抗炎作用實(shí)驗(yàn)研究思路與方法

1、,炎癥反應(yīng)是臨床常見病理生理過程，感染、缺血、抗原-抗體反應(yīng)、化學(xué)、熱或機(jī)械損傷等均可誘發(fā)炎癥反應(yīng)。中藥中具有明確抗炎作用的藥物類別有：解表藥，清熱藥，祛風(fēng)濕藥，瀉下藥，溫里藥，活血化瘀藥，化痰止咳平喘藥，開竅藥等,,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇,哺乳動(dòng)物，雄性。足趾腫脹法用大鼠。過敏性炎癥首選豚鼠。,,常用抗炎實(shí)驗(yàn)方法,根據(jù)致炎性質(zhì)的不同分為兩大類：（一）非特異性炎癥模型：致炎因子主要有：異性蛋白（如雞蛋清）、顆粒性異物（如角叉菜膠*、

2、棉球、酵母）、化學(xué)物質(zhì)（二甲苯、松節(jié)油、甲醛）（二）免疫性炎癥模型：細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)性炎癥，免疫復(fù)合物介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)模型。,,（一）非特異性炎癥模型,非特異性炎癥反應(yīng)有三期：早期（急性）炎癥時(shí)相，以局部血管擴(kuò)張和毛細(xì)血管通透性增加為特征；中期（亞急性）時(shí)相，以血小板粘附、白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的浸潤為特征；炎癥晚期（慢性增殖期）以纖維組織增生、纖維化和肉芽屏障形成為特征。,,急性和亞急性炎癥的實(shí)驗(yàn)方法：,1、毛細(xì)血管通透性測定：

3、評(píng)價(jià)藥物對(duì)炎癥物質(zhì)引起的血管通透性增加的抑制作用?！驹怼砍Ｓ萌玖蠞B出法，如伊文思藍(lán)與血漿蛋白穩(wěn)固結(jié)合，當(dāng)致炎因子（醋酸，組織胺，5-羥色胺，PG等）誘導(dǎo)毛細(xì)血管通透性升高時(shí)，在一定范圍內(nèi)染料的漏出量可反應(yīng)滲出毛細(xì)血管的血漿蛋白量。,,,【方法一】取雄性大鼠或小鼠，隨機(jī)分組，給予受試藥物、陽性藥物或生理鹽水。30min后，在已剃毛的背部兩個(gè)部位分別皮內(nèi)注射組胺和5-羥色胺，立即靜脈注射1%伊文思藍(lán)溶液。15min后，處死動(dòng)物

4、，剝離背部皮膚，測量注射部位著色面積，或者剪下著色皮膚，切碎，在水-丙酮溶液中浸泡24-48h，過濾，分光光度計(jì)比色。,,,[評(píng)價(jià)]本法操作簡單，但操作時(shí)應(yīng)注意：伊文斯蘭注入量一定要準(zhǔn)確，滴二甲苯浸潤皮膚要仔細(xì)。皮膚毛細(xì)血管通透性增高是抗炎作用研究的最常用的模型之一。操作簡單，重現(xiàn)性較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀。,,,【方法二】取小鼠隨機(jī)分組，給藥1-2小時(shí)后，各鼠靜脈注射0.5%伊文斯蘭生理鹽水溶液0.1 ml/10g，隨即腹腔注射0.

5、6% HAC 0.2ml/只，20min后處死動(dòng)物，打開腹腔，用生理鹽水分次沖洗腹腔，合并洗滌液離心，取上清液590nm處比色測定，計(jì)算腹腔染料量，評(píng)價(jià)毛細(xì)血管通透性。,,2、炎性腫脹的測定（1）小鼠耳廓腫脹法：耳廓涂抹致炎劑致炎劑：二甲苯，巴豆油合劑。（2）大鼠足趾腫脹法：足趾皮下注射致炎劑致炎劑：雞蛋清，角叉菜膠，酵母，甲醛，右旋糖酐，酵母液，組胺，5-羥色胺，制霉菌素,,,檢測指標(biāo)大鼠足趾腫脹法，測定大鼠足趾或關(guān)節(jié)的周長

6、、厚度或整個(gè)足趾、踝關(guān)節(jié)的容積。小鼠耳廓腫脹法，測定小鼠耳廓重量或者厚度。,,【評(píng)價(jià)】腳腫脹模型是最常用的抗炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，多種化學(xué)、物理以及免疫學(xué)刺激均可導(dǎo)致大鼠腳爪水腫，因水腫發(fā)展和消退的快慢及持續(xù)時(shí)間不同，可將其分為急性、亞急性和慢性腳腫脹，急性腳腫脹一般于給與致炎劑數(shù)十分鐘或1-3小時(shí)炎癥迅速發(fā)展至高峰，數(shù)小時(shí)內(nèi)會(huì)消退。慢性腳腫脹于數(shù)至十日以上發(fā)展逐漸達(dá)高峰，亞急性介于中間。,,化學(xué)物質(zhì)刺激所致急性腳腫脹最常用，如組織胺、5-

