樣本的采集分析

1、1,樣 本 的 采 集,一、樣本的來(lái)源和種類(lèi) 樣本是供檢出目的微生物或其相關(guān)物質(zhì)的材料。所謂相關(guān)物質(zhì)是指構(gòu)成目的微生物的核酸脂多糖，蛋白質(zhì)以及微生物的相應(yīng)特異性抗體。從預(yù)防醫(yī)學(xué)微生物的角度可將微生物分為衛(wèi)生指標(biāo)微生物和病原微生物二大類(lèi)。,2,（一）檢出衛(wèi)生指標(biāo)微生物的樣本來(lái)源和種類(lèi) 衛(wèi)生指標(biāo)微生物是指示外環(huán)境和食品以及日用品潔凈度的微生物可以是單位容積或重量中所含微生物的總數(shù)或是以某種代表微生物，它是指示受病原微生物污染

2、情況，如大腸埃希氏菌，糞鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等，樣本的來(lái)源是空氣、水、食品、藥品、化妝品及醫(yī)院環(huán)境等。,3,1. 水樣本的采集及處理 ①采樣的容器水樣瓶采集前必須進(jìn)行滅菌并保證在運(yùn)送保存過(guò)程中不受污染。 ②在采集自來(lái)水樣時(shí)，先用酒精燈將水龍頭燒灼消毒、然后將龍頭打開(kāi)，放水5~10分，再采集水樣。 ③取外環(huán)境水樣時(shí)，應(yīng)選擇有代表性的水源，一般應(yīng)距水面10~15cm深處取樣。,4,④采集有余氯的水樣時(shí)，應(yīng)按每500m

3、l水樣加入1.5%硫代硫酸鈉2ml，中和水樣中的余氯。 ⑤采水量為瓶容量的80%，以便在檢驗(yàn)時(shí)充分震搖水樣。 ⑥水樣作大腸菌群檢測(cè)時(shí)，取水量為350ml。,5,⑦水中病毒檢測(cè)樣本的采集（1）水中病毒數(shù)>103/L可直接將水樣接種細(xì)胞無(wú)需濃縮，病毒數(shù)>102/L樣本量為1~5L，=10/L，樣本量為10~20L，<1/100L樣本量是500~1000L，（2）每次采2份樣本，一份及時(shí)檢測(cè)，一份低溫保存?zhèn)溆?/p>

4、。（3）如為間斷污染，采水樣時(shí)同時(shí)還應(yīng)考慮采集水體底泥及水生生物，特別是貝類(lèi)樣本，因底泥及貝類(lèi)中病毒可長(zhǎng)期存在，并且濃度較高。,6,⑧水中病毒檢驗(yàn)樣本濃縮處理原則： a. 有較高的和穩(wěn)定的病毒回收率 b. 不受水質(zhì)限制，特別是濁度的限制 c. 不受容量限制，可以處理大樣本量 d. 操作過(guò)程盡可能快，以免損傷病毒 e. 濃集應(yīng)有選擇性，盡可能不濃集病毒以外的物質(zhì) f. 操作方法盡可能簡(jiǎn)單、容易

5、、并且價(jià)廉,7,2. 食品中細(xì)菌檢測(cè)的樣本采集 食品采集是指在食品原料或成品中抽取具有代表性的樣品，并保證這些具有代表性的樣本在檢驗(yàn)時(shí)能完全反映原來(lái)的樣本狀態(tài)（在采集與運(yùn)輸過(guò)程中排除外界各種干擾），使最終檢測(cè)結(jié)果真實(shí)地反映食品本來(lái)的衛(wèi)生狀況，因此在作食品細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中，采樣必須注意以下問(wèn)題：,8,①平均樣品：糧按三層（表、中、下）五點(diǎn)采樣法，油抽取表層與底層油、混樣檢測(cè)。 ②正常樣品與異常樣品，除采正常樣品外，如發(fā)現(xiàn)有異常

6、樣本時(shí)，也應(yīng)采樣分別進(jìn)行檢測(cè)。,9,③采樣數(shù)量：一般采集中樣，即從食品的各部分取得的混合樣品以200克為準(zhǔn)。有些樣品可達(dá)500克。如糧食可分三層五點(diǎn)，或分層隨機(jī)采取不同點(diǎn)的樣品充分混合后取500克送檢。檢樣也稱(chēng)小樣以25克為準(zhǔn)。 ④避免外源性污染，各種采樣器、樣品容器都需嚴(yán)格滅菌，盡可能從未開(kāi)啟的樣品中采樣。盡量選樣清潔的空間地點(diǎn)，以無(wú)菌操作的方式，開(kāi)啟包裝，采集樣品裝入滅菌容器內(nèi)并將容器密封。,10,⑤防止樣品中細(xì)菌的菌量及菌

