精子形態(tài)學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)化2016

1、精子形態(tài)學(xué)分析的標(biāo)準(zhǔn)化,生殖健康,一、精子的基本形態(tài),精子主要由三部分組成 頭部 頸部和中段 尾部,1. 精子的正常形態(tài),頭部：扁橢圓形，長4~5μm、寬 2.5~3.5μm、厚約1.0μm。 中段：細(xì)，寬度＜1μm，大約為頭部 長度的1.5倍；胞漿小滴＜正常 頭部大小的1/2。 尾部：長約45μm，比中段細(xì)，均

2、 一、非卷曲。,精子頭部超微結(jié)構(gòu),1.核 2.頂體 3.細(xì)胞膜 4.核囊 5.核膜孔 6.頸部 7.基底板 8.橫紋小柱 9.中心子（近端） 10.中心子（遠(yuǎn)端） 11.外纖維 12.鞭毛軸絲 13.線粒體,精子超微結(jié)構(gòu),A 精子的整體形態(tài)：1.頭部頂體， 2.頸部，3.中部，4.尾部B 中部與尾部的聯(lián)結(jié)部位：5.中部斷

3、 面線粒體，6.纖維鞘，7.九根外纖 維，8.九根周圍小管，9.組中心小 管，10.細(xì)胞膜C B的斷面：11.縱向支柱D 尾部近遠(yuǎn)端E 終端主節(jié)與終節(jié)相連部F 終節(jié)：12.微細(xì)管,精子頸部和中段超微結(jié)構(gòu),B 頸部（局部）： 1.線粒體，2.外纖維，3.細(xì)胞膜 4.中心子（近位） 5.中心子（遠(yuǎn)位），6.外纖維 7.橫

4、紋小柱，8.關(guān)節(jié)樣小頭 9.關(guān)節(jié)樣小頭頂，10.軸絲C 中部斷面： 1.線粒體 2.外纖維,2.異常精子形態(tài),頭部缺陷 錐形、梨形、圓形 無定形、頭部有空泡 小頂體,頭部缺陷的異常精子,頂體過小,頂體過大,頭部一側(cè)呈橢圓形的弧形,頸部和中段缺陷 頸部彎曲 中段非對稱性插入 中段過粗 中段過細(xì) 胞漿小滴,2.異常精子形態(tài),頸部過粗,頸部和

5、中段缺陷的異常精子,中段和頭部 分離,尾部連接處 扁平,尾部缺陷 短尾 折尾 尾部彎曲,2.異常精子形態(tài),二、精子形態(tài)與功能,1. 頭部主要的結(jié)構(gòu): 細(xì)胞核和頂體 細(xì)胞核: 父方的遺傳物質(zhì)、單倍體，雙鏈 DNA，與魚精蛋白緊密結(jié)合。 頂體:覆蓋精子核前2/3的扁囊狀結(jié)構(gòu) 含有多種與卵子的識別和受精相關(guān)

6、 的酶 其中最重要的是頂體蛋白酶和透明 質(zhì)酸酶,2. 頸部和中段 連接頭部和尾部 中段的線粒體鞘含有大量的線粒體 為精子的運(yùn)動提供能量 9+2結(jié)構(gòu),二、精子形態(tài)與功能,3. 尾部 運(yùn)動,二、精子形態(tài)與功能,三、精子形態(tài)分析常用方法,用于精子形態(tài)學(xué)分析的染色方法有： 改良巴氏染色法、蘇木精-伊紅

7、（HE）染色法、 瑞氏染色法、瑞-吉氏染色法、Diff-Quik染色法和 Shorr染色法。 6種染色方法對精子頭大小的影響不同，瑞-吉氏和瑞 氏染色法的精子頭的長軸和短軸最高，其次為Diff- Quik染色法，巴氏染色法的精子頭的長軸和短軸最 低，而HE和Shorr染色法的精子

8、頭長軸和短軸介于巴 氏染色法和Diff-Quik染色法之間。,6種精子染色方法的染色效果亦不同: Diff-Quik和Shorr染色法可以很清楚地區(qū)分頂體和核 其次為HE染色法， 而巴氏、瑞氏和瑞-吉氏染色的精子頂體和核分界不 很明顯。 基于不同染色方法對精子頭大小的影響、染色

