人類(lèi)疾病動(dòng)物模型復(fù)制與評(píng)價(jià)

1、2024/2/11,1,第 3 講 人類(lèi)疾病動(dòng)物模型復(fù)制及評(píng)價(jià),Animal Models of Human Diseases,2,一、定義模型（Model）動(dòng)物模型（Animal models）人類(lèi)疾病動(dòng)物模型(Animal models of human diseases） 是指為生物醫(yī)學(xué)研究和闡明人類(lèi)疾病的病因、發(fā)病機(jī)理，建立預(yù)防、診斷和治療方法而制作的具有人類(lèi)疾病模擬表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。,第一節(jié) 動(dòng)

2、物模型概述,3,為什么要在動(dòng)物身上試驗(yàn)==在人身上試驗(yàn)的問(wèn)題受倫理學(xué)制約，許多實(shí)驗(yàn)不能直接在人體上進(jìn)行以人本身作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)推動(dòng)醫(yī)學(xué)發(fā)展是緩慢的臨床所積累的經(jīng)驗(yàn)在時(shí)間和空間上都存在著局限性,一個(gè)好的疾病動(dòng)物模型的建立可極大地促進(jìn)該疾病發(fā)病機(jī)理、診斷、預(yù)防及治療研究并開(kāi)發(fā)出相關(guān)新藥；而一種疑難病、烈性傳染病，因?yàn)闊o(wú)相應(yīng)的動(dòng)物模型，限制了該病的深入研究。,4,二、應(yīng)用疾病動(dòng)物模型的意義減少了在人身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)；縮短實(shí)驗(yàn)研

3、究周期；便于實(shí)驗(yàn)樣品的收集；便于研究結(jié)果分析；可提供稀缺疾病的材料；全面認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì),5,三、疾病動(dòng)物模型的制作原則（1）確定性：能通過(guò)各種觀察指標(biāo)得到明確診斷；（2）完整性：能顯示某種疾病從發(fā)病到轉(zhuǎn)歸的整個(gè)變化過(guò)程；（3）重復(fù)性：相近條件下，能夠復(fù)制和再現(xiàn)；（4）規(guī)范性：有基本同一的操作規(guī)程、技術(shù)參數(shù)與觀察指標(biāo)等；（5）實(shí)用性：對(duì)藥物療效和安全性評(píng)價(jià)、臨床診治工作有意義等；（6）易行性：常規(guī)動(dòng)物和試劑，

4、制作方法簡(jiǎn)便，儀器設(shè)備普及，價(jià)格適中。,6,動(dòng)物模型評(píng)價(jià)的注意點(diǎn)：動(dòng)物體畢竟不是人體的真實(shí)摹本，沒(méi)有一種動(dòng)物模型能完全復(fù)制人類(lèi)疾病的狀況。模型實(shí)驗(yàn)只是一種間接性研究。2.對(duì)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)應(yīng)是相對(duì)的，不可絕對(duì)外推的人身上，最終必須在人體上得到驗(yàn)證。,7,四、人類(lèi)疾病動(dòng)物模型的分類(lèi)（一）按制作方法的分類(lèi) 誘發(fā)性疾病動(dòng)物模型 突變系疾病動(dòng)物模型1.自發(fā)性疾病動(dòng)物2.人工致突變疾病動(dòng)物 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型,8,不同人類(lèi)

5、疾病動(dòng)物模型的比較,9,（二）按照各系統(tǒng)疾病分類(lèi) 可分為呼吸系統(tǒng)疾病動(dòng)物模型、消化系統(tǒng)疾病動(dòng)物模型……等。（三）按照疾病基本病理過(guò)程分類(lèi) 可分為發(fā)熱、炎癥、休克、電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡障礙、嘔吐、腹瀉動(dòng)物模型……等。（四）按照所用動(dòng)物進(jìn)行分類(lèi) 例如小鼠模型、大鼠模型等。 （五）中醫(yī)證候動(dòng)物模型的分類(lèi) 利用中醫(yī)獨(dú)特理論體系“辨證論治”，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上復(fù)制不同的臨床證候，以不同的證型表現(xiàn)出來(lái)，如氣虛證、血

6、虛證動(dòng)物模型等。,第二節(jié) 腫瘤動(dòng)物模型 1.自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型2.誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型3.移植性腫瘤動(dòng)物模型,1. 自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型 ◆ 指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未經(jīng)任何有意識(shí)的人工處置，在自然情況下發(fā)生的腫瘤所形成的模型。 ◆ C3H小鼠： 10月齡乳腺癌發(fā)病率為97% 14月齡雄性，肝癌自發(fā)率達(dá)84% ◆ AKR小鼠： 淋巴細(xì)胞性白血病發(fā)病率為70%～90%；