7、相的變化，為了防止樣本中細(xì)菌的變化，必須嚴(yán)格控制溫度，從采樣到檢驗(yàn)室時(shí)間不得超過(guò)了3小時(shí)，最適溫度為0℃~4℃，如為冷凍樣品則仍需保持在冷凍狀態(tài)。 ⑥要有明確的標(biāo)簽：樣品必須立即貼上標(biāo)簽，表明品名、來(lái)源、數(shù)量、采樣地點(diǎn)采樣人及采樣年月日地點(diǎn)，必要時(shí)注明采樣溫度、濕度及現(xiàn)場(chǎng)衛(wèi)生狀況，是否無(wú)菌操作。,11,⑦國(guó)際食品微生物專(zhuān)門(mén)委員會(huì)（ICMSF）提出食品采樣進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)從統(tǒng)計(jì)學(xué)原理為基礎(chǔ)，來(lái)考慮對(duì)一批食品應(yīng)檢測(cè)多少樣本，才能具有代表

8、性？目前一般使用的方法是每批樣品中只采一個(gè)檢樣進(jìn)行檢驗(yàn)，該批食品是否合格全由一個(gè)樣品的結(jié)果來(lái)決定。,12,目前世界糧農(nóng)組織已采用ICMSF提出的建議作為規(guī)定，其中食品中大腸菌群數(shù)的檢驗(yàn)為一批食品中應(yīng)采5個(gè)樣進(jìn)行檢驗(yàn)，而沙門(mén)菌則要采10個(gè)樣來(lái)綜合判斷其衛(wèi)生狀況，現(xiàn)已有加拿大、以色列等國(guó)采用此法，作為該國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。,13,世界糧農(nóng)組織規(guī)定的各種食品微生物的限量標(biāo)準(zhǔn),14,（二）病原微生物樣本的采集 1. 血液樣本的采集 （

9、1）血液樣本中可能有的細(xì)菌金色葡萄球菌、鏈球菌、產(chǎn)單核李斯特菌、炭疽桿菌，腦膜炎奈瑟菌、傷塞及副傷塞沙門(mén)菌，綠膿桿菌，氣單胞菌，鼠疫耶爾森菌、布魯菌、鉤端螺旋體等。,15,（2）樣本采集及應(yīng)注意事項(xiàng) ① 采血時(shí)期及次數(shù)，對(duì)血液標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)是否能檢出病原菌的影響較大。一般情況下，多在病人發(fā)熱初期或發(fā)熱高峰時(shí)采集。原則上應(yīng)選擇在抗菌藥物應(yīng)用之前，對(duì)已用藥而不能中止的病人，也應(yīng)在下次用藥之前采集。于用藥前24小時(shí)內(nèi)，如采集3~4次

10、血液標(biāo)本，其檢出率可達(dá)90%以上。,16,為了獲得正確而檢出率高的效果，最好同時(shí)采集動(dòng)脈血和靜脈血，或由左右兩側(cè)肘靜脈同時(shí)采集。因?yàn)椴杉课徊煌?，其血液中的菌?shù)?？刹煌?；同時(shí)雙部位的標(biāo)本培養(yǎng)對(duì)于檢出菌是病原菌，或?yàn)槲廴揪呐卸ㄓ兴鶐椭?。此外，在感染病灶局部附近的血管采集?biāo)本，也能提高檢出率。,17,② 采血部位，一般多由肘靜脈采集。采血量一般以培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基量的1/10為宜，如此可使存在于血液中的補(bǔ)體、抗體、調(diào)理素及溶菌酶等增殖抑制因子

11、被稀釋?zhuān)怪疁p弱或失去抑制作用。對(duì)于應(yīng)用抗菌藥物中的病人血液，以培養(yǎng)基量的1/20為宜。成人一次采血為5~10ml，嬰幼兒為1~2ml。,18,采血部位的局部皮膚應(yīng)徹底消毒，通常先用碘酒棉涂布消毒，干后消毒酒精（70%）揩拭。操作時(shí)，應(yīng)以穿刺部位為中心逐漸向外延伸消毒。,19,③血液標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，一般不用抗凝劑，因?yàn)榉c、EDTA，枸櫞酸鈉可對(duì)細(xì)菌不利。近年來(lái)，認(rèn)為在培養(yǎng)基中加入0.03~0.05%聚茴香腦碘酸鈉（sodium p