9、效果以 及操作的簡易與否，推薦Diff-Quik和Shorr染色法。,三、精子形態(tài)分析常用方法,精子形態(tài)分析的標(biāo)準(zhǔn)有： WHO標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)；分析方法： 人工法 計算機(jī)自動分析,三、精子形態(tài)分析常用方法,1． 涂片的制備 一般用新鮮的液化精液或生理鹽水洗滌過的精子懸液進(jìn)行涂片， 通常每份標(biāo)本涂雙份片子，以備染色或操作出

10、問題。載玻片應(yīng)潔 凈，可用70%酒精洗滌并干燥后使用；涂片的厚薄應(yīng)根據(jù)精子密 度而定，精子密度高者涂片應(yīng)薄些，而精子密度低者涂片應(yīng)盡可 能厚些。 方法 涂片的方法有多種，WHO推薦的方法有拉薄技術(shù)和滴管法，拉 薄技術(shù)即用另一張載玻片的邊緣拖拉載玻片上的一滴精液；滴管

11、 法即水平持滴管使一滴精液沿載玻片的表面展開。由于精液有一 定粘稠度，這兩種方法都很難涂成均勻的涂片，可作為可選擇性 方法使用。,三、精子形態(tài)分析常用方法,推薦涂片方法 推薦精子涂片方法 (改良滴管法)：用滴管將一滴精液置于載玻 片上，然后從液滴中央向周圍循環(huán)吸凈多余的精液，注意滴管

12、 的頭要平整，滴管與載玻片垂直，緩慢吸去多余的液體。 低密度、粘稠的、或充滿碎屑的標(biāo)本，建議先離心去除精漿， 沉淀的精子團(tuán)重新懸浮在適當(dāng)體積中，以獲得盡可能高的密 度，但不應(yīng)超過80×106/ml。正常精子密度且液化良好的精液 標(biāo)本亦可以洗滌后用精子懸液進(jìn)行涂片，

13、但離心操作對精子形 態(tài)分析有無影響，尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。 精子涂片可進(jìn)行空氣干燥并固定。固定程序取決于染色方法。,三、精子形態(tài)分析常用方法,2．Shorr染色法（WHO推薦） 精子涂片空氣干燥后，用蘇木精染色1~2分鐘；流水浸洗后置 42℃溫水中藍(lán)化5分鐘（或浸入乙醇銨中藍(lán)化）；Shorr染劑 （BDH Sh

14、orr粉4 g溶于220 ml 50%溫乙醇中，冷卻，加入2.0 ml 冰醋酸，過濾即可）染3~5分鐘；流水沖洗，晾干后鏡檢。 3．Diff-Quik染色法（WHO、SCA分析系統(tǒng)推薦） 精子涂片先置于固定液（1.8 mg二芳基甲烷加至1 L甲醇中而 成）中固定15秒；將玻片直立于吸水紙上以去除多余的液體；將 玻片在溶液1（1 g氧甲蒽

15、加至1 L疊氮鈉防腐液中）中染色10秒 鐘，然后在溶液2（0.625 g天藍(lán)A和0.625 g亞甲基藍(lán)加至1 L緩沖 液中）中染色5秒鐘，各步驟之間均除去多余的液體；在流水中 浸洗10~15次以除去多余的染料；將玻片垂直豎立以去除水分， 使之完全干燥；油鏡下觀察。,三、精子形態(tài)分析常用方法,4．改良巴氏染色(WHO推薦) (1) EA

16、-50的配制 將伊紅Y、俾士麥棕、亮綠SF染劑分別配成 100g/L的水溶液，作儲備液；將上列儲備液伊紅Y 5ml，俾士 麥棕1ml，亮綠1.25ml混勻，用95%乙醇加至200ml。然后加 入0.4g磷鎢酸和0.1ml飽和碳酸鋰溶液，混勻后放入棕黑色瓶 中，于室溫可保存3個月左右。使用前必須

