第二章dna重組-生物探索-探索生物科技價(jià)值的新

1、第二章 DNA重組,,2.1 DNA的組成和結(jié)構(gòu)（略）,,2.2 天然DNA的制備,2.2.1 天然DNA的來源和用途,,2.2.2 天然DNA的提取,準(zhǔn)備生物材料,裂解細(xì)胞,分離和抽提DNA,1、準(zhǔn)備生物材料選擇生物種類；選擇DNA易提取和含量高的組織；選擇DNA得率最高的生長期。如:大腸桿菌質(zhì)粒DNA：應(yīng)在對數(shù)生長期后期。植物DNA：選幼嫩植株或黃化幼苗。肝臟DNA：要清除膽囊。2、裂解細(xì)胞這步是關(guān)系到能否提取

2、到DNA以及DNA得率高低和質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。原核細(xì)胞：用溶菌酶， NaOH和SDS ，煮沸，冰凍，超聲波等方法；結(jié)構(gòu)復(fù)雜的動、植物材料：先必須粉碎（液氮凍結(jié)后研磨，或搗碎機(jī)、研缽直接粉碎），再參照裂解原核的方法。,3 、分離和抽提DNA提取總DNA：在裂解液中加適量酚／氯仿／異戊醇或氯仿／異戊醇等有機(jī)溶液，使DNA與蛋白質(zhì)分開，用乙醇或異丙醇沉淀DNA，再離心。 提取葉綠體或線粒體等細(xì)胞器DNA以及病毒和噬菌體的DNA：須先從裂

3、解液中分離完整細(xì)胞器、病毒和噬菌體，抽提前必須經(jīng)DNase處理，水解附著于其表面的其它DNA。提取質(zhì)粒DNA：調(diào)節(jié)裂解液pH12.6，所有DNA都變性沉淀，再調(diào)節(jié)PH至中性，質(zhì)粒DNA復(fù)性后從沉淀物中釋出。 除RNA：用RNase水解除RNA，分離抽提DNA最有效的方法：氯化銫梯度離心（氯化銫溶液中加適量溴化乙錠，紫外燈下DNA帶和RNA帶都發(fā)熒光，但沉降系數(shù)明顯不同而聚集于不同的氯化銫密度區(qū)）,2.2.2.1 大腸桿菌源質(zhì)粒

4、DNA的提取堿裂解法*：原理：細(xì)菌懸浮液暴露在高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會使細(xì)胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，相互纏繞成大型復(fù)合物，被SDS包蓋，當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)，復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心去除后，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。,,實(shí)驗(yàn)步驟挑取一些獨(dú)立的轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)，用無菌牙簽或挑種環(huán)挑取單菌落于20ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。將1.2ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中

5、，于4℃以5000g離心5min（兩次）。吸取并棄去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。將細(xì)菌沉淀重懸于100μl 溶液Ⅰ中，劇烈振蕩。加200μl 溶液Ⅱ，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。確保離心管的整個(gè)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩！將離心管放置與冰上5min。,加150μl溶液Ⅲ，蓋緊管口，將管倒置，溫和振蕩20s，使溶液 Ⅲ在黏稠的細(xì)菌裂解液中分散均勻，之后將管置于冰上5min。4℃離心12000g，5min，上清轉(zhuǎn)

6、移至另一離心管中。加等體積酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），振蕩混勻。4℃離心12000g，5min，上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。用2倍體積無水乙醇于室溫沉淀質(zhì)粒DNA，振蕩混勻，于室溫放置2min。4℃離心12000g，5min。小心吸去上清夜，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。用1ml70％乙醇溶液洗滌沉淀，4℃離心12000，5min，棄去上清，在空氣中使核酸沉淀干燥。用50μl含無DN

7、A酶的胰RNA酶（20μlg/ml）的TE重新溶解核酸，振蕩，貯存于-20℃。,試劑： （1）溶液Ⅰ：50mmol/l 葡萄糖 25mmol/l Tris-HCl（pH8.0） 10mmol/l EDTA-Na2 （pH8.0）

8、 5mg/ml 溶菌酶（臨用時(shí)加） （2）溶液Ⅱ（新鮮配制）： 200mmol/l NaOH 1% （W/V） SDS （3）溶液Ⅲ（100ml）：