12、olyanethol sulfonate，SPS）效果較好，具有抑制血清中殺菌物質(zhì)的作用，并且對(duì)氨基糖苷類(lèi)及多肽類(lèi)抗生素有滅活效果，有利于細(xì)菌的檢出。肝素抗凝尚未見(jiàn)對(duì)細(xì)菌有所影響。,20,通常無(wú)菌采集血液后立即注入裝有液體培養(yǎng)瓶。所用的培養(yǎng)基隨檢驗(yàn)?zāi)康暮土?xí)慣不同。目前主張，對(duì)病人已用過(guò)抗生素或碘胺類(lèi)藥物時(shí)，培養(yǎng)基每100ml中加對(duì)氨基苯甲酸5mg以對(duì)抗磺胺類(lèi)藥的作用，加入青霉素酶200單位以對(duì)抗青霉素的作用。若病人已用其他抗生素治療，常

13、用加入硫酸鎂的培養(yǎng)基，以中和鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、新霉素及多粘菌素等抗菌藥物。,21,2. 糞便樣本的采集 （1）糞便中可能發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌 葡萄球菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、結(jié)核分技桿菌、傷寒、副傷寒及其他沙門(mén)菌、志賀菌、變形桿菌、綠膿桿菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、假絲酵母菌等。 （2）樣本的采集,22,【操作】 ①選取有膿血、粘液部分的糞便2～3g，液體糞便則取絮狀物，盛于滅菌的廣口瓶或蠟紙盒中，

14、及時(shí)送檢和接種,23,②在無(wú)法獲得糞便的情況下，可用經(jīng)無(wú)菌生理鹽水（或保存液）或增菌用濕潤(rùn)的直腸拭子插入肛門(mén)4～5cm深處（小兒2～3cm），輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)一圈，擦取直腸表面的粘液后取出，盛入無(wú)菌試管或保存液中送檢。,24,糞便標(biāo)本的采集應(yīng)注意下述問(wèn)題： ① 糞便標(biāo)本應(yīng)盡量在病程早期和治療前采集。疾病急性期致病菌往往占優(yōu)勢(shì)，以后數(shù)日即迅速減少；一般認(rèn)為，服用抗菌藥物3d，標(biāo)本中病原菌即轉(zhuǎn)陰性。,25,②應(yīng)采集新排出的新鮮糞便。若無(wú)法獲

15、得時(shí)，可作采便管或直腸拭子采集。采集時(shí)要注意先取有膿血、粘液、上皮碎片等病理成分。一般固體標(biāo)本采2～3g，液體標(biāo)本采1～3ml盛于小盒或試管中及時(shí)送檢。,26,③標(biāo)本采集后需立即送檢，拖延送檢可致病原菌數(shù)目迅速減少或雜菌過(guò)度生長(zhǎng)，影響病菌的檢出率，不能及時(shí)送檢時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本置于保存液或運(yùn)送培養(yǎng)基中送檢。,27,（三）病毒樣本的采集 1. 流行性感冒病毒樣本 采集和處理 采集時(shí)間應(yīng)在病人發(fā)病后頭3d，越早越好，雖然有的發(fā)病

16、后7d采集的標(biāo)本還能分離到病毒，但隨時(shí)間延長(zhǎng)分離率大大地下降。較好的標(biāo)本為鼻腔洗液，但病人不易接受，尤其小孩不易協(xié)作，故常用咽喉和鼻拭子或咽喉漱液即用滅菌的棉拭子涂擦患者的咽部，,28,有時(shí)用另一根棉拭子涂擦患者的鼻腔，然后將棉拭子浸入5ml滅菌的pH7.2的肉湯或Hank液或生理鹽水中，有時(shí)可讓成人患者先咳嗽幾聲，而后用10ml漱液反復(fù)含嗽咽部約1min再吐入管中。從疑似流感死亡的病例中取樣時(shí)，應(yīng)取肺，氣管粘膜和血。采集的標(biāo)本應(yīng)馬上放