17、過濾。 (2) 橙黃G6的配制 稱橙黃G6 0.5g，溶于5ml蒸餾水，待溶解后加 95%乙醇至100ml，然后加磷鎢酸15mg，混勻后置棕黑色瓶 中，用前必須過濾。室溫下此液可保存3個月。,三、精子形態(tài)分析常用方法,4．改良巴氏染色(WHO推薦) (3) 哈里斯(Harris)蘇木精的配制 稱硫酸鋁銨20g，溶于20

18、0ml蒸 餾水；稱蘇木精1g，溶于10ml 95%乙醇中。將蘇木精溶液加 入硫酸鋁銨溶液中，混勻并加熱至95℃。然后慢慢加入氧化 汞0.8g。攪拌使其溶解，此時溶液呈深紫色。冷卻后過濾，使 用前以等量蒸餾水稀釋，并再一次過濾。 (4) 酸性乙醇溶液的配制 無水乙醇30ml，加濃鹽酸0.2m和蒸餾

19、水 10ml混勻。 (5) 固定液的配制 無水乙醇：乙醚為1:1。,三、精子形態(tài)分析常用方法,4．改良巴氏染色(WHO推薦) (6)操作方法 ①將洗滌后的精子懸液涂片，在空氣中自然干燥，然 后用固定液固定6~10分鐘㈩② 將已固定的涂片依次浸入80%， 70%，50%乙醇內(nèi)30秒，最后置于蒸餾水中1分鐘；

20、③在蘇木素 染液中染10分鐘，取出流水洗5分鐘，然后浸入酸性乙醇1分 鐘，流水洗5~10分鐘；④涂片依次浸入50%，70%，80%， 95%乙醇內(nèi)各30秒㈩⑤在橙黃G6染液中染3~5分鐘，在95%乙 醇中浸洗1分鐘；⑥在EA-50染液中染15~20分鐘，于95%乙醇 中浸洗30秒，再依次

21、浸入3缸二甲苯中使其透明，每缸約1~2分 鐘㈩⑦用光學(xué)樹脂加蓋片封固，油鏡下觀察。,三、精子形態(tài)分析常用方法,5．蘇木紫－伊紅染色法(HE) (1) 蘇木紫染液的配制 實(shí)驗(yàn)室常用的是哈里斯(Harris)蘇木紫 液。甲液：蘇木紫1g，無水乙醇10ml；乙液：硫酸鋁鉀 20g，蒸餾水20ml，加溫溶解。甲、乙

22、兩液分別溶解后混 合，加熱煮沸，沸后去火，待溶液不翻騰時立即加入氧化 汞0.5g(此時有大量氣泡生成，故容器宜大，以免液體溢 出)。然后使染液迅速冷卻，冷卻后過濾即可應(yīng)用。用時 每10ml加冰醋酸4ml。 (2) 伊紅Y液配制 伊紅Y 1g，蒸餾水5ml，溶

23、解后將冰醋酸滴于 其中，有沉淀生成，至成漿糊狀再加水?dāng)?shù)毫升，并繼續(xù)滴冰 醋酸，直至沉淀不再增加，過濾，棄濾液留沉淀物，特其干 燥后，溶于95%乙醇200ml中即成。,三、精子形態(tài)分析常用方法,5．蘇木紫－伊紅染色法(HE) (3)固定液配制　9５％乙醇：乙醚為1:1。 (4)操作方法 ① 涂片

24、置固定液中固定15分鐘；②已固定的涂片流 水洗2分鐘，蒸餾水洗1分鐘；③蘇木紫液染色約5分鐘(視著色 情況增減)；④水洗，1%鹽酸分色，顯微鏡下控制；⑤流水浸 洗至少15分鐘，至細(xì)胞核呈藍(lán)色；也可短時水洗后，浸于40℃ 溫水使核變藍(lán)。在顯微鏡下觀察，若核染色過深或不足，應(yīng)再 次分色或重染；⑥伊紅Y液染1~2分鐘后，9

