感受態(tài)制備、藍(lán)白斑篩選

1、感受態(tài)細(xì)胞的制備 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌及初步篩選,復(fù)習(xí)：基因克隆示意圖,基因克隆操作過(guò)程：,基因工程,一、感受態(tài)細(xì)胞及重組體轉(zhuǎn)化,重組體轉(zhuǎn)入受體菌,轉(zhuǎn)化（transformation）轉(zhuǎn)染（transfection）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）,,轉(zhuǎn)化是將含有目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。 轉(zhuǎn)染是將含有真核生物基因的噬菌體感染細(xì)胞; 轉(zhuǎn)導(dǎo)則是指病毒從被感染的細(xì)胞(供體)釋放出來(lái)，再

2、次感染另一細(xì)胞(受體時(shí))，發(fā)生供體細(xì)胞與受體 細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。,重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的手段,轉(zhuǎn)化方法,CaCl2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 電穿孔 PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 人工體外包裝,,,特殊處理,受體細(xì)胞,細(xì)胞膜特性改變,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,感受態(tài)(competent)：宿主細(xì)胞處于容易吸收外源性DNA的狀態(tài)，處于感受態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞. 正常細(xì)胞都有

3、細(xì)胞膜（細(xì)菌還有細(xì)胞壁）作屏障，對(duì)外源分子選擇性接受。在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)一定的理化條件使細(xì)胞通透性增大，處于感受態(tài)。,制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的常用方法 CaCl2轉(zhuǎn)化程序法：傳統(tǒng)方法,轉(zhuǎn)化效率能達(dá)到5?106－2?107轉(zhuǎn)化子/?g質(zhì)粒DNA，簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好、菌株適用范圍廣。 電穿孔轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體(liposome)法、胞核的顯微注射法(microinjection)； 磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚乙二醇介導(dǎo)的原生

4、體轉(zhuǎn)化法；,CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的原理 一般受體菌對(duì)重組DNA分子的攝取能力很低，難以轉(zhuǎn)化成功。當(dāng)細(xì)菌處于冰冷（0℃）0.05～0.1M的 CaCl2低滲溶液中，菌體的細(xì)胞膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性增加，對(duì)DNA的攝取能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率提高（感受態(tài)細(xì)菌）。,同時(shí)在轉(zhuǎn)化體系中的DNA形成的抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物能粘附于細(xì)菌表面，經(jīng)過(guò)42℃短時(shí)間熱休克（heat shock）處理

5、，促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，重組子中的基因在轉(zhuǎn)化細(xì)菌中得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)(selective culture)平板上即可篩選出所需的轉(zhuǎn)化子。,,,,0.1mol/LCaCl2,0℃,,,,,,,,,重組體,感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化(transformation)：在分子克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。 區(qū)別轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染(transfe

6、ction)與轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction),轉(zhuǎn)化與感受態(tài)細(xì)胞,二、感受態(tài)細(xì)胞制備及重組體轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng),細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一冰冷的1.5ml的EP管，40C，4000rpm×5min,,棄上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 300μl，重懸菌體，冰浴20min,,40C，4000rpm×5min 棄上清，將管倒置于濾紙上1min，使液體流干凈 沉淀中加入冰冷的0.1mol/L Ca

7、Cl2 100μl，重懸菌體。  冰浴10min,,,,冰浴10min后,,每管加入質(zhì)粒5?l,,輕輕旋轉(zhuǎn)試管，混勻混合物，在冰浴上放置20min,,試管放入420C的水浴中，放置90s，不要搖動(dòng)試管,,迅速將試管轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻1~2min,取出試管后，每管加入LB培養(yǎng)基800?l， 置于370C搖床（100~150r/min）

8、，溫和震蕩45min 用無(wú)菌彎頭玻璃鋪菌器將200?l菌液鋪于含Amp的瓊脂平板表面 室溫放置20min，使液體被吸收（發(fā)汗） 倒置平皿，370C培養(yǎng)，12小時(shí)可見(jiàn)菌落生長(zhǎng),,,,,三、重組體的篩選,重組體克隆的篩選與鑒定,,由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法得到含有重組DNA的陽(yáng)性克隆。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,篩選的依據(jù)：

9、 基因載體的特點(diǎn)、受體細(xì)胞的特性和外源基因的表達(dá)。 篩選的方法： 抗藥性標(biāo)志的選擇 插入表達(dá)篩選 ?-半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選（?-互補(bǔ)） (?-半乳糖苷酶能將X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘纳钏{(lán)沉淀）,(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇,,,,,目 錄,菌落雜交篩選法 內(nèi)切酶圖譜鑒定 PCR篩選重組子 Southern印跡雜交和菌落原位雜交 DNA序列分析 免疫化學(xué)檢測(cè)法,原理：基因載體上含

10、有ß-半乳糖苷酶（LacZ)的基因，當(dāng)外源DNA插入到載體的LacZ基因上后將造成ß-半乳糖苷酶失活，就不能分解培養(yǎng)基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-半乳糖苷）產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，結(jié)果可通過(guò)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在含有X-gal-IPTG（異丙基-ß-D-硫代半乳糖苷）培養(yǎng)基的顏色變化直接觀察出來(lái)。,,藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn),α 互補(bǔ)的檢測(cè),,,,,目 錄,U6,原位雜交,,,,,目 錄,Southe