基因檢測(cè)指導(dǎo)華法林劑量

1、CYP2C9/VKORC1基因檢測(cè)指導(dǎo)華法林劑量,個(gè)體化用藥需要考慮遺傳因素,,基因是藥物個(gè)體化差異最基礎(chǔ)甚至最重要的因素,遺傳和環(huán)境因素對(duì)藥物和疾病的影響,口服40mg奧美拉唑后血藥濃度變化，不同基因型相差近9倍：,CYP2C19 *2/*2型：AUC=5.3±2.2,CYP2C19 *1/*2型：AUC=1.1±0.6,CYP2C19 *1/*1型：AUC=0.6±0.3,FDA在100多種藥物

2、說明書中給予基因信息提示,,http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/Pharmacogenetics/ucm083378.htm,,FDA已批準(zhǔn)多款個(gè)體化用藥基因檢測(cè)產(chǎn)品,,國內(nèi)已有個(gè)體化用藥基因檢測(cè)產(chǎn)品獲批,,CYP2C9\VKORC1基因檢測(cè)的意義 ,第一節(jié),華法林的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用,1920年，美國北部和加拿大牧場(chǎng)的牛群，發(fā)生無法解釋的嚴(yán)重出血，甚至直至死亡的情況

3、。1921年，加拿大一位獸醫(yī)，推測(cè)發(fā)酵過的苜蓿代替玉米是出血的主因，但無法知道其中成分。1939年，威斯康辛大學(xué)發(fā)現(xiàn)這種成分為香豆素（coumarin）。1948年，合成更強(qiáng)效的抗凝劑華法林（warfarin），用于滅鼠（現(xiàn)名殺鼠靈）1950年代，用于人類醫(yī)療，第一位使用華法林的名人是艾森豪威爾總統(tǒng)。,華法林處方量大，不良反應(yīng)多,華法林（warfarin）是一種香豆素類口服抗凝血藥，是治療血液栓塞性疾?。ㄈ缟铎o脈血栓、心

4、房纖顫、心臟瓣膜置換及肺栓塞等）的一線藥物，年處方量占人口總數(shù)的0.5-1.5%。是FDA藥物不良反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)最常報(bào)告的藥物之一。,治療窗窄、個(gè)體差異大，劑量很難把握,治療窗窄，有效治療濃度2.2±0.4 μg/mL；個(gè)體化差異大（比如：起始劑量給予3-5mg/天，而達(dá)到INR2.0-3.0所需的穩(wěn)定劑量可能1-20mg /天）；藥物起效和失效緩慢，需要頻繁調(diào)整藥物劑量 凝血酶原時(shí)間（PT）和國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR

5、）；醫(yī)生主觀上不愿使用華法林治療，患者依從性不好。摸索劑量需要數(shù)周（月），而不良事件高發(fā)期在30-60天。,中國人對(duì)華法林的抗凝作用更為敏感,,,,運(yùn)用華法林抗凝治療的同時(shí)，也成倍地增加了患者出血的發(fā)生率，甚至是危及生命，尤其是在治療初期的數(shù)周到數(shù)月內(nèi)。據(jù)估計(jì)，服用華法林的患者中，每年每100人中，平均有15.2人次發(fā)生出血副作用，其中致命性的大出血有3.5人次。,使用華法林的另一個(gè)特點(diǎn)是其穩(wěn)定劑量在不同種族間及個(gè)體間存在著較大

6、差異。與歐洲人相比，中國人對(duì)華法林的抗凝作用更為敏感，所需的穩(wěn)定劑量比歐洲人要低40％-50％，而不同個(gè)體間穩(wěn)定劑量的差異可達(dá)20倍以上。,使用麻煩、結(jié)果兇險(xiǎn)導(dǎo)致華法林用量相對(duì)保守,臺(tái)灣：2004-2005年間，共有34591例房顫病人，其中7225例為易發(fā)生血栓的高危病人，但有44.3%的人應(yīng)該使用卻沒有使用華法林治療，僅僅使用抗血小板藥物，10.9%的病人完全未使用任何抗栓藥物。美國，高危房顫病人，只有54.7%使用華法林。

