第二章dna的結(jié)構(gòu)與功能

1、第二章：第二章：DNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能一、一、DNA的一級結(jié)構(gòu)的一級結(jié)構(gòu)1953年Watson和Crick創(chuàng)立的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，闡明了DNA分子的結(jié)構(gòu)特征，提出DNA是遺傳分子。DNA的一級結(jié)構(gòu)：是指4種核苷酸的連接及排列順序，表示了DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。四種脫氧核糖核苷酸分別表示為：dAMP、dGMP、dTMP、dCMP。DNA分子是由這四種不同的脫氧核苷酸，通過3，5磷酸二酯鍵連接而成的直鏈分子。1DNA分子的多樣性：

2、分子的多樣性：組成DNA分子的堿基雖然只有四種，但是，由于堿基可以任何順序排列，而構(gòu)成了DNA分子的多樣性。如：某一DNA分子是由100個bp組成，它們的可能排列方式就是4100。實(shí)際上DNA鏈中的堿基數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出100個，所以，它們的排列方式幾乎是無限的。即生物的多樣性。因此，DNA中的堿基排列順序是DNA分子的重要屬性。對一種DNA屬性的最基本了解就是測定其堿基的排列順序一級結(jié)構(gòu)。二、二、DNA的物理圖譜的物理圖譜DNA的物理圖譜：是

3、DNA分子的限制性內(nèi)切酶酶解片段的排列順序，也就是在DNA片段上標(biāo)記出限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)順序。假設(shè)有一段DNA片段為2450bp，分別有兩個XbaI和兩個PstI位點(diǎn)，這樣每一個單酶切會把此DNA分子切成3個片段，雙酶切將產(chǎn)生5個片段。三、三、DNA一級結(jié)構(gòu)的測定一級結(jié)構(gòu)的測定雙脫氧末端終止法Sanger法：原理是采用核苷酸鏈終止劑—2，，3，雙脫氧核苷酸終止DNA的延長。由于它缺少形成3，，5，磷酸二脂鍵所需要的3，OH，一旦參入到D

4、NA鏈中，此DNA鏈就不能進(jìn)一步延長。根據(jù)堿基配對原則，每當(dāng)DNA聚合酶需要dNMP參入到正常延長的DNA鏈中時，就有兩種可能性，一是參入ddNTP結(jié)果導(dǎo)致脫氧核苷酸鏈延長的終止；二是參入dNTP使DNA鏈仍可繼續(xù)延長，直至參入下一個ddNTP。根據(jù)這一方法，就可得到一組以ddNTP結(jié)尾的長短不一的DNA片段DNA序列分析，將反應(yīng)體系分成4組，每一組反應(yīng)體系中加入4種脫氧核苷三磷酸和一種相應(yīng)的雙脫氧核苷三磷酸，反應(yīng)后可得到不同長度的以雙

5、脫氧結(jié)尾的DNA片段，各DNA片段均只相差一個核苷酸長度，各組的片段經(jīng)凝膠電泳分離后，每一片段的電泳位置不同，從下而上（由小到大）可直接讀出DNA序列。四、四、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)Watson和Crick于1953年根據(jù)DNA纖維X射線晶體衍射圖及其它試驗(yàn)資料，提出了DNA為右手雙螺旋結(jié)構(gòu)的科學(xué)假設(shè)，隨后證明他們提出的DNA構(gòu)象是DNA分子最為常見的結(jié)構(gòu)，通常稱為B型DNA。而DNA分子的結(jié)構(gòu)不是固定不變的，在不同的環(huán)境因素，

6、都可促使DNA分子形成不同的構(gòu)象。通常情況下可分為兩大類：一類是右手螺旋，如、BDNA、CDNA、DDNA、EDNA、ADNA；另一類是局部的左手螺旋，即ZDNA。大部分疏水基團(tuán)分布在C端。組蛋白的修飾作用包括：甲基化、乙酰化、磷酸化，富含賴氨酸和精氨酸：H5還富含丙氨酸、絲氨酸。2、非組蛋白HMG蛋白（HighMobilityGroupProtein)：分子量小3x104以下電泳遷移快而得名，易用低鹽溶液0.35mol抽提，其功能可能

7、與DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。DNA結(jié)合蛋白：是一些與DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)節(jié)物質(zhì)，需用2molNaCl和5mol尿素才能解離。A24非組蛋白：用0.2mol硫酸從小鼠肝臟中分離得到，位于核小體內(nèi)，功能不詳。八、八、DNA結(jié)構(gòu)的不均一性結(jié)構(gòu)的不均一性反向重復(fù)序列(invertedrepeats)又稱回文序列(palindrome)，它能在DNA或RNA中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這種回文結(jié)構(gòu)通常是作為一種特別信號，如限制性核酸內(nèi)切酶及調(diào)節(jié)蛋白的

8、識別位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止信號等。富含AT的序列：在很多有重要調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)段都富含AT特別是在復(fù)制起點(diǎn)和啟動子的Pribnow框(真核生物為TATA框)的序列中，其對于復(fù)制和起始十分重要。因?yàn)锳－T對只有二條氫鍵，此處的雙鏈較G－C對處易于解開，有利于起始復(fù)合物的形成。九、九、DNA的變性、復(fù)性和分子雜交的變性、復(fù)性和分子雜交1、DNA的變性（denaturation）：在加熱、堿性等條件下，ATGC氫鍵斷裂，形成單鏈結(jié)構(gòu)。DNA在溶液中

9、發(fā)生變性伴隨著一系列理、化性質(zhì)的改變。紫外吸收強(qiáng)度增加；溶液粘度降低；沉降速度增加等。紫外吸收強(qiáng)度的增加與變性（解鏈）程度成正比；DNA的熱變性常稱為DNA的“融解”，解鏈曲線的中點(diǎn)所示的溫度稱為Tm或稱為融點(diǎn)，Tm表示使50%DNA分子解鏈的溫度。不同種類DNA有不同的解鏈曲線，也有不同的Tm，Tm隨（GC）%含量呈線性增加。2、DNA的復(fù)性：去除變性條件后，DNA可以回復(fù)成雙鏈結(jié)構(gòu)，恢復(fù)原有的物理化學(xué)特征和生物學(xué)活性，稱為DNA復(fù)性

10、（renaturation）。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱為退火(annealing)。3、核酸的分子雜交：用放射性同位素或熒光素及其他物質(zhì)標(biāo)記的已知核酸片段或寡聚核苷酸作為探針，借助探針探測分析未知的核酸樣品。稱為Southern印跡分析。Nthern印跡分析：根據(jù)Southern的原理，用已知DNA作探針，分析檢測RNA的方法。菌落或噬菌斑原位雜交：將硝酸纖維素膜置于布滿細(xì)菌菌落或噬菌斑的平板上，使平板上每一菌落的