25、5%乙醇浸洗2次， 無水乙醇浸洗2次，每次約1~2分鐘 ；⑦苯酚 :二甲苯(1:3) 浸 洗5分鐘；⑧ 二甲苯2次，每次浸洗3~5分鐘；⑨用中性樹膠封 片，顯微鏡下觀察。,三、精子形態(tài)分析常用方法,6．瑞-姬氏混合染色法 (1) 瑞氏染液 稱取瑞氏染料0.1g，放在清潔干燥乳缽里，加少 量甲醇，邊加邊磨使

26、染料溶解。將已溶解的染料倒入棕色瓶 中，加甲醇至60ml，置室溫下1周即可使用。 (2) 姬姆薩染液 稱取姬母薩染料0.5g，置于33ml甘油中，60℃ 水浴2h，使其溶解，再加入60℃預(yù)熱的甲醇33ml，混合后 置棕色瓶內(nèi)，室溫下放置數(shù)日后方能使用。 (3) 操作方法: 取液

27、化的精液離心(１000r/min)10分鐘，棄上清 液，留取沉淀再加生理鹽水，相同上述操作，洗滌3次，配 制成10×106/ml濃度的精子懸液，涂片自然干燥。用瑞-姬 氏混合液(10:1)染30~60秒，加等量pH6.9磷酸鹽緩沖液， 染色10分鐘，自來水沖洗，待自然干燥后，用光學(xué)樹

28、脂封 片，置油鏡下鏡檢。,三、精子形態(tài)分析常用方法,四、精子形態(tài)分析與臨床,精子形態(tài)是迄今為止和受精率最相關(guān)的 指標(biāo)，并且操作簡單，費(fèi)用少。不少研 究機(jī)構(gòu)的研究結(jié)果表明，采用嚴(yán)格精子 形態(tài)分析能較好地預(yù)測受精結(jié)果。一般 將正常形態(tài)精子的正常值定為15%，正 常形態(tài)精子＞15%的精子，體外受精率

29、 在80%以上；而正常精子低于5%的， 其IVF受精率＜30%。,精索靜脈曲張患者頭部缺陷、含胞漿小 滴精子的比例比正常者顯著升高，并隨 精索靜脈曲張程度的增加而升高。 少、弱精子癥患者精子形態(tài)異常的比例 顯著增加，異常精子中以頭部缺陷為 主。,四、精子形態(tài)分析與臨床,解脲支原體等感染的精液，異常精子率

30、 顯著增加。,四、精子形態(tài)分析與臨床,長期接觸農(nóng)藥或服用綿籽油，可引起以 小頭精子、頸部缺陷精子為主的異常形 態(tài)精子的比例升高。,四、精子形態(tài)分析與臨床,吸煙和大量飲酒是產(chǎn)生異常形態(tài)精子 增加的重要因素，異常精子以頭部異常 為主。,四、精子形態(tài)分析與臨床,雷達(dá)輻射可造成雙頭精子、大頭精子、 無定形精子、頸部和中段異常精子顯著

31、 升高。,四、精子形態(tài)分析與臨床,在去除感染、輻射、農(nóng)藥中毒、不良生 活習(xí)慣（吸煙等）的因素后，正常形態(tài) 精子的比例迅速增加。精子形態(tài)分析是 提供男性不育癥預(yù)后的重要指標(biāo)。,四、精子形態(tài)分析與臨床,一些中藥、微量元素（鋅等）、抗氧化 劑等能有效提高正常精子的比例。,四、精子形態(tài)分析與臨床,現(xiàn)有資料表明：精子形態(tài)是與男性 生殖能力最相關(guān)的精

32、液參數(shù)之一。 精子形態(tài)分析方法簡單、實(shí)用性 強(qiáng)，臨床醫(yī)生應(yīng)高度重視。 精子形態(tài)分析的標(biāo)準(zhǔn)化亟待完善和 推廣。,四、精子形態(tài)分析與臨床,,九十年代實(shí)驗(yàn)室檢查精液大多采用人工方法,但較八十年代比較,由于不少單位使用了MACRO精子計數(shù)板而提高了準(zhǔn)確性。近十年來電腦技術(shù)的運(yùn)用使精子速疫和軌跡成為精液分析的重要參數(shù)。精子形態(tài)檢查成為重要的男性不育癥的分析指標(biāo),儀器設(shè)備的更新勢在