7、◆雌性F344大鼠： 乳腺腫瘤發(fā)病率為41%,◆ 注 意：1. 適合做實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物自發(fā)性腫瘤，應(yīng)選擇最接近于人類(lèi)的腫瘤。2. 缺點(diǎn)：自發(fā)性腫瘤發(fā)病遲，發(fā)病時(shí)期不集中，發(fā)病率也不一致。,2. 誘發(fā)性腫瘤（induced tumor）動(dòng)物模型◆ 是使用致癌因素在實(shí)驗(yàn)條件下誘發(fā)動(dòng)物發(fā)生腫瘤的模型?！?方法： 1）原位誘發(fā)：指將致癌物直接與動(dòng)物靶組織或靶器官接觸而誘發(fā)該組織或器官發(fā)生腫瘤，接觸方法可通過(guò)涂

8、抹、灌注、喂養(yǎng)或埋置等 。 2）異位誘發(fā)：將與致癌物接觸后的動(dòng)物組織或器官埋置于該動(dòng)物或另一正常動(dòng)物皮下而產(chǎn)生的該組織或器官的腫瘤。異位誘發(fā)腫瘤具有易于觀察和取材的優(yōu)點(diǎn)。,◆ 誘癌物： 放射線局部照射、化學(xué)致癌物（烷化劑、亞硝胺類(lèi)、芳香胺類(lèi)）、生物毒素（黃曲霉毒素）、細(xì)菌（幽門(mén)螺桿菌）感染等。,◆ 舉 例： （1）二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)小鼠肺癌： 采用小鼠皮下注射1％DEN水溶液，每周一次，(每次

9、劑量為56mg/kg，總劑量為868mg)。觀察時(shí)間為100d左右。此模型誘發(fā)率約40%。若將DEN總劑量增到1176mg時(shí)，半年誘發(fā)率可達(dá)90％以上。 （2）亞胺基偶氮甲苯(OAAT)誘發(fā)小鼠肝癌： 用l％OAAT苯溶液涂于動(dòng)物兩肩胛間皮膚上，隔日1次，每次2—3滴、一般涂100次。7個(gè)月以上誘發(fā)肝腫瘤約55％。 （3）黃曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌： 在大鼠飼料中加入黃曲霉素，含0.011-0.015ppm，喂養(yǎng)6個(gè)月，

10、誘發(fā)率達(dá)80％。,◆ 注 意：1.致瘤方法、動(dòng)物種系、致癌物種類(lèi)與溶劑、給藥劑量與途徑及觀察時(shí)間等盡量簡(jiǎn)便可行，有較好的重復(fù)性，并有利于與人腫瘤比較。2.方法和種系應(yīng)對(duì)所用致瘤物敏感。3.致癌物的劑量應(yīng)能保證動(dòng)物存活率較高、誘發(fā)期較短而又可誘發(fā)較高頻率的腫瘤。,3. 移植性腫瘤動(dòng)物模型 ◆ 指將動(dòng)物或人體腫瘤移植同種或異種動(dòng)物連續(xù)傳代而培養(yǎng)出的模型。 ◆ 方法 實(shí)體瘤移植：腫瘤細(xì)胞皮下接種——7-10d

11、處死荷瘤動(dòng)物——選擇生長(zhǎng)良好、無(wú)壞死液化的瘤組織——無(wú)菌套管針抽吸——接種同種受體動(dòng)物右前腋窩皮下。 腹水瘤移植：腫瘤細(xì)胞腹腔接種——7-10d處死荷瘤動(dòng)物——取腹水——腹腔注射（腹水瘤）或皮下注射（實(shí)體瘤）。,◆ 人體腫瘤的異種移植：,A: 移植于動(dòng)物缺乏免疫防御機(jī)能的特殊部位 雞胚、動(dòng)物眼前房、地鼠頰囊。B: 人工制造免疫缺陷動(dòng)物 切除新生動(dòng)物胸腺、脾臟、射線照射、免疫抑制劑。C: 移植于先天性免疫缺陷動(dòng)物