7、加拿大，一項(xiàng)房顫合并腦中風(fēng)又二度中風(fēng)的華法林研究顯示，57%的患者使用華法林，只有18%達(dá)到治療INR。中國，房顫患者服用華法林的占7%。,新聞報(bào)道一則,據(jù)央視《經(jīng)濟(jì)半小時(shí)》報(bào)道 2005年12月，北京大學(xué)第一醫(yī)院心血管研究所研究員熊卓為因腰椎輕度滑脫，就診于北大醫(yī)院。住院后第二天，北大醫(yī)院骨科主任李淳德給熊卓為做了骨科手術(shù)。不過手術(shù)后，熊卓為并沒有像醫(yī)生說的那樣很快恢復(fù)，病情反而突然嚴(yán)重起來。2006年1月31日，術(shù)后第7天，熊卓

8、為因術(shù)后并發(fā)癥肺栓塞，搶救無效死亡。 手術(shù)主刀的骨科主任李淳德介紹，手術(shù)后沒有給病人使用抗凝劑，造成有高凝血體質(zhì)的熊卓為最終死于肺栓塞，是病人家屬質(zhì)疑醫(yī)院的主要問題之一。對(duì)此，李淳德表示，2004年，還沒有出現(xiàn)抗凝治療，全國都沒有脊柱手術(shù)后使用抗凝劑的常規(guī)，2007年形成了一個(gè)指南，但只限于骨關(guān)節(jié)手術(shù)。當(dāng)時(shí)的骨科主任朱天岳也表示，目前骨科只有關(guān)節(jié)外科的部分手術(shù)常規(guī)使用抗凝劑，脊柱外科雖然有術(shù)后因血栓死亡的病例，但沒有形成常規(guī)指南

9、?！靶茏繛槭撬烙趪?yán)重的肺栓塞，這是骨科手術(shù)最兇險(xiǎn)的合并癥。肺栓塞一旦出現(xiàn)兇險(xiǎn)癥狀，一般都搶救不過來。”,華法林的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué),S-華法林的活性為R-華法林的3倍以上。S-華法林主要由CYP2C9代謝，其代謝產(chǎn)物僅有微弱的抗凝作用。華法林主要是抑制維生素環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體（VKORC），阻礙凝血因子的合成而發(fā)揮抗凝作用。,2*、*3是影響CYP2C9功能的最常見突變位點(diǎn),CYP2C9基因存在眾多多態(tài)性（突變頻率>1%

10、），根據(jù)發(fā)現(xiàn)的先后順序，依次命名為*2、*3、*4…，無突變則命名為*1；檢測(cè)*2、*3兩個(gè)位點(diǎn)可得出6種基因型。,CYP2C9基因突變導(dǎo)致對(duì)華法林的清除變慢,攜帶CYP2C9突變型的患者（*1/*2、 *1/*3、 *2/*2、 *3/*3、 *2/*3 ），出現(xiàn)INR值過高和嚴(yán)重出血事件的風(fēng)險(xiǎn)要顯著高于野生型患者（ *1/*1），劑量較野生型患者低。,JAMA. 2002;287:1690-1698,-1639是影響VKORC1

11、功能的最常見突變位點(diǎn),檢測(cè)-1639位點(diǎn)可得出3種基因型；目前研究已經(jīng)證實(shí)一1639G>A和1173C>T兩個(gè)位點(diǎn)是完全連鎖的：-1639A=1173T-1639G=1173C,VKORC1基因突變導(dǎo)致對(duì)華法林的敏感性增加,,,Human Mol ecular Gen etics, 2005(14), 13 :1745-1751,FDA 2007年修訂華法林說明書,,,FDA 2010年在華法林說明書中增加起始劑量選

12、擇表,,國際華法林藥物基因組學(xué)聯(lián)合會(huì)（IWPC）劑量公式,國際華法林藥物基因組學(xué)聯(lián)合會(huì)（The International Warfarin Pharmaeogenetics Consortium）共搜集5700例使用華法林治療的病人（其中包括華人在內(nèi)的亞洲人1634例），通過大量數(shù)據(jù)，制訂了華法林的劑量運(yùn)算法，結(jié)果顯示，它明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的固定劑量方案。,1, White (White+Caucasian+Hispanic)2