9、 5mol/lKAc 60ml 冰乙酸 11.5ml （pH4.8） ddH2O 28.5ml,2.2.2.2 λ噬菌體DNA的提取溶源周期 溶菌周期提取λDNA的原理：先將溶源菌培養(yǎng)至一定密度，通過熱誘導(dǎo)，使λDNA從宿主染色體D

10、NA上釋放出來，再經(jīng)過溶菌周期培養(yǎng)，獲得大量λ噬菌體，從中提取線形的λDNA。提取過程：溶源菌誘導(dǎo)培養(yǎng)分離λ噬菌體λDNA的提取,,2.2.2.3 氯化銫法制備植物基因組DNA材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解DNA分離抽取,2.2.3 DNA的純化2.2.3.1 氯化銫－溴化乙錠連續(xù)梯度離心法2.2.3.2 離子交換層析法用三烴甲基氯化銨層析樹脂純化DNA用羥基磷灰石純化DNA2.2.3.3 瓊脂糖凝膠電泳洗脫法2

11、.2.3.4 “基因純”試劑純化2.2.3.5 從DNA樣品中去掉EB正丁醇（或異戊醇）抽提法Dowex樹脂層析法,2.2.4 DNA的濃縮乙醇沉淀法含一價(jià)陽離子的DNA溶液＋2體積無水乙醇→沉淀DNA→離心→溶于適量TE緩沖液或無菌水。條件：-20℃，30 min以上；小于1kb或量較少時(shí)，于 - 70℃沉淀，或延長時(shí)間。正丁醇抽提法DNA溶液＋ 1體積正丁醇→混勻→離心（1600 r/min 1min）→棄上

12、清→重復(fù)至所需體積→用水飽和乙醚抽提DNA溶液兩次（除正丁醇）→空氣中蒸發(fā)乙醚。聚乙二醇濃縮法DNA溶液→透析袋→置高濃聚乙二醇溶液→ 4℃濃縮至所需體積。,2.3 限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化,2.3.1 限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）定義是一類能識別雙鏈DNA中特殊的核苷酸序列，并使每條鏈的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的內(nèi)脫氧核糖核酸酶。類型Ⅰ型限制酶Ⅱ型限制酶Ⅲ型限制酶,（1）Ⅰ型

13、限制酶（無用）分子量：30萬dal左右組成：3種亞基特異性亞基：具特異性識別DNA序列的特性。修飾亞基：具甲基化酶活性。限制亞基：具核酸內(nèi)切酶活性。輔助因子：需Mg2+、ATP和SAM。識別和切割位點(diǎn)：不一致（距識別位點(diǎn)5’一側(cè)數(shù)千堿基處隨機(jī)切割DNA分子）。,（2）Ⅱ型限制酶（十分有用）分子量：2萬～10萬dal（較?。┙M成：一種多肽，常以同源二聚體形式存在。輔助因子：無需輔助因子，或只需Mg2+。識別和切割位點(diǎn)

14、：相一致。（3）Ⅲ型限制酶（無用）組成：兩個(gè)亞基M亞基：負(fù)責(zé)位點(diǎn)的識別與修飾。R亞基：具核酸酶的活性。輔助因子：需Mg2+、ATP和SAM識別和切割位點(diǎn)：不一致（距識別位點(diǎn)一側(cè)約25bp處切割DNA分子）。,限制酶的命名,Ⅱ型限制酶的特性 1、不同限制酶能專一地識別不同的特異核苷酸序列；,,＝6個(gè)（大多數(shù)）：如EcoRⅠ 5’-GAATTC-3’,識別序列,<6個(gè)：如AsuⅠ 5’-GGNCC-3’（5個(gè)）

15、 MboⅠ 5’-GATC-3’ （4個(gè)）,>6個(gè)：如NotⅠ 5’-GCGGCCGC-3’（8個(gè)）,有的限制酶識別序列包含在另一種限制酶內(nèi)。 如：Sau3A識別 ： GATC BamHⅠ識別 ： GGATCC,有的限制酶識別多種核苷酸序列。 如：HindⅡ識別 4種核苷酸序列： 5’-CTPyPuAC-3’