12、無(wú)胸腺裸鼠（nude）,◆ 國(guó)內(nèi)、外的科學(xué)家已經(jīng)建立起許多不同起源和不同特性的可移植性腫瘤細(xì)胞系或株。目前世界上大約保有近500種動(dòng)物移植瘤株，但常用的只有40種，且多數(shù)為小鼠腫瘤，其次是大鼠和倉(cāng)鼠移植瘤株。,http://cellbio.com.cn,http://www.bnbio.com/,◆常用的可移植性腫瘤細(xì)胞系（或株）：小鼠肉瘤S-180、肉瘤37（S-37）、小鼠淋巴細(xì)胞白血病L-1210、艾氏腹水瘤、小鼠網(wǎng)織細(xì)胞白血病6

13、15、Harding-Passey黑色素瘤、黑色素瘤B-16、小鼠肝癌H22、Lewis肺癌、小鼠乳腺癌（M5076）、大鼠Walker-256和吉田肉瘤等。,第三節(jié) 糖尿病動(dòng)物模型,一、Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型,二、Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型,一、Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型,(一)手術(shù)方法（胰腺切除法）1890年報(bào)道：切除狗胰腺，出現(xiàn)多尿，多飲，多食和嚴(yán)重的糖尿現(xiàn)象。一般選用較大的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如狗和家兔等，其次用大鼠。全切：無(wú)胰，需補(bǔ)充外源性胰酶

14、?？梢鸶哐牵⒖芍峦Y酸中毒和死亡一般主張切除75%~90%的胰。,(二)化學(xué)藥物特異性破壞胰島β細(xì)胞1.四氧嘧啶（alloxan） 產(chǎn)生超氧自由基而破壞β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素合成減少，胰島素缺乏。豚鼠具有抗藥性。血糖反應(yīng)3個(gè)時(shí)相：①早期血糖升高,持續(xù)約2ｈ②低血糖約6ｈ③ 12ｈ后開(kāi)始持久的高血糖,⑴小鼠：劑量——200mg/kg(ip) ,85-100 mg/ kg(iv)。 隨劑量的增加，小

15、鼠死亡率增高; 小鼠體重增加，死亡率亦增高; 靜脈注射成模率比腹腔注射高; 同等劑量分次給藥，死亡率、轉(zhuǎn)陰率均降低，成模率高。 最佳時(shí)間為禁食12--18ｈ后造模。 造模劑均需臨用前配。,成模標(biāo)準(zhǔn)：造模后第3天CBG值>16.7ｍmol/l。,⑵大鼠：影響因素：飼料成分、給藥次數(shù)、給藥劑量、動(dòng)物體重、個(gè)體差異等。靜脈給藥優(yōu)于腹腔給藥；兩步給藥法：劑量

16、為第1天120 mg/kg，第2天100 mg/kg。,⑶小型豬：5%四氧嘧啶200 mg/kg靜脈注射，出現(xiàn)高血糖，糖耐量減低，糖尿，低蛋白血癥，腎上腺皮質(zhì)損傷。,⑷家兔：雌性較雄性耐受，死亡少，130 mg/kg為適宜。,2. 鏈脲佐菌素(streptozotocin) 三個(gè)時(shí)相：①早期高血糖相，持續(xù)約1~2小時(shí)，乃此藥抑制胰島釋放所致；②低血糖相，持續(xù)約6~10小時(shí)，可能是由于胰島β細(xì)胞破壞，大量胰島素釋放，是血糖顯著降低

17、；③24小時(shí)后出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖相即糖尿病階段，此時(shí)大部分胰島β細(xì)胞已呈現(xiàn)不同程度的損傷和破壞。與四氧嘧啶糖尿病不同，高血糖反應(yīng)及酮癥均較緩和----死亡較少。,⑴小鼠：敏感性較差，需靜脈注射175~200mg/kg方可引起糖尿病。,⑵大鼠：速發(fā)型模型：Wistar大鼠， ip 60mg/kg STZ， 1次遲發(fā)型模型：Wistar大鼠，每周1次，連續(xù)3周，ip CFA （福氏完全佐劑）0. 5m1和STZ (25mg/k

18、g)，。,⑶豚鼠： ip STZ 200mg/kg，24h后每天定時(shí)SC.2U長(zhǎng)效胰島素，6周后血糖明顯提高，血清胰島素明顯減少。,(三)手術(shù)及藥物聯(lián)合制作糖尿病模型,(四)病毒誘導(dǎo)方法柯薩奇病毒可使新生的小鼠、田鼠等致病，對(duì)成年鼠不致病。選用DBA2雌性小鼠，皮下接種腦炎、心肌炎病毒Ｍ型變異株，4～7ｄ后出現(xiàn)明顯的高血糖，伴有血中及胰腺中胰島素含量降低。,(五)自發(fā)性Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型,1.NOD小鼠：是JCL -IC

