第七章動物基因組學基礎

1、1,第八章  動物基因組學基礎,第一節(jié)    動物遺傳標記 一 遺傳標記的概念及其發(fā)展 （一）遺傳標記的概念 遺傳標記是指能夠用以區(qū)別生物個體或群體及其特定基因型、并能穩(wěn)定遺傳的物質(zhì)標志。 遺傳標記是一些等位基因或遺傳物質(zhì)，能在生物體上以各種形式表現(xiàn)出各種變異。 遺傳標記的概念經(jīng)歷了從宏觀到微觀、從外部到內(nèi)部、從

2、蛋白質(zhì)到DNA的發(fā)展過程。,2,,（二）遺傳標記概念的發(fā)展 □ 形態(tài)學標記 能用肉眼觀察和識別的外部性狀。例如，動物的毛色、角形、耳型、體型、外貌等。此法簡單直觀，但標記數(shù)目少、多態(tài)性低、易受環(huán)境影響。 □ 細胞遺傳標記 主要是指染色體核型（染色體的數(shù)目、大小、隨體、著絲粒位置、核仁組織區(qū)等）、帶型和數(shù)量的變異。此法能反映出染色體結(jié)構和數(shù)目的多態(tài)性，但由于這些變異往往帶來有害的表型

3、效應，生物難以忍受。,3,,□ 免疫遺傳標記 以動物的免疫學特征為標記，主要是紅細胞抗原多態(tài)性和白細胞抗原多態(tài)性。 · 紅細胞抗原多態(tài)性——血型，以細胞表面的抗原而定 · 白細胞抗原多態(tài)性——主要組織兼容性復合體（MHC），以白細胞表面的抗原而定。 □ 生化遺傳標記（蛋白質(zhì)多態(tài)性標記） 同一種動物中，具有相同功能的蛋白質(zhì)存在兩種以上的變異體，有些可以用電

4、泳方法區(qū)分其中的差異。,4,,□  分子遺傳標記 ○分子遺傳標記是以DNA多態(tài)性為基礎的遺傳標記，又稱DNA分子標記或多態(tài)性DNA標記。 ○自20世紀70年代以來，隨著分子生物學的發(fā)展，相繼建立了多種分子遺傳標記檢測技術，例如，RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等。 ○分子遺傳標記的特點：遺傳多態(tài)性高；檢測方法簡單快捷；遺傳共顯性，能分離出等位基因的三種基因型。,5,,二、分子遺傳

5、標記 （一）限制性片段長度多態(tài)性（restiction fragment length polymorphism,RFLP） ○ RFLP RFLP是1980年建立的第一代分子遺傳標記。 原理：用限制性內(nèi)切酶切割不同個體的DNA時，如果存在酶切位點的變化，就會產(chǎn)生長度不同的DNA片段，電泳后用克隆探針檢測時，就會出現(xiàn)泳動行為的改變。 基本過程：取得DNA樣本——酶切——電泳——轉(zhuǎn)移至硝酸纖

6、維膜上——DNA探針雜交——放射自顯影,6,圖7-1 Southern雜交過程,7,圖7-2 RFLP檢測,8,,○ 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction , PCR） PCR是1985年建立的一種體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。 原理：在反應溫度為90—95℃時，DNA變性成為單鏈；反應溫度降至45—65℃時，兩種引物與兩條單鏈DNA退火而配對結(jié)合；反應溫度升至72℃左右時，

7、在TaqDNA聚合酶作用下，引物以單鏈DNA為模板逐步延伸成新的單鏈?！?變性——退火——延伸”這一循環(huán)完成后，DNA復制了一次，由一個DNA分子成為兩個DNA分子。,9,圖7-3 DNA擴增原理,10,,○ PCR—RFLP 如果已知多態(tài)性位點周圍的DNA序列，則可用PCR快速而簡單地進行RFLP分析。 首先根據(jù)多態(tài)位點兩側(cè)序列設計和合成引物；以基因組DNA為模板進行PCR擴增；用相應的內(nèi)切酶進