17、冰壺中，以冷的狀態(tài)送到實(shí)驗(yàn)室越快越好，如48h內(nèi)未能進(jìn)行接種，標(biāo)本應(yīng)放低溫（最好-70℃）以下進(jìn)行保存。鼻腔或咽部洗液送到實(shí)驗(yàn)室后，,29,用手將裝標(biāo)本的管充分振蕩，將粘液打碎，置4℃5～10min，待其自然沉淀，取上清液3ml按每毫升青霉素1000u，鏈霉素1000μg，混勻置4℃2h后就可接種。含棉拭子的標(biāo)本，先將棉拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出，而后按上述加以處理。器管組織標(biāo)本，需先用滅菌的乳缽磨碎用生理鹽水配成200g/L縣液，離心沉

18、淀，取3ml上清液與上述一樣用青、鏈霉素處理之。,30,2. 脊髓灰質(zhì)炎病毒樣本 （一）標(biāo)本采集 標(biāo)本的采集應(yīng)盡快進(jìn)行，常在患者發(fā)病7d內(nèi)采集，采集后的標(biāo)本低溫送檢（4℃），低溫保存（-25℃）。糞便標(biāo)本是最為常用的標(biāo)本?？扇』颊呒S便（即4～8g），置于干燥、潔凈、不漏的容器內(nèi)，保存送檢。,31,肛拭子與咽拭子標(biāo)本可放入1～2ml無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液或Hank液中送檢，保存。 腦脊液2～3ml，直接放入滅菌管內(nèi)送檢，保存。

19、 尸體解剖標(biāo)本采集要考慮取中樞神經(jīng)系統(tǒng)（特別是頸和腰部的脊髓灰質(zhì)和橋腦）和降結(jié)腸標(biāo)本，置于滅菌容器內(nèi)，保存送檢。,32,（二）標(biāo)本處理 糞便標(biāo)本2g加Hank液10ml制成20%懸液。3000r/min離心30min，取上清4～5ml，加活性炭200～250mg混勻，4℃1h后，3000r/min離心30min，取上清加抗生素（終濃度每毫升1000u青霉素，1000μg鏈霉素，下稱(chēng)“雙抗”）4℃作用4h，接種肉湯培養(yǎng)。如

20、有細(xì)菌生長(zhǎng)，重復(fù)處理一次。處理好的標(biāo)本-20℃保存。,33,肛拭子標(biāo)本同糞便標(biāo)本處理相同。 咽拭子標(biāo)本的處理只需加抗生素作無(wú)菌試驗(yàn)陰性，即可-20℃保存。 尸體解剖標(biāo)本1g，加入5ml Hank液，研磨成懸液，3000r/min，離心30min，取上清加雙抗（終濃度每毫升500u 青霉素和500μg鏈霉素），4℃過(guò)夜，離心，取上清-20℃保存。,34,3. 流行性出血熱病毒的樣本 (一)樣本的采集 1．

21、鼠肺 將捕到的新鮮死鼠或活鼠(頸動(dòng)脈放血致死)，置3％～5％來(lái)蘇兒浸泡5～10min，用碘酒消毒背部(或前胸)皮毛，無(wú)菌解剖取出肺臟，分成大小兩份分別編號(hào)，,35,小份制冰凍切片作間接免疫熒光染色；大份置4℃冰箱或一20℃以下低溫冰箱暫時(shí)保存。選擇特異性免疫熒光強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本，可制成10％懸液供分離病毒用。其他動(dòng)物臟器標(biāo)本制備方法與鼠肺的相同。,36,2．病人血液 采血應(yīng)在病人發(fā)病后5d內(nèi)，愈早愈好。無(wú)菌采靜脈血5ml，放冰壺內(nèi)立即送實(shí)

22、驗(yàn)室，分離血清(如將血液4℃保存，不應(yīng)超過(guò)24h，將血清和血塊分別凍存于一40'C以下或液氮中備用。,37,選雙份血清抗體檢查確診病例的第1份血清標(biāo)本(最好是抗體反應(yīng)陰性的血清或血塊)作病毒分離標(biāo)本之用。血清可直接用于接種細(xì)胞或動(dòng)物，血塊經(jīng)研磨制成5％懸液后應(yīng)用。另外有采用“床邊接種”，即采血后立即將全血接種到敏感動(dòng)物或細(xì)胞，因標(biāo)本新鮮，有可能提高分離率。,38,有人采用病人的白細(xì)胞分離病毒，獲得良好結(jié)果。分離白細(xì)胞的方法是：用

