小吞噬實驗

1、實驗二 中性粒細胞吞噬功能測定 ——細菌計數(shù)法,一、實驗內(nèi)容,1. 細菌計數(shù)法測定中性粒細胞吞噬功能 (小組做),2. 錄相《免疫反擊戰(zhàn)》,二、目的與要求,1.了解中性粒細胞生物學(xué)特性及其意義。,2.熟悉“細菌計數(shù)法測定中性粒細胞吞噬功能”試驗的原理、方法及用途。,[實驗原理],中性粒細胞——來源于骨髓造血干細胞；,占白細胞總數(shù)的60%~70%；,生命周期短，不能分裂，靠“造血”補充；,胞核呈多葉狀；胞質(zhì)內(nèi)有多種顆

2、粒；,內(nèi)含髓過氧化物酶、防御素、溶菌酶、組織蛋白酶、乳鐵蛋白、堿性磷酸酶等。,,,中性粒細胞特有，巨噬細胞沒有這種酶，為中性粒細胞在細胞化學(xué)上的標(biāo)志。,中性粒細胞通過趨化、調(diào)理、吞入和殺菌等步驟，吞噬和消化衰老、死亡細胞及病原微生物等異物；,中性粒細胞產(chǎn)生偽足包圍異物——吞噬體或吞噬泡；,吞噬——呼吸爆發(fā)——產(chǎn)生大量過氧化物及超氧化物等毒性效應(yīng)分子——殺死吞噬的細菌等異物；,同時，中性粒細胞本身也死亡，成為膿細胞。,吞噬痢疾桿菌,,吞噬

3、炭疽桿菌,小吞噬細胞吞噬的細菌,中性粒細胞：,A.在抗化膿性細菌感染中起重要防御作用；B.引起感染部位急性炎癥反應(yīng)；C.參與超敏反應(yīng)（如III型超敏反應(yīng)），引起機體免疫病理損傷。,將新鮮血液和細菌混合，經(jīng)合適時間后涂片染色，即能觀察到被吞噬到中性粒細胞內(nèi)但還未被消化掉的細菌。 檢測中性粒細胞吞噬細菌的能力，可作為輔助判斷機體非特異性免疫力的指標(biāo)之一。,細菌計數(shù)法測定中性粒細胞吞噬功能——小吞噬實驗,檢測指標(biāo)：,1. 吞噬百

4、分率＝,100個細胞中吞噬有細菌的細胞數(shù),人吞噬百分率正常參考值：62%~76%,,100,×,100%,2. 吞噬指數(shù)＝,100個中性粒細胞吞噬的細菌總數(shù),人吞噬指數(shù)正常參考值：1.32~1.72,,100,,,(1)顯微鏡、香柏油、小試管、EP管、載玻片、酒精棉球、吸管、水浴箱等。(2)肝素抗凝試管、瑞氏染液、雙蒸水。(3)菌液制備：白色葡萄球菌18～24小時內(nèi)湯培養(yǎng)物，經(jīng)Mc Farland比濁法調(diào)整濃度至6～9&#

5、215;109/mL，加熱100℃ 15分鐘殺死細菌，置4℃保存?zhèn)溆谩?實驗材料,(1)仔細消毒后，每個班取5ml靜脈血于肝素抗凝管內(nèi)（輕輕搖勻）。,實驗方法,(3)取出EP管，用吸管吹打混勻后，取1滴“全血-白色葡萄球菌混合液”置于潔凈載玻片上，用另一載玻片推片，制成血涂片。,(2) 取2ml抗凝血于EP管內(nèi)，再加入1ml備好的白色葡萄球菌菌液，充分混勻后，置37℃水浴20min，中途混勻1次。,(4)待血涂片自然涼干后，用瑞氏染液染

6、色。,瑞氏染色,瑞氏染液數(shù)滴覆蓋血涂片上 染色1min 再加等量的PH6.8 PBS與染液混合，染色10~15min 用蒸餾水沖洗（平持玻片，在一端加水，使染料“漂走” ） 自然干燥,,,,,顯微鏡油鏡原理,顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率 1.放大倍數(shù) 接物鏡放大倍數(shù)×接目鏡放大倍數(shù)

7、 2. 顯微鏡的分辨率 表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點之 間距離的能力，可用公式表示為： D=λ/2n·sin(α/2 )

8、 D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。 ?：可見光的波長（平均0.55?m) n: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。 ?：鏡口角（即入射角）。,,油鏡使用的原理

9、 1. 香柏油的折射率與玻璃接近，提高了視野的照明度。 2 . 提高了顯微鏡的分辨率,,顯微鏡油鏡的使用方法,1.用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔。 2.調(diào)節(jié)光亮度 3.低倍鏡觀察：粗調(diào)、細調(diào) 4.依次再進行中倍、高倍觀察

10、 5.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo) 本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細調(diào)至看 清物象為止。 6.換片：另換新片，必須從第三條開始操作。 7.用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的 油，然后再用擦鏡紙沾取少量

11、二甲苯擦去殘留的油，最后用 擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。,油鏡觀察,首先尋找中性粒細胞——觀察胞質(zhì)中有無吞噬的細菌。如染色正確，可見細胞核及被吞噬的細菌染成紫色，而中性粒細胞胞漿染成淡紅色。,計算吞噬百分率和吞噬指數(shù),(1)人類白細胞的吞噬活性在37℃時最好，溫度過高過低均會使其吞噬能力減低。,注意事項,(2)個體差異、年齡、健康狀況的不同，其吞噬能力亦不同。,(4)取“細菌－全血”涂片時，要混勻后再??；制作血涂片