8、行消化；再進行電泳，分析PCR區(qū)帶判斷多態(tài)性。,11,圖7-4 PCR—RFLP,12,,（二）串聯(lián)重復序列標記（tandem repeated sequence,TRS） ○ 真核基因組序列 單一序列 短片段重復序列（正向重復、反向重復、回文序列） 長片段重復序列（輕度重復、中度重復、高度重復）,13,,高度重復序列 衛(wèi)星DNA（satellite DNA） 序列中G-C含量約30%，遠低于基因組

9、中主體DNA （G-C含量約42%）。將DNA切成片段進行氯化銫密度梯度離心時，由于富含A-T浮力密度小，形成一條窄帶在主體DNA外面，故稱衛(wèi)星DNA。 小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA） 微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）,14,圖7-6 衛(wèi)星DNA,15,○小衛(wèi)星標記 小衛(wèi)星DNA是一種可變數(shù)量的串聯(lián)重復（varible number of tandem repeats

10、, VNTR），在不同個體和基因組的不同位點上數(shù)目都不同。 用內(nèi)切酶把總DNA切成不同長度的片段（VNTR上沒有酶切位點），再以VNTR中的特殊序列為探針進行Southern雜交，由于不同個體的這種串聯(lián)重復的數(shù)目及位置不同，所以VNTR的Southern雜交譜帶具有高度的個體特異性，故又稱其為DNA指紋（DNA fingerprints）。,16,,○ 微衛(wèi)星標記 微衛(wèi)星DNA又稱短串聯(lián)重復序列（STR），重復單位的核

11、心序列為2—6 bp。 以微衛(wèi)星DNA兩側(cè)特異性序列設計探針，用PCR技術擴增微衛(wèi)星片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，不同個體因核心序列重復次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性。,17,真核生物基因組序列,,18,一個家系的微衛(wèi)星PCR檢測結(jié)果,19,,（三）單核苷酸多態(tài)性標記（single nucleotide polymorphism ,SNP） SNP與RFLP、STR等標記不同之處在于不以“長度”差別為檢測手段，而是

12、直接以序列的變異作為標記。 基因組DNA某一特定的核苷酸位置上，可能發(fā)生單個堿基的變化，如轉(zhuǎn)換、顛換等，使得群體中基因組的某些位點上存在差異。 SNP就是指基因組內(nèi)特定的核苷酸位置上存在兩種以上不同的核苷酸，其中最少一種在群體中的出現(xiàn)頻率不少于1%（低于1%則視為突變）。,20,SNP是出現(xiàn)頻率最高的標記，人類基因組中平均每1000 bp中就有1個SNP，總數(shù)可達300萬個。

13、 位于基因表達序列內(nèi)的SNP可能會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構和表達水平，對分析基因與性狀的關系有重要意義。 SNP是單堿基突變，任何用于單堿基突變的技術都可用于SNP檢測，如RFLP、DNA序列分析、單鏈構象多態(tài)性（SSCP）等。最先進的是微數(shù)列矩陣DNA芯片（DNA chip）技術。,21,,三、分子遺傳標記的應用 ○個體及親緣關系的鑒定 DNA指紋 ○遺傳資源的評估、監(jiān)測、保護和利用 ○基因定位和遺傳圖譜的

14、構建 ○標記輔助選擇,22,,第二節(jié)   基因組作圖 一、基本概念 ○ 基因組作圖主要分兩個范疇：遺傳作圖（genetics mapping）和物理作圖（physical mapping）。 ○ 作圖需要界標（landmark）或遺傳標記（genetics marker）。常用的遺傳標記（血型、蛋白質(zhì)多態(tài)型、等位基因、特定的DNA序列等）在早期構建遺傳圖時常用作制圖的界標?，F(xiàn)在主

15、要采用以下的界標： 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） 微衛(wèi)星DNA多態(tài)性界標 單核苷酸多態(tài)性（SNP）界標 非多態(tài)的短單一序列作為界標,23,,二、遺傳圖 （一）基本概念 應用遺傳學技術構建能顯示基因以及其它序列特征在基因組上位置的圖。 方法是以多態(tài)的遺傳標記作為界標，計算細胞減數(shù)分裂過程中遺傳標記之間發(fā)生重組的頻率，來確定兩個遺傳標記在染色體上的相對位置。 遺傳標