16、 （Py→嘧啶堿基C或T；Pu →嘌呤堿基A或G ）,2、各種限制酶的識別序列一般都具有回文結(jié)構(gòu)；,Ⅱ類限制酶識別序列特點(diǎn)—— 回文結(jié)構(gòu)(palindrome),GGATCCCCTAGG,,,,,,5’,3’,5’,3’,限制酶：BamH Ⅰ,正讀與反讀都相同。以識別序列的中線為對稱軸，左右兩側(cè)的堿基互補(bǔ)。為便于書寫，識別序列可以以5’ →3’走向的單鏈DNA表示。,3、各種限制酶的切割類型是各式各

17、樣的，切割后形成各種粘性末端或平整末端； （1）粘性末端和平整末端,(a)5’－P單鏈延伸的粘性末端,(b)3’－OH單鏈延伸的粘性末端,①粘性末端（粘端）,,－G AATTC－－CTTAA G－,,GAATTC,CTTAAG,,,,,,,,,,,,,,,如：Eco RⅠ,5’,3’,5’,3’,5’,3’,5’,3’,,－CTGCA G－－G ACGTC－,5’,3’,5’

18、,3’,5’,3’,5’,3’,②平頭末端（平端）,,－CCC GGG－－GGG CCC－,5’,3’,5’,3’,5’,3’,5’,3’,（2）兩種特殊的限制酶：同尾酶和同裂酶,同尾酶（isocaudamer） 有些限制性內(nèi)切酶雖然來源各異，識別的靶子序列也各不相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，這一類限制酶特稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端。,,,,,Bam

19、HⅠ,BglⅡ,,+,+,,同裂酶（isoschizomer） 有一些來源不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶子序列，這類酶特稱為同裂酶。同裂酶的切點(diǎn)位置可相同或不同。,,,,+,Bam HⅠ,,,,+,BstⅠ,（a）切點(diǎn)位置相同,（b）切點(diǎn)位置不相同,4、某些限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，可能導(dǎo)致酶的識別序列特異性發(fā)生改變。限制酶的第二活性：在甘油濃度、離子強(qiáng)度、pH值、有機(jī)溶劑、二價(jià)陽離子、酶與DNA的比例等參數(shù)單獨(dú)或同時(shí)發(fā)

20、生改變時(shí)，會導(dǎo)致限制酶的識別序列特異性發(fā)生改變，在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割，稱為限制酶的第二活性，又稱星活性。能產(chǎn)生第二活性的酶常在酶名稱的右上角加一星號“☆”，如EcoR Ⅰ★。,2.3.5 限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)包括：酶、底物、反應(yīng)緩沖液、合適的反應(yīng)溫度等。2.3.5.1 底物DNA 限制酶的催化效率與DNA樣品純度、DNA分子構(gòu)型、識別序列兩側(cè)序列長短以及序列堿基甲基化等密切相關(guān)。DNA純度

21、；DNA分子構(gòu)型；識別序列側(cè)面的序列；位點(diǎn)偏愛；DNA甲基化。,,2.3.5.2 限制性核酸內(nèi)切酶用量主要取決于酶本身的催化活性和底物DNA樣品1酶活性單位（U）：某種限制性核酸內(nèi)切酶在最適反應(yīng)條件下，60 min內(nèi)完全切割 1μg λDNA所需的酶活性。酶活性高的用量少，反之則多。能被高效切割的DNA樣品用酶量少，反之則多。等量的兩種DNA樣品，限制酶識別序列密度大的用酶量多，反之則少。,2.3.5.3 限制性

22、核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液包含：氯化鎂或醋酸鎂、氯化鈉或醋酸鉀、二硫蘇糖醇(DTT)或β-巰基乙醇(2-Me)、Tris-HCI或Tris-Ac。,2.3.5.4 限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)溫度大多數(shù)的最適反應(yīng)溫度是37℃，而少數(shù)酶的最適反應(yīng)溫度高于或低于37℃。,,2.3.6 限制性核酸內(nèi)切酶的Star活性（見前）幾乎所有的限制酶都具有Star活性。Star活性的影響：導(dǎo)致切割中出現(xiàn)非特異性DNA片段，甚至不能獲得預(yù)計(jì)的DNA片段，影