23、注射器先抽取肝素lml，用它可采病人靜脈血5～10ml，置試管內(nèi)混勻，再加入60g／L葡聚糖1份于5份含肝素的全血中，于30'C靜置30min后，將上清液離心10min(1 500r／min)，用Hank液洗沉淀2次，再用Eagle液稀釋白細(xì)胞到一定濃度后，直接接種敏感動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)。,39,（二）樣本的處理 1．除菌 鼠肺、病人血液(血清、血塊、血細(xì)胞)要求嚴(yán)格無(wú)菌手術(shù)采取，制備懸液時(shí)加含常規(guī)量抗生素防少量雜菌生長(zhǎng)

24、外，一般不需其他處理。對(duì)從外環(huán)境采集的標(biāo)本(如螨類(lèi))或在操作中無(wú)菌條件不夠，污染雜菌可能性大時(shí)，,40,用含大劑量抗生素(1000～10000u或/μg/m1青霉素、鏈霉素和適量制霉菌素)的緩沖液處理過(guò)夜或?qū)乙簶?biāo)本經(jīng)10000r/min冷離心30min或經(jīng)孔徑0.45/xm濾膜除菌過(guò)濾，然后應(yīng)用。,41,2．研磨和制備懸液 將選好的標(biāo)本塊(如肺)，稱(chēng)重后轉(zhuǎn)移入乳缽，剪碎，加入玻璃砂或海砂，反復(fù)研磨，加9份含常規(guī)量抗生素，10％小牛血

25、清(或脫脂奶)，pH7.4的Eagle液，混勻制成10％懸液(W/V)，2000～3000r/min．離心15—20min，取上清液供接種敏感動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)，如懸液不能及時(shí)應(yīng)用，應(yīng)分裝凍存于一40℃以下冰箱或液氮中。,42,損 傷 菌 的 恢 復(fù),國(guó)際上較公認(rèn)的一些標(biāo)準(zhǔn)方法，使損傷菌得以恢復(fù)，這些方法如下： (1)副溶血弧菌的檢測(cè)：用3％NaCl蛋白胨水接種樣品，于35℃培養(yǎng)2h進(jìn)行前增菌。 (2)耶爾森氏菌屬的檢測(cè)：在

26、4℃培養(yǎng)以前，先在25℃培養(yǎng)4h進(jìn)行前增菌。,43,(3)彎曲桿菌的檢測(cè)：將樣品先培養(yǎng)于添加有琥珀酸鈉(0.3％)，胱氨酸—HCl(0.01％)和抗生素(如CAMPY—BAP和CAMPY THl0培養(yǎng)基)的布魯氏菌肉湯培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)6h，然后加多黏菌素B并轉(zhuǎn)置于42℃培養(yǎng)。須用微需氧培養(yǎng)法。,44,(4)大腸菌群、糞大腸菌群、副溶血弧菌、糞鏈球菌和金黃色葡萄球菌的MPN測(cè)定法：將樣品進(jìn)行連續(xù)10倍的3次稀釋?zhuān)缓髮⒏飨♂屢悍謩e以

27、lml各接種于3支裝有4mlSTB培養(yǎng)基的試管中，于35-37℃，培養(yǎng)4-16h進(jìn)行前增菌，然后每管再加雙料選擇性肉湯培養(yǎng)基。以下按原法進(jìn)行操作。,45,(5)表面覆蓋平板法：即以無(wú)選擇性營(yíng)養(yǎng)豐富的瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行樣品的傾注平板，在25—37℃培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(一般1—4h)以使受傷菌得以恢復(fù)。以后再依據(jù)所欲計(jì)數(shù)的細(xì)菌類(lèi)別覆蓋一層約10-12ml的選擇性瓊脂培養(yǎng)基。再繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。按原法進(jìn)行計(jì)數(shù)。,46,本法適用于大腸菌群、糞大腸菌群(培養(yǎng)于

28、44.5—45℃)，志賀氏菌屬、糞鏈球菌、嗜酸性乳酸桿菌、酵母和霉菌。但每個(gè)平板只能接種0.1-0.5ml樣品，因此，不宜用于欲計(jì)數(shù)含細(xì)菌較少的樣品。此外，在加覆蓋層瓊脂時(shí)要輕緩，以防將菌落打散而產(chǎn)生較高菌落數(shù)。,47,(6)濾膜平板法：以打碎混勻的樣品ml涂布于一張孔徑450mm的濾膜(85mm直徑的濾膜最適用于標(biāo)準(zhǔn)大小的陪替氏平皿上)上，并放于無(wú)選擇性的瓊脂平板培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)4h以利于受傷細(xì)菌的恢復(fù)。然后將濾膜置于選擇性瓊脂