16、記之間的相對距離即圖距以厘摩（cM，厘摩爾根，centi-Morgan）為單位。當兩個遺傳標記之間的重組值為1%時，圖距即為1cM。,24,經(jīng)典遺傳圖的作圖最常用的是三點測交法。 現(xiàn)代遺傳圖的概念是于1980年提出的，就是將單純的表型多態(tài)性界標改變?yōu)橐訢NA序列的多態(tài)作為作圖界標。 各種遺傳界標可在國際互聯(lián)網(wǎng)上可以查閱（http://www.gdb.org）。 當用DNA序列多態(tài)作為界標的遺傳圖時，一但確定

17、該DNA界標與某一基因的具體位置，便可分離克隆這個基因。 人類第一張以RFLP為界標的遺傳圖發(fā)表于1987年。,25,,（二）遺傳圖的局限性 分辨率有限 高等真核生物子代數(shù)量有限，只有少數(shù)的減數(shù)分裂事件可供研究，連鎖分析的分辨率受很大限制 人類基因組測序要求每100kb有一個標記，1996年發(fā)表的人類遺傳圖達到每0.6Mb一個標記（1Mb=1000kb） 精確度較低 假設交換是隨機發(fā)生的，但由于交換熱點

18、的存在使某一區(qū)段的交換頻率遠高于其它區(qū)段，無法繪制精確的遺傳圖。,26,,三、物理圖（一）基本概念 應用分子生物學技術來直接分析DNA分子，從而構建能顯示包括基因在內(nèi)的序列特征的位置圖。 以特定的DNA序列為界標直接排列在基因組DNA分子上，這些特定的DNA序列可以是多態(tài)的（如RFLP），但主要是非多態(tài)的（如STS、STR、EST）和特定的基因序列等。 物理圖中界標之間的距離單位依作圖方法而定，輻射育種作

19、圖單位為厘鐳（cR），限制性作圖單位元以物理長度，即堿基對數(shù)目（bp、kb）來表示。,27,,（二）作圖的基本方法 1．限制性作圖——將限制性酶切位點標定在DNA分子的相對位置上。 限制性內(nèi)切酶有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，Ⅰ型、Ⅲ型酶位點特殊性不強，Ⅱ型專一性很強。 6 bp識別序列的限制性內(nèi)切酶適用于50 kb以下的DNA分子作圖。 限制性作圖方法是：比較一個DNA分子被兩種酶切割產(chǎn)生的兩套片段。,2

20、8,圖7-16 限制性內(nèi)切酶,29,,3．序列標記位點（sequence tagged site, STS）作圖——通過PCR或分子雜交將小段DNA順序定位在基因組的DNA區(qū)段中。是目前用于構建最為詳盡的大基因組物理圖的主流技術。 ○ STS作圖原理 STS是一段短的DNA序列（100—500）bp，每個基因組只有一個拷貝。 當兩個片段含有同一STS時，可確認這兩個片段重疊。 兩個不同的ST

21、S出現(xiàn)在同一片段的機會取決于它們在基因組中的位置，彼此接近，同時出現(xiàn)在同一片段的機會就大，反之則小。 兩個標記間的圖距根據(jù)分離頻率來計算。,30,○ STS 的種類 ⑴ 表達序列標記（expressed sequence tag, EST），是從cDNA克隆中獲得的短序列。EST是獲得基因序列的簡捷方法。 ⑵ 簡單序列長度多態(tài)性（SSLP，小衛(wèi)星和微衛(wèi)星）。 ⑶ 隨機基因組序列，從克隆的基因組DNA

22、中隨機測序獲得。,31,,第三節(jié)   基因定位方法 動物有幾十條染色體，有幾萬個基因，平均每條染色體有上千個基因。 確定基因在哪一條染色體的哪一個座位上就是基因定位。 將定位的基因標注在染色體上就可得到基因圖（gene map） 基因定位與基因組作圖和基因克隆關系密切：基因定位后可以作為一個界標；確定基因的位置后就可按圖去分離克隆基因 不同生物的基因定位方法不完全相