23、響進(jìn)一步的DNA連接重組。排除方法：如降低反應(yīng)系統(tǒng)中甘油含量，控制pH中性和高鹽濃度下進(jìn)行反應(yīng)。,,2.3.7 DNA分子片段化天然DNA或化學(xué)合成的DNA常需酶切成可連接重組的DNA片段，即DNA分子的片段化。常用的切割方法有單酶切、雙酶切和部分酶切等方法。單酶切法：用一種限制性內(nèi)切酶切割DNA樣品。最常用。雙酶切法：用兩種不同的限制酶切割同一種DNA分子。部分酶切：指選用的限制性核酸內(nèi)切酶對其在DNA分子上的全部識別序

24、列進(jìn)行不完全的切割。,,2.3.8 DNA分子的限制性圖譜,2.4 特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）即PCR技術(shù)，由美國科學(xué)家Mullis于1983年發(fā)明，又稱基因的體外擴(kuò)增法。也有人稱無細(xì)胞分子克隆法。PCR技術(shù)的用途目的基因的擴(kuò)增與分離；醫(yī)療診斷；基因突變與檢測；分子進(jìn)化研究；環(huán)境檢測；法醫(yī)鑒定。,§1 PCR的基本原理,一、基本原理,

25、Tm=4(G+C)+2(A+T),90～95℃30’’～1’,37～60℃30’’～1’,70～75℃30’’～2’,,,二、“長產(chǎn)物片段”和“短產(chǎn)物片段”“短產(chǎn)物片段”是嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5’端之間的，正是需要擴(kuò)增的特定片段；“長產(chǎn)物片段”則帶有不需要的“尾巴”?！岸坍a(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加的；而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)。,三、平臺效應(yīng)在PCR反應(yīng)中，當(dāng)引物－模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，

26、DNA聚合酶催化的反應(yīng)趨于飽和，會出現(xiàn)“平臺效應(yīng)”，即PCR反應(yīng)產(chǎn)物不再增加。平臺效應(yīng)出現(xiàn)的遲早主要取決于起始模板的拷貝數(shù)、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的濃度等多種因素。,§2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化,一、標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)流程（一）反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系為50～100μl ，其中包含：1×PCR反應(yīng)緩沖液4種dNTP：各200μM兩種引物：各0.25μMDNA模板：0.1μgTaq DNA

27、聚合酶：2U（二）反應(yīng)步驟,,二、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化特異性、有效性和忠實(shí)性是檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增效率的三個(gè)指標(biāo)。PCR反應(yīng)的主要影響因素有：（一）循環(huán)參數(shù)（反應(yīng)溫度與時(shí)間）變性退火延伸循環(huán)次數(shù),,（二）PCR反應(yīng)成分Taq DNA聚合酶引物dNTP緩沖液模板其它因素高溫啟動添加劑,§3 引物的設(shè)計(jì),一、設(shè)計(jì)原則PCR擴(kuò)增引物：是指與待擴(kuò)增DNA區(qū)域兩端序列互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸短片段，其長度通

28、常在15～30個(gè)核苷酸之間。它包括引物1和引物2。引物1：又稱Watson引物，是5’端與正義鏈互補(bǔ)的寡核苷酸，用于擴(kuò)增編碼鏈或mRNA鏈。引物2：又稱Crick引物，是3’端與反義鏈互補(bǔ)的寡核苷酸，用于擴(kuò)增DNA模板鏈或反密碼鏈。引物設(shè)計(jì)的基本原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。具體的設(shè)計(jì)原則見書P57。,二、引物長度引物太短→可能同非靶序列雜交，得出非預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。引物過長→引物同模板DNA

29、的雜交速率下降，結(jié)果在反應(yīng)循環(huán)周期內(nèi)無法完成同模板DNA的完全雜交，從而減低PCR反應(yīng)的效率。,,三、引物的5’端修飾法5’端附加核酸序列功能基團(tuán)修飾法放射性核素（修飾三磷酸）非放射性分子（修飾堿基）,§4 耐熱DNA聚合酶,一、Taq DNA聚合酶熱穩(wěn)定性無3’ →5’外切酶活性反轉(zhuǎn)錄活性非模板依賴的聚合活性影響酶活性的因素,,二、其它耐熱DNA聚合酶（見書P56）Pwo DNA聚合酶Tth DNA聚