7、羥色胺、緩激肽、PGs、角叉菜膠、右旋糖酐、新鮮雞蛋清、甲醛、酵母、瓊脂等。芥子末、制霉菌素可以制備亞急性腫脹。,炎癥慢性增殖期模型,肉芽腫模型：應(yīng)用巴豆油、脫脂棉、海綿、玻璃棒、塑料環(huán)、紙片等埋入動(dòng)物局部皮下，可引起與臨床某些炎癥后期病理變化相似的肉芽增生，然后觀察藥物對(duì)肉芽重量的影響。常用方法：塑料環(huán)法；大鼠巴豆油氣囊法；棉球植入法；瓊脂皮下注射法等。,,（二）免疫性炎癥模型,細(xì)胞免疫、免疫復(fù)合物所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在各種風(fēng)濕性疾

8、病，尤其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理過程中起著主導(dǎo)作用，因此這類免疫性炎癥模型對(duì)研究抗炎抗風(fēng)濕藥物有重要價(jià)值。細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)性炎癥系由抗原進(jìn)入機(jī)體使T細(xì)胞致敏，當(dāng)再次接觸抗原，致敏T細(xì)胞分化增殖，釋放各種淋巴因子以及直接殺傷靶細(xì)胞，引起單核細(xì)胞浸潤為主的局部炎癥反應(yīng)。免疫復(fù)合物所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，系由抗原抗體形成復(fù)合物，激活補(bǔ)體，導(dǎo)致白細(xì)胞趨化激活，釋放一系列致炎因子產(chǎn)生局部和全身炎癥反應(yīng)。,,,1、大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎常作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一

9、種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。將弗氏完全佐劑皮?nèi)注入大鼠足趾部或尾根部致炎。原發(fā)病變類似于一般炎性水腫，在致炎部位12h后出現(xiàn)腫脹。繼發(fā)病變由遲發(fā)性超敏反應(yīng)引起，在致炎10d左右后出現(xiàn)對(duì)側(cè)、前肢足爪腫脹，耳、尾、出現(xiàn)炎癥結(jié)節(jié)和紅斑等。,,,【評(píng)價(jià)】本方法特異性高，假陽性率低，結(jié)果可靠。屬于免疫性關(guān)節(jié)炎模型。該模型比其他模型更接近于臨床類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）。弗氏完全佐劑的制備是模型成敗的關(guān)鍵。（液體石蠟：羊毛脂（2:1）共熱至70℃，混勻，加入滅

10、菌的卡介苗按照每毫升中加2-10mg制備。動(dòng)物選擇大鼠，雄性，150-200g之間，過小或老均不敏感。,,,2、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎II型膠原是軟骨主要成分，具有抗原性，誘發(fā)針對(duì)關(guān)節(jié)滑膜的自身免疫反應(yīng)。將II型膠原加入弗氏佐劑中，皮內(nèi)注射如大鼠足趾或尾根部致炎。 這兩種炎癥模型均發(fā)生急性局部炎癥期（1-4天）、急性炎癥緩解期（7-12天）、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征的慢性周身炎癥期（10-28天）以及永久性關(guān)節(jié)畸形（第35天以后）,,

11、,【評(píng)價(jià)】該模型比佐劑性關(guān)節(jié)炎模型更進(jìn)一步，更貼近于人的RA，有體液免疫和細(xì)胞免疫協(xié)同作用，其病理表現(xiàn)為進(jìn)行性滑膜炎及滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤，軟骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷和僵硬。在臨床、組織學(xué)和免疫學(xué)改變上均與人的RA相似。,,抗炎作用機(jī)制的研究方法,1、對(duì)炎癥細(xì)胞功能的影響（1）多形核白細(xì)胞趨化性測定【原理】白細(xì)胞聚集是機(jī)體防御機(jī)制的一個(gè)重要方面。趨化因子能吸收白細(xì)胞致感染或炎癥部位。測定白細(xì)胞趨化性的方法有瓊脂糖法。,,,（

12、2）巨噬細(xì)胞吞噬功能測定【機(jī)理】吞噬作用是吞噬細(xì)胞接觸-胞飲-降解異物的過程。微生物、免疫復(fù)合物或其他異物必須先與吞噬細(xì)胞結(jié)合，才能啟動(dòng)這一作用。,,,2、抗炎與垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的關(guān)系（1）切除雙側(cè)腎上腺大鼠或小鼠的抗炎實(shí)驗(yàn)【原理】摘除兩側(cè)腎上腺即除去了內(nèi)分泌系統(tǒng)（下丘腦-垂體-腎上腺軸）的影響，再進(jìn)行抗炎實(shí)驗(yàn)，以觀察藥物抗炎作用是否與垂體-腎上腺系統(tǒng)有關(guān)。（2）血漿皮質(zhì)醇含量的測定作為一個(gè)指標(biāo)，結(jié)合抗炎實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。,,,