23、同。 基因定位的方法隨著遺傳學的發(fā)展而進步。,32,一、質(zhì)量性狀的基因定位 質(zhì)量性狀——從表型上可以明顯區(qū)分為不同類型的性狀。 （一）家系分析定位法 性連鎖分析是最常用的方法。哺乳動物中只出現(xiàn)在雄性的性狀，控制該性狀的基因在Y染色體上。性狀出現(xiàn)隔代交叉遺傳、且雄性出現(xiàn)比例高于雌性，則控制該性狀的基因在Y染色體上。 （二）遺傳重組值定位法 摩爾根提出的方法，根據(jù)基因間的重

24、組值與遺傳距離成正比的原理，采用兩點測交和三點測交的方法進行基因定位。,33,,（三）體細胞雜交定位法 不同物種細胞融合后，雜種細胞會出現(xiàn)排除某一親本染色體的現(xiàn)象，在人鼠雜種細胞常專一性地排除人的染色體?？梢灾苽浜粭l（或少數(shù)幾條）人染色體的雜種細胞。 ○ 定位測驗法 鑒別雜種細胞中保留了哪些人染色體，測定雜種細胞產(chǎn)生了哪些基因產(chǎn)物，經(jīng)分析可將基因定位在哪一條染色體上。,34,（四）原位雜交定位 將待定位

25、基因的特定DNA序列或該基因轉(zhuǎn)錄的RNA作為探針，在標記了放射性同位素或非放射性化學物質(zhì)后，與變性后的染色體DNA雜交，該探針就會同染色體DNA與其互補的序列結(jié)合成為雙鏈，通過放射自顯影或顯色技術，就可確定探針（即待定基因）在染色體上的位置。,35,二、數(shù)量性狀的基因定位 ○ 數(shù)量性狀——由微效多基因控制的呈連續(xù)變異的性狀。由于每個基因效應值都較小，無法闡明單個基因的行為和效應，只能當作一個整體來分析。同時，對控制數(shù)量性狀的基

26、因數(shù)目不能準確估計，不能用提供基因的實際位置和功能上的信息。 隨著分子數(shù)量遺傳學的發(fā)展，極大地深化了數(shù)量遺傳學的理倫，提供了在DNA水平研究數(shù)量性狀的先進技術。,36,,○ 主效基因——對某一數(shù)量性狀具有很大的效應的等位基因。由于自發(fā)或誘發(fā)突變引起明顯的形態(tài)學上的變異。如豬的氟烷基因、牛的雙肌基因等。 ○ 數(shù)量性狀基因位點（QTL） 具有相同或相關功能的基因往往分布在某一染色體區(qū)域內(nèi)，從而形成基因群。

27、控制同一性狀的微效基因可能存在于有限的幾個基因群內(nèi)，而一基因群占據(jù)染色體的一定區(qū)域，稱作數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus,QTL）,37,,一些QTL可以對數(shù)量性狀有較大的影響（對數(shù)量性狀的影響超過表型值方差的5%），因而具有選擇價值 一個數(shù)量性狀往往受多個QTL的影響，這些QTL分布在基因組的不同位置上。利用特定的遺傳標記可以確定影響某一性狀的QTL在染色體上的數(shù)目、位置及其遺傳效應，這就是Q

28、TL作圖或稱QTL定位 QTL作圖原理：利用特定遺傳分離群體中的遺傳標記及相應的數(shù)量性狀觀察值，分析遺傳標記與性狀之間的連鎖關系。如果證明遺傳標記與性狀連鎖，則可認定標記附近存在一個或幾個QTL,38,,QTL作圖步驟： ⑴ 構建作圖群體——該群體待測的數(shù)量性狀存在廣泛變異，如F2群體 ⑵ 選用合適的遺傳標記——須具備4個特征：數(shù)量豐富，多態(tài)性好，中性，共顯性。如RFLP、AFLP、RAPD、VNTR、SSR等