30、合酶C. therm.聚合酶vent DNA聚合酶*Pfu DNA聚合酶*,2.5 DNA片段的化學(xué)合成,2.5.1 寡核苷酸片段的化學(xué)合成的方法磷酸二脂法磷酸三脂法固相亞磷酸三脂法（常用）,2.5.2 化學(xué)方法合成的DNA片段 化學(xué)方法可合成DNA互補(bǔ)鏈的引物、寡核苷酸連桿以及基因片段和元件等。合成DNA互補(bǔ)鏈的引物除PCR引物外，還有測序引物。見下表。,DNA寡核苷酸連桿（linker）l

31、inker：是指用化學(xué)方法合成的一段由10~20個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。linker經(jīng)限制酶切割后可產(chǎn)生一定的粘末端，可與另一有相同粘末端的DNA片段連接。（附圖）化學(xué)合成的寡核苷酸中，有的含有一個(gè)反向重復(fù)序列而形成一個(gè)雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在雙鏈部分有一種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，切割后產(chǎn)生一定的粘末端或平末端。這種寡核苷酸可兼作連桿和引物，即測序引物連桿。由幾十至上百個(gè)核苷酸組成，有多種

32、限制酶的識別序列，可作為連桿且被組裝在克隆載體上成為多克隆位點(diǎn)（MCS）。這種連桿即多克隆位點(diǎn)寡核苷酸連桿或簡稱MCS連桿。 （附圖）,,銜接頭（adaptor）adaptor：它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。（附圖）DNA芯片DNA芯片：是DNA片段以預(yù)先設(shè)計(jì)的排列方式固定在載玻片或尼龍膜上組成的密集分子排列。,2.6 DNA片段大小的凝膠電泳檢測,方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚

33、丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖-聚丙烯酰胺凝膠電泳和脈沖場凝膠電泳等方法。條件：中性或偏堿性的緩沖系統(tǒng)，DNA帶負(fù)電。運(yùn)動方向：DNA經(jīng)過凝膠分子篩移向正極。遷移率影響因素：DNA分子的大小和構(gòu)型，與DNA堿基組成和順序無關(guān)。檢測：溴化乙錠染色，紫外光下發(fā)紅色熒光。,2.6.1 瓊脂糖凝膠電泳參數(shù)凝膠緩沖液和電泳緩沖液常用：TAE、TBE、TPE凝膠中瓊脂糖含量檢測大片段DNA的含量小，反之則大。加DNA樣品一般1

34、81;g以下，多了會使大小接近的DNA帶不易分開，少了會影響小片段DNA帶的檢測。電泳條件注意：靠加樣孔一側(cè)為負(fù)極。電壓：1～10V/cm（依據(jù)分辨力要求、DNA片段大小和電泳時(shí)間決定）溴化乙錠（EB）染色和紫外觀察注意：溴化乙錠是很強(qiáng)的誘變劑，操作時(shí)應(yīng)帶手套！溴化乙錠溶液必須經(jīng)處理后才能廢棄。,,2.6.2 DNA片段（分子）大小的估算將待測DNA片段直接與Marker比較；通過Marker的相對遷移距離，推測出待測D

35、NA片段的大小。,M CK 1 2 3 4 5 6,bp20001000750500250100,,,,,,,2.6.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳參數(shù)制膠的電泳緩沖液： 90nM Tris-硼酸緩沖液凝膠丙烯酰胺含量：按表2-24進(jìn)行加DNA樣品：加樣孔一端為上方。上下電泳槽加入電泳緩沖液，凝膠要完全接觸電泳緩沖液，接觸處不得有氣泡。電泳條件：緩沖液槽在上方為負(fù)極，下方為正極，電壓5

36、V/cm，室溫。EB染色和DNA片段大小估算（同瓊脂糖凝膠電泳）,2.6.4 脈沖場凝膠電泳（CHFE）參數(shù)緩沖液： TBE或0.5×TBE，蠕動泵驅(qū)動循環(huán)。凝膠：用0.5%TBE制備的瓊脂糖凝膠按圖2-16裝入電泳槽，加入電極緩沖液，超過凝膠2～3㎜。加入DNA樣品電泳條件：交替改變的電場力，由編程轉(zhuǎn)換裝置控制脈沖參數(shù)。DNA的EB染色DNA片段大?。ǚ肿樱┑墓浪悖嚎蓹z測幾百萬bp的DNA片段。脈沖場凝膠電泳