19、R品系小鼠衍生的CTS(白內(nèi)障易感亞系)糖尿病小鼠近親雜交而來(lái)，其發(fā)病多突然，表現(xiàn)明顯多飲、多尿、消瘦，血糖顯著升高，不用胰島素治療，動(dòng)物存活不了一個(gè)月，通常死于酮血癥。高果糖飲食等可預(yù)防NOD小鼠糖尿病發(fā)作。NOD小鼠的糖尿病發(fā)病率與性別有關(guān)，雌性鼠發(fā)病率顯著高于雄性鼠且發(fā)病早。,2.BB糖尿病大鼠 ：是從Wistar大鼠中篩選出來(lái)的一種自發(fā)性、遺傳性糖尿病動(dòng)物模型。發(fā)作是突然的，大約在60～120日齡時(shí)發(fā)病，數(shù)天后，糖

20、尿病動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重的高血糖,低胰島素和酮血癥。免疫抑制劑、新生鼠胸腺切除等可預(yù)防糖尿病的發(fā)生。由于BB鼠能模擬人類(lèi)Ⅰ型糖尿病的自然發(fā)病、病程發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，且沒(méi)有外來(lái)因素的參與和干擾，是一種十分理想的Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型。,3.LEW.1NR1/ztm-iddm大鼠 是Lewis大鼠MHC單倍型自發(fā)突變株,自發(fā)性自身免疫Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型。58ｄ左右發(fā)病,發(fā)病率為20%,性別不影響發(fā)病率。特點(diǎn)是高血糖、糖尿、酮尿和多尿。,二、Ⅱ型糖尿

21、病動(dòng)物模型,(一)化學(xué)藥物損傷1.一次性大劑量STZ注射 小鼠STZ 65mg/kg體重,可致空腹血糖明顯上升 。2.多次小劑量STZ注射⑴金黃地鼠：連續(xù)腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素3天，劑量為40mg/kg，于注射后1、2、3、4、8周測(cè)動(dòng)物血糖、血脂，成模。⑵大鼠：用STZ處理的新生大鼠成年后將呈典型的Ⅱ型糖尿病表現(xiàn)。自發(fā)性高血壓鼠(SHR)在新生期予以STZ處理，成年可獲得Ⅱ型糖尿病合并原發(fā)性高血壓模型。,(二)STZ

22、加膳食誘導(dǎo)的模型 少量STZ, 同時(shí)飼以高脂肪飼料, 誘導(dǎo)出接近人類(lèi)Ⅱ型糖尿病的動(dòng)物模型。1.小鼠 ：高脂肪飼料喂養(yǎng)Ｃ57BL/6Ｊ雄性斷乳小鼠3周，ip STZ，繼續(xù)喂養(yǎng)4周成模。2.大鼠： 雌性Wistar大鼠喂以高糖高脂飼料(其中含10%蔗糖,10%豬油,5%膽固醇)一個(gè)月，誘發(fā)出胰島素抵抗，繼以低劑量鏈菌素(STZ，25 mg/kg，ip) 2次，每周1次，誘發(fā)胰島素代償性分泌障礙，使之產(chǎn)生高血糖癥，是Ⅱ型糖尿病

23、血管并發(fā)癥的理想模型。高脂高糖飼料（蛋白質(zhì)5%、碳水化合物60%其中蔗糖為30%、脂肪32%其中煉豬油為30%）高脂飼料（在10kｇ標(biāo)準(zhǔn)飼料中加入150ｇ食鹽、50ｇ白糖、2000ｇ豬油、400ｇ麻油、2000ｇ花生、雞蛋900ｇ,碳水化合物48%,脂肪22%,蛋白質(zhì)20%。）,(三)特殊膳食誘導(dǎo)1.大鼠： Wistar大鼠飲用12%的果糖水，連續(xù)六個(gè)月，形成了明顯的胰島素抵抗，因此認(rèn)為該模型是糖尿病實(shí)驗(yàn)研究的一種適用動(dòng)

24、物模型。2.家兔： 家兔飼以高糖、高脂誘發(fā)糖尿病飼料(10%豬油、37%白蔗糖混合53%基礎(chǔ)飼料)單籠飼養(yǎng),每只動(dòng)物每天約喂食100ｇ飼料,自由飲水，室溫18～25℃,實(shí)驗(yàn)期為32周。3.小型豬： 3～4月齡,體重6.02±1.29kg/頭的貴州小型豬，雌、雄各半，飼以高脂高糖飼料(10%豬油、37%蔗糖、混合53%基礎(chǔ)飼料)，單欄飼養(yǎng),每頭動(dòng)物每天按體重的2.5%喂食飼料,自由飲水,室溫18～25℃,實(shí)驗(yàn)期為