29、 ⑶ 測定標記的基因型，制作標記的遺傳圖譜 ——應含有P1，P2和雜合型三種帶型（即三種基因型）。 ⑷ 測量數(shù)量性狀——測定遺傳標記時，測定其數(shù)量性狀值 ⑸ 統(tǒng)計分析——單標記分析、雙分子標記分析、多分子標記分析。,39,定位QTL主要有兩種方法： 基因組掃描——利用遺傳上差異較大的品種進行雜交，跟蹤性狀和染色體上的標記在多世代家系中的分離情況。 候選基因法——不需特定品種的雜交，

30、只要發(fā)現(xiàn)一個候選基因位點上存在多態(tài)性，便可直接在商業(yè)品系中研究該多態(tài)性與目標性狀之間的相關性。,40,,QTL的性質(zhì) ⑴ QTL可能是一個基因，也可能是幾個基因； ⑵ 數(shù)量性狀受為數(shù)不多、效應不等的幾個QTL影響。少數(shù)位點對性狀變異貢獻很大 ⑶ 由于不同群體的遺傳背景不同，根據(jù)不同群體確定的QTL會有差異 ⑷ 統(tǒng)計分析確定的QTL的位置并非物理上的位置,41,,QTL的應用 ⑴ 由QTL得到的遺傳圖可進一步

31、換算成物理圖，對QTL進行克隆和序列分析，研究控制數(shù)量性狀的基因結(jié)構和功能。 ⑵ 在育種上進行標記輔助選擇，利用標記與性狀的連鎖提早進行識別和選擇。 ⑶ 利用標記與性狀的連鎖分析，可以提供與雜種優(yōu)勢有關的信息，鑒定與優(yōu)勢有關的位點，確定親本在QTL上的差異，可能預測雜種優(yōu)勢。,42,,第四節(jié)   動物基因組學 一、基因組研究的新學科 基因組學（genomics）——研究基因組結(jié)構與

32、功能的分支學科，又分為結(jié)構基因組學和功能基因組學。 轉(zhuǎn)錄物組學（transcriptomics）——研究某一時刻某一細胞里基因組產(chǎn)生的全部轉(zhuǎn)錄物的種類、結(jié)構和功能。 蛋白質(zhì)組學（proteomics）—— 研究細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的學科。 表型組學（phenomics）——研究生物體整個表型形成的機制。,43,二、人類基因組計劃 ○ 美國于1990年由能源部和國立衛(wèi)生研究院起動了預算

33、耗時15年、經(jīng)費30億美元的人類基因組計劃 ○ 2001年2月15日，由中、美、英、法、德、日等6國科學家組成的“人類基因組測序國際協(xié)作組”，在《自然》雜志上發(fā)表了關于人類基因組框架圖的數(shù)據(jù)；次日，美國Celera Genomics公司的也公布了人類基因組框架圖的數(shù)據(jù)。有關人類遺傳本性的“生命之書”的誕生，是生命科學發(fā)展史上的一個重要里程碑。,44,,○ 人類基因組計劃的主要內(nèi)容 ⑴ 基因組作圖——繪制遺傳圖，物理圖

34、。 ⑵ 測序——測定全基因組DNA分子的核苷酸序列，繪制序列圖。 ⑶ 基因識別——識別出基因序列，設法克隆基因，研究基因功能。 ⑷ 模式生物研究——大腸桿菌、酵母菌、線蟲、果蠅、小鼠等。 ⑸ 發(fā)展生物信息學和計算生物學 ⑹ 基因組對倫理、法律和社會產(chǎn)生的影響,45,,三、動物基因組計劃及其應用前景 先后開展豬、牛、綿羊、雞等動物的基因組研究，目標大致相同。 ○ 豬基因組

35、計劃的目標 構建遺傳圖——復蓋基因組90%以上，標記間距20cM左右的遺傳圖； 構建標記位點——每條染色體臂至少一個遠端和近端的標記； · 開發(fā)豬染色體激光流動分型技術； · 開發(fā)快速測定多態(tài)分子的PCR技術； · 開發(fā)和評估用于分析QTL作圖試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法……,46,,○ 應用前景 · 基因診斷——檢測基因型，區(qū)分顯性純合體和