37、分離片段大小及遷移速度的經(jīng)驗(yàn)公式見表2-25。,2.7 DNA片段的連接重組,2.7.1 DNA連接酶（DNA Ligase）DNA連接酶：是在1967年發(fā)現(xiàn)的一種能夠催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3’羥基端與5’磷酸基團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接起來的酶。如果是兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的雙鏈DNA片段末端連接，則產(chǎn)生重組DNA分子。連接酶的主要類型：E. coli DNA連接酶T4 DNA連接酶,DNA連接酶連接作用

38、的特點(diǎn)①DNA連接酶需要一條DNA鏈的3’－末端有一個(gè)游離的羥基（－OH），另一條DNA鏈的5’－末端有一個(gè)磷酸基（－P）的情況下，才能發(fā)揮連接DNA分子的作用。②只有當(dāng)3’－OH和5’－P彼此相鄰，并且各自位于與互補(bǔ)鏈上的互補(bǔ)堿基配對的兩個(gè)脫氧核苷酸末端時(shí)，DNA連接酶才能將它們連接成磷酸二酯鍵。③DNA連接酶不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。,,,④DNA連接酶

39、只能封閉雙螺旋DNA上失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈缺口（nick），而不能封閉雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的單鏈裂口（gap）。⑤由于在羥基和磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵是一種吸能反應(yīng)，因此，DNA連接酶在進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，還需要提供一種能源分子（NAD＋或ATP）。,,,2.7.1.1 E. coli DNA連接酶E. coli DNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，不能催化雙鏈DNA平末端

40、之間的連接。2.7.1.2 T4 DNA連接酶T4 DNA連接酶既可用于雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較低。,2.7.2 DNA片段之間的連接具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接連接時(shí)可用E. coli DNA連接酶或T4 DNA連接酶。具平末端DNA片段之間的連接連接時(shí)只能用T4 DNA連接酶，且需增加酶量。DNA片段末端修飾后進(jìn)行連接DNA片段末端同

41、聚物加尾后連接（末端轉(zhuǎn)移酶）（附圖）黏性末端修飾成平末端后連接（核酸外切酶Ⅶ）DNA片段5’端脫磷酸化作用后連接（堿性磷酸酶）（附圖）BAP（細(xì)菌堿性磷酸酶）：耐熱，不易除去，故不常用。CIP（小牛腸堿性磷酸酶）：不耐熱，便于終止反應(yīng)，常用。DNA片段加連桿后連接都具平末端的兩種DNA片段加連桿后連接。分別具平末端和黏性末端的兩種DNA片段加連桿后連接。分別具非互補(bǔ)黏性末端的兩種DNA片段加連桿后連接。,,2.7.3

42、DNA重組類型插入重組置換重組,補(bǔ)充內(nèi)容：重組DNA技術(shù)基本原理,流程演示,以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程,演示,謝謝,染色體DNA： 103~ 106kb 。是生物界含量最豐富的DNA資源，蘊(yùn)藏著地球上極大部分的遺傳信息。用途：分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控因子；提供構(gòu)建染色體載體和染色體基因整合平臺系統(tǒng)。病毒和噬菌體DNA： 種類很多，可在原核和真核生物宿主內(nèi)大量增殖

43、。用途：構(gòu)建基因克隆載體，承載較大片段的外源DNA，經(jīng)體外包裝，導(dǎo)人受體細(xì)胞；其編碼的結(jié)構(gòu)基因可分離出目的基因及其表達(dá)調(diào)控因子。,質(zhì)粒DNA： 存在于很多微生物細(xì)胞內(nèi)，游離于胞質(zhì)（即染色體外遺傳物質(zhì)）， 1~幾百 kb。有復(fù)制起始位點(diǎn)，能自我復(fù)制。用途：構(gòu)建基因克隆載體；含結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒可分離目的基因和表達(dá)調(diào)控因子。線粒體和葉綠體DNA：真核生物特有的染色體外遺傳物質(zhì)，含有呼吸作用和光合作用相關(guān)基因。用途：分離目的基因和基因表達(dá)調(diào)控