25、6個(gè)月。成模。,(五)自發(fā)性Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型1.KK小鼠 輕度肥胖型Ⅱ型糖尿病動(dòng)物，從5周齡起,血糖、血循環(huán)中的胰島素水平以及HbA1ｃ水平逐步升高。脂肪組織的胰島素敏感性降低，且到16周齡時(shí)完全喪失。腎臟病變發(fā)生早,發(fā)展迅速,腎小球基底膜增厚。2.ob/ob小鼠Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型，屬常染色體隱性遺傳。純合體動(dòng)物表現(xiàn)為肥胖,高血糖及高胰島素血癥。3. db/db小鼠屬Ⅱ型糖尿病模型。動(dòng)物在一個(gè)月時(shí)開(kāi)始貪食及發(fā)胖,繼而產(chǎn)

26、生高血糖、高血胰島素,胰高血糖素也升高。一般在10個(gè)月內(nèi)死亡。,4.NSY小鼠近交系自發(fā)性糖尿病模型，與人的NIDDM發(fā)病機(jī)理相似。5. Zucker fa/fa大鼠 是典型的高胰島素血癥肥胖模型。6.黑線倉(cāng)鼠 俗稱中國(guó)地鼠(Chinesehamster),原為我國(guó)黃河以北一些省份的優(yōu)勢(shì)鼠種。這種動(dòng)物模型為非肥胖型,以中輕度高血糖為特征,血清胰島素表現(xiàn)多樣，胰島病變程度不一，類(lèi)似于人類(lèi)的Ⅱ型糖尿病。7.GK大鼠GK大鼠

27、也是一種自發(fā)的Ⅱ型糖尿病鼠種8.嗜沙肥鼠,三、檢測(cè)指標(biāo)(一)一般性指標(biāo) 糖尿病時(shí)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物攝食量、飲水量增加和血清葡萄糖、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、糖化血紅蛋白、乳酸分泌增高,而血清胰島素、紅細(xì)胞胰島素受體最大親和力、糖耐量降低。測(cè)定上述指標(biāo)可反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否產(chǎn)生高血糖或患糖尿病。(二)其他生化和免疫學(xué)指標(biāo)可應(yīng)用ELISA測(cè)定TNF-α、INF-γ、IL-４等細(xì)胞因子和免疫球蛋白IgE（反映細(xì)胞凋亡情況）;還可

28、測(cè)定內(nèi)皮素（ET）和NO（反映氧自由基產(chǎn)生情況）、Ang-Ⅱ和（AT-１）mRNA（反映血管變化及間接反映氧自由基產(chǎn)生情況）、IGF-１即胰島素樣生長(zhǎng)因子-１和瘦素（了解胰島素的分泌,間接反映氧自由基情況）、AGEｓ即糖基化產(chǎn)物（反映體內(nèi)氧化應(yīng)激和糖基化反應(yīng)情況）、PAH即苯丙氨酸羥化酶（反映糖異生的快慢）、GAD即谷氨酸脫羧酶抗體（該抗體陽(yáng)性,表明細(xì)胞自身免疫性破壞）、胰島素抗體（抗體陽(yáng)性,說(shuō)明胰島素分泌不足）、Ｃ肽（反映胰島β細(xì)胞的

29、功能）等。,三、檢測(cè)指標(biāo)](三)病理切片及形態(tài)學(xué)檢查 STZ型糖尿病可見(jiàn)胰腺外分泌大量灶狀或散在的單核細(xì)胞,胰島細(xì)胞空泡變性,使胰島呈空虛狀態(tài),胰島毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、胰島細(xì)胞減少。而Alloxan型糖尿病則見(jiàn)部分胰島形狀不規(guī)則,邊緣不整齊,胰島β細(xì)胞排列紊亂,個(gè)別胰島只剩下幾個(gè)細(xì)胞環(huán)繞在胰島周邊部分,亦可見(jiàn)不規(guī)則花環(huán)狀等各種形態(tài),有的胰島內(nèi)β細(xì)胞所剩無(wú)幾,幾乎成為空泡狀,僅能辨認(rèn)其輪廊。自發(fā)性糖尿病模型病理切片主要觀察胰島淋巴細(xì)