13、, Black or African American3, Asian (Japanese,Han Chinese, Chinese, Korean, Malay, Indian)4, Others (Other Mixed Race+Intermediate),（IWPC）劑量公式取值方法,,UKPMC Funders Group, N Engl J Med. 2009, 360(8): 753–764.,舉例

14、：使用IWPC公式模擬計(jì)算,看似情況相同的兩個(gè)患者，由于遺傳差異，實(shí)際上對(duì)華法林的最適劑量差異非常大。攜帶CYP2C9*1/*1和VKORC1 -1639GG的患者比攜帶CYP2C9*1/*3和VKORC1 -1639AA的患者所需的華法林劑量多2.5倍左右。,,IWPC劑量公式公益網(wǎng)站,,IWPC還發(fā)布了單機(jī)版的excel計(jì)算表,,國內(nèi)外科研現(xiàn)狀及展望,第二節(jié),國外正在進(jìn)行的基因介導(dǎo)華法林劑量試驗(yàn) 1,COAG：Clarificati

15、on of Optimal Anticoagulation through Genetics，NCT00839657 多中心、雙盲、隨機(jī)對(duì)照，隨訪6個(gè)月，比較兩種指導(dǎo)華法林起始劑量的方法主要指標(biāo)：前4周內(nèi)，患者INR在治療范圍內(nèi)時(shí)間的百分比,EU – PACT：EUropean Pharmacogenetics of AntiCoagulant Therapy，NCT01119300單盲、隨機(jī)對(duì)照，隨訪3個(gè)月，來自

16、英國和瑞典的900多例房顫和深靜脈血栓患者，評(píng)價(jià)基因介導(dǎo)指導(dǎo)acenocoumarol、 phenprocoumon、warfarin劑量的安全性和臨床應(yīng)用性能。主要指標(biāo)：1）INR達(dá)標(biāo)時(shí)間；2）劑量調(diào)整次數(shù)；3）過渡抗凝（INR>4.0）發(fā)生率；4）大出血和小出血事件；5）血栓復(fù)發(fā)率；6）血栓事件； 7）患者生活質(zhì)量； 8）治療成本。,國外正在進(jìn)行的基因介導(dǎo)華法林劑量試驗(yàn) 2,GIFT：Genetic InFormatics

17、 Trial of Warfarin Therapy to Prevent DVT，NCT01006733 多中心，隨即對(duì)照，1600例高?；颊撸饕僭O(shè)：基因介導(dǎo)方法可以降低復(fù)合風(fēng)險(xiǎn)事件（非致命VTE、非致命大出血、死亡、INR>4.0）。試驗(yàn)周期2011年-2015年。,國外正在進(jìn)行的基因介導(dǎo)華法林劑量試驗(yàn) 3,WARFARIN：Warfarin Adverse Events Reduction for A

18、dults Receiving Genetic Testing at Therapy Initiation，NCT01305148雙盲，隨即對(duì)照，4300例65歲及以上患者，3個(gè)月隨訪，驗(yàn)證基因介導(dǎo)方法能減少住院和死亡事件。主要指標(biāo)：華法林相關(guān)的臨床事件，包括大出血和血栓。次要指標(biāo)：劑量調(diào)整次數(shù)；大出血和小出血事件；超出INR范圍次數(shù)；醫(yī)生依從性。預(yù)計(jì)2012年底完成。,國外正在進(jìn)行的基因介導(dǎo)華法林劑量試驗(yàn) 4,

19、,檢測(cè)位點(diǎn)：CYP2C9*2 , *3 , VKORC1 - 1639G>A,國外檢測(cè)產(chǎn)品,國內(nèi)科研情況,,Guangdong general hospitalFirst Affiliated Hospital, Sun Yat-sen UniversityGuangdong Women and Children's HospitalSouthern Medical UniