋼管的次序所致的誤差，受操作者的熟練程度的影響，而且在方法設(shè)計上也是無法抵消的。因此，要求滴加迅速，如一組三個雙碟18個小鋼管的滴加時間，控制在1min以內(nèi)較好。在操

23、作很多檢品時，以分批操作為好，切勿同時放置幾排雙碟先滴好標準品溶液后滴加各批供試品溶液，這樣使標準品與供試品溶液的擴散時間和細菌生長時間人為帶來差異，引起誤差?！。?）測量抑菌圈應(yīng)避免誤差　　測量抑菌圈是本法取得試驗結(jié)果的重要環(huán)節(jié)，目前多已采用抑菌圈面積測量儀測量以克服使用游標卡尺容易產(chǎn)生的主觀誤差?，F(xiàn)國產(chǎn)抑菌圈面積測量儀主要有ZY-300IV型智能抑菌圈測量儀（由北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)經(jīng)銷，圖4-4）和CHB－1型抗生素效價測

24、量儀（北京海淀潮聲技術(shù)開發(fā)公司開發(fā)，圖4-5）。且經(jīng)微機處理，能自動打印出效價及生物統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。,抑菌圈測量儀,,,教學(xué)重點：操作方法,結(jié)果判斷,教學(xué)難點：復(fù)習(xí)舊課：,講授新課　　第四節(jié) 二劑量法,一、效價計算公式二劑量法效價計算公式經(jīng)推導(dǎo)可得出供試品的效價計算公式。V=T1 +T2 －S1 －S2 （4－3）W=T2 －T1 + S2 －S1

25、 （4－4）LgR=(W/V).I （4－5）R=lg－1[(W/V).I] 　 （4－6）pT =AT.R （4－7）Lgθ=(V/W).I （4－8）θ=lg-1.(V/W).I （4－9）,二、操作方法基本要點：

26、 ① 高劑量抗生素溶液所形成的抑菌圈直徑在20～24 mm，個別抗生素的抑菌圈可在18～24 mm； ② 高、低劑量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差數(shù)可較??； ③ 高、低劑量之比一般用2:1，當高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時，可用高低劑量之比為4:1的比率。,(一) 儀器與用具 1. 操作室　 2. 雙碟 3. 陶瓦蓋　　 4. 鋼管 5. 鋼管放置器（圖4－6） 6.

27、恒溫培養(yǎng)箱 7. 滅菌刻度吸管 8. 玻璃容器 9. 稱量瓶,,圖4－6：鋼管放置器（北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)開發(fā)）,10.毛細滴管　用玻璃拉制，管口光滑。11.天平 分析天平，感量0.1mg。12.抑菌圈直徑（面積）測量儀（圖4-4）（圖4-5）。13.超凈工作臺　用于菌種的接種或傳代。超凈工作臺須置潔凈工作室或半無菌室內(nèi)。,(二) 試液1. 滅菌緩沖液　劑應(yīng)為分析純，配制后應(yīng)澄明，分裝于玻璃容

28、器內(nèi)，經(jīng)115℃蒸汽滅菌30min備用。2. 磷酸鹽緩沖液（pH6.0）　3. 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）　4. 磷酸鹽緩沖液 （pH7.8） 5. 磷酸鹽緩沖液 （pH10.5 ),(三) 培養(yǎng)基　　培養(yǎng)基中原料的質(zhì)量對抑菌圈邊緣清晰度及試驗結(jié)果的精確度影響較大，因此應(yīng)對原材料進行預(yù)試驗，挑選適當?shù)呐铺柺褂?。制成的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如產(chǎn)生沉淀，可在配制培養(yǎng)基后，置115℃，20 min溶化，趁熱用紙漿減壓或適宜方法過濾，調(diào)整p

29、H值，分裝滅菌備用?！?根據(jù)《中國藥典》(2005年版)抗生素生物測定法中收載的不同處方培養(yǎng)基。按品種要求選用，具體配方可見教材后附錄培養(yǎng)基。目前市場已有干燥培養(yǎng)基商品生產(chǎn)、供應(yīng)。臨用時按照使用說明書進行配制，但注意培養(yǎng)基的pH，應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后，滅菌備用。,（四）試驗用菌種　檢定用標準菌種，由中國藥品生物制品檢定所提供為冷凍干燥菌種。,1. 菌種的復(fù)蘇 砂輪刻痕，外壁碘酒消毒、75%酒精棉擦凈，火焰燒灼，滅菌滴管

30、吸肉湯滴在灼熱管痕處使聚冷而炸裂。管口打開，另取滅菌滴管吸肉湯少許，將凍干菌塊溶解，吸出菌液接種至普通肉湯內(nèi)，或瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24 h,觀察菌苔形態(tài)、涂片，革蘭染色鏡檢，呈典型菌形即可應(yīng)用。,2. 菌種的接種與保存 按無菌接種要求將細菌劃在斜面的表面上，將已接種的細菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24 h，真菌管一般置24~25℃真菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。取出后放入冰箱保存，一般3~4周轉(zhuǎn)種一次.,3. 菌懸液的制備

31、 依不同的菌來制備,（五）操作方法,1. 稱量 稱量前，將標準品從冰箱取出，使與溫室平衡；供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少30min方可稱取。供試品與標準品應(yīng)用同一天平；吸濕性較強的抗生素，在稱量前1～2ｈ更換天平內(nèi)干燥劑。標準品與供試品的稱量最好一次取樣稱取，不得將已取出的標準品或供試品倒回原容器內(nèi)，標準品稱量不可少于20mg，取樣后立即將稱量瓶及被稱物蓋好，以免吸水。稱樣量的計算：W=V·C／P　式中W為需稱取標準品或供試

32、品的重量（mg）；V為溶解標準品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積量（ml）；C為標準品或供試品濃溶液的濃度（U/ml或μg/ml）；P 為標準品的純度或供試品的估計效價(U/ml或μg/mg)。,2. 稀釋 稀釋操作應(yīng)遵照容量分析的操作規(guī)程?！谋渲腥〕龅臉藴嗜芤?，必須先在室溫放置，使其溫度達到室溫后，方可量取。標準品與供試品溶液的稀釋應(yīng)采用容量瓶，每步稀釋，取樣量不得少于2ml為宜，稀釋步驟一般不超過3步。舉例：取濃溶液10

33、00u/ml。第一步取5ml（1000U/ml）→50ml容量瓶→100U/ml；第二步取5ml（100u/ml）→50ml容量瓶→10U/ml（H）；取5ml（100U/ml）→100ml容量瓶→5U/ml（L）?！∶看挝∪芤河每潭任?，量取溶液前要用被量液流洗吸管2～3次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開始放溶液。稀釋標準品與供試品用的緩沖液應(yīng)同一批和同瓶，以免因pH或濃度不同影響測定結(jié)果。稀釋時，每次加液

34、至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準確補加至刻度。有關(guān)標準品和供試品溶液的稀釋可見表4－3。,3． 雙碟的制備 在半無菌室內(nèi)進行，應(yīng)注意微生物及抗生素的污染，培養(yǎng)基應(yīng)在水浴中或微波爐中融化，避免直火加熱。　　底層：用滅菌大口吸管（20ml）或其他滅菌分裝器，吸取已融化的培養(yǎng)基20ml注入雙碟內(nèi)，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋，放于35～37℃培養(yǎng)箱中保溫，使易于攤布菌層?！　【鷮?取出試驗用菌懸液，按已試驗妥的菌量

35、[按(2.2)法標準品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～24mm；(3.3)法標準品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18 mm的初試菌量]，用滅菌吸管吸取菌懸液加入已融化并保溫在水中(一般細菌48～50℃，芽孢可至60℃)的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻作為菌層用。用滅菌大口10ml吸管或其他分裝器，吸取菌層培養(yǎng)基5ml，使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，置水平臺上并用陶瓦圓蓋覆蓋，放置20 ～ 30min，待凝固，備用。,4．放置鋼管 用鋼管放置

36、器，將干熱滅菌的鑷子或適宜方法將鋼管裝于玻璃管中，放于鋼管放置器上，將雙碟打開，放入雙碟臺上，托起雙碟臺，使鋼管平穩(wěn)落在培養(yǎng)基上，注意使各個鋼管下落的高度基本一致，鋼管放妥后，雙碟靜置5～10 min,使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下穩(wěn)定后，再開始加抗生素溶液?！?．滴加抗生素溶液　　每批供試品取4~10個雙碟，滴加溶液用毛細滴管或定量加樣器，在滴加之前須用滴加液洗2~3次。滴加標準品及供試品溶液，因?qū)嶒炘O(shè)計方法不同而異。(2.2)法,在雙碟的4個

37、鋼管中分別成對角滴加標準品(S)及供試品(T)高(H)、低(L)兩種濃度的溶液。(3.3)法的6個鋼管中間隔3個鋼管中分別滴加標準品及供試品高、中(M)、低3種濃度溶液,并使相同濃度成對角。滴加溶液的順序:(2.2)法SH→TH→SL→TL；(3.3)法SH→TH→SM→TM→SL→TL。滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液間隔不可過長，因溶液的擴散時間不同影響測定結(jié)果。,每份滴加的溶液為1單位，但雙碟數(shù)每次不超過5個，如1份溶液滴加雙碟

38、數(shù)目多，可分次滴加。每種溶液各用1支毛細滴管。滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤內(nèi)，雙碟疊放不可超過3個，避免受熱不均，影響抑菌圈大小，以水平位置平穩(wěn)移入培養(yǎng)箱中間位置，35～37℃或30～32℃(依試驗菌的要求選用)，培養(yǎng)至所需時間?！　?．抑菌圈測量　　將培養(yǎng)妥的雙碟取出，打開陶瓦蓋，將鋼管倒入盛有1：1000苯扎溴銨溶液或其他消毒液內(nèi)，換以玻璃蓋，按樣品號排妥；測量抑菌圈前應(yīng)檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或圈不圓整應(yīng)將該

39、碟棄之，切忌主觀挑選抑菌圈及雙碟，使結(jié)果造成偏倚。測量可用ZY-300型抑菌圈面積自動測量分析系統(tǒng)（圖4－4）等測定儀進行，也可用游標卡尺；使用游標卡尺測量時，眼睛視線應(yīng)與讀數(shù)刻度垂直，用游標卡尺的尖端與抑菌圈直徑的切點成垂直方向測量。,（六）記錄與計算　1. 試驗記錄 應(yīng)包括抗生素的品種、劑型、標示量、生產(chǎn)廠、批號、檢查目的、檢驗依據(jù)、檢驗日期、溫度、濕度，標準品與供試品的稱量、稀釋步驟與核對人，抑菌圈測量結(jié)果。當用游標卡尺測

40、量抑菌圈直徑時，應(yīng)將測試數(shù)據(jù)以框圖方式順雙碟數(shù)記錄。當用測量儀測量面積或直徑時，應(yīng)將電腦測試、計算、統(tǒng)計分析的打印紙貼附于記錄中。　2. 計算 見本章第四節(jié)。,（七）結(jié)果判斷　1.　可靠性測驗　當用卡尺測量后的結(jié)果，將參數(shù)輸入電腦，用專用（2.2）法和（3.3）法的軟件程序（本書附有統(tǒng)計軟件光盤）進行統(tǒng)計學(xué)處理。如用測量儀測量抑菌圈時，測量與統(tǒng)計學(xué)處理一次完成，統(tǒng)計學(xué)分析按《中國藥典》生物測定統(tǒng)計規(guī)定進行可靠性測量。（2.2）法

41、要求直線回歸、劑間P0.05；（3.3）法除（2.2）的規(guī)定外，尚考查二次曲線和反二次曲線P>0.05，試驗結(jié)果認為可靠，方可進行效價和可信限率計算?！?.可信限率　考核實驗的精密度，除藥典各論另有規(guī)定外，本法的可信限率不得超過5%。上述各項規(guī)定都能符合者，試驗結(jié)果成立?！?. 實驗計算　所得效價低于估計效價的90%或高于估計效價的110%，則檢驗結(jié)果僅作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計效價，予以重試?！?. 效價測定　一般需雙份樣

42、品，平行實驗以便核對。對不符合規(guī)定的樣品應(yīng)至少有2次符合規(guī)定的結(jié)果，才能發(fā)出報告。,第五節(jié)　二劑量法的誤差分析,通過對試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析和可信限及可信限率的計算，來判斷試驗結(jié)果是否可靠或是否需要復(fù)試。《中國藥典》規(guī)定對抗生素的效價測定結(jié)果，都要進行有關(guān)的誤差分析。下面以某批紅霉素的效價測定為例，進行效價計算、誤差分析、可信限率計算。,第六節(jié) 供試品測定操作一、原料藥品　　是指大包裝或半成品干燥粉末或結(jié)晶性粉末，不含輔料，一般測定純

43、度（U/mg），根據(jù)抗生素品種及廠方提供的效價進行估計單位，稱取樣品，估計效價盡量接近真實效價，如估計效價與真實效價距離較遠時，可先作初測試驗，按初測結(jié)果來估計效價，再作精密測定。原料藥品一般皆以干燥品計算效價，先測其含水的供試品效價，再根據(jù)供試品的水分或干燥失重的結(jié)果折算成干燥品的效價?！　「稍锲沸r（U/mg）=含水效價（U/mg）/（1-供試品水分含量%）,二、制劑的測定1. 粉針劑　　指注射用滅菌粉末，用小瓶橡皮塞鋁蓋分裝或

44、熔封在安瓶內(nèi)，均須測定整瓶效價及純度（U/mg）。取裝量差異項下的內(nèi)容物，稱出適量（50mg以上）至稱量瓶內(nèi)，按估計效價進行溶解、稀釋，測出每1mg的單位數(shù)，再根據(jù)裝量差異項下的每瓶平均重量計算出整瓶的效價。2. 水針劑　　水針劑系抗生素?zé)o菌水溶液，標示量以每毫升含效價單位數(shù)計，效價測定時啟開安瓶或小瓶蓋后，用干燥的標準吸管吸取一定量供試品，將吸管外壁用濾紙擦凈，再棄去過多的供試品，沿著容量瓶口內(nèi)壁緩緩放入已盛有一定溶劑的容量瓶內(nèi)，以

45、免抗生素結(jié)晶析出，振搖，繼續(xù)加溶液至刻度，搖勻，再稀釋至規(guī)定的濃度。,3. 片劑　分為素片、糖衣片和腸衣片。素片 稱取20片的總量，求出平均片重，研細混合均勻后，精密稱出適量（約相當1片的重量）至稱量瓶中，然后根據(jù)每片的標示量，用規(guī)定的溶劑溶解，稀釋至容量瓶中。注意之點：研磨時要注意環(huán)境干燥，可在干燥操作柜內(nèi)操作，研磨要迅速，避免吸水，因片劑內(nèi)含賦形劑較多，如稀釋時賦形劑浮于溶液表面，量取體積時應(yīng)讀取賦形劑層下的溶液度，如沉淀較多，應(yīng)

46、待其下沉后量取其懸浮液，有些片劑輔料吸附抗生素，需加注意?！　楣?jié)約供試品，可與片劑的重量差異檢查結(jié)合進行。糖衣片、腸衣片 取規(guī)定的供試品數(shù)片，放于玻璃乳缽中，研細并根據(jù)標示量及規(guī)定的溶劑邊研磨邊溶解，移置于放有小漏斗的容量瓶中，稀釋至刻度、搖勻、靜置，使賦形劑下沉而抗生素已溶解在溶液內(nèi)，精密吸取容量瓶中的懸浮液適量，作進一步稀釋。,4. 膠囊劑　取裝量差異試驗后的內(nèi)容物，混合均勻，精密稱出約相當平均1個膠囊的量，注意研細，按規(guī)定的

47、溶劑溶解并移置至所需的容量瓶內(nèi)，稀釋至刻度，搖勻，如供試品中含較多的輔料，照糖衣片項下方法進行?！?. 軟膏劑或眼膏劑　將軟膏劑或眼膏劑軟管的封口切開，擦凈管的外壁，置于干燥器內(nèi)約1 h，取干燥的分液漏斗，將膏劑軟管在天平上稱重，帶手套取出軟管將膏劑擠入潔凈的分液漏斗內(nèi)，約2g，再稱其膏劑軟管的重量，前后稱量之差即為分液漏斗內(nèi)膏劑供試品的重量，溶解膏劑的溶劑可用不含過氧化物的乙醚或石油醚，并且所提取的抗生素應(yīng)不溶于或微溶于該有機溶劑中

48、，以避免提取過程中抗生素的損失。按規(guī)定量加提取溶劑至分液漏斗中，振搖，使基質(zhì)溶解后，用規(guī)定的緩沖溶液使抗生素被提到水相溶液中，用緩沖溶液提取3次，合并3次提取液，置所需的容量瓶內(nèi)，加緩沖溶液至刻度，搖勻，再稀釋至規(guī)定的濃度。,標準品的稱量,標準品,返回,試驗用菌液、緩沖液、培養(yǎng)基、 標準品與供試品溶液的制備,制備過程,返回,抽提,加入乙醚進行抽提,共抽提三次(取其下層),返回,雙碟的制備,制備底層,制備菌層,放置小鋼管,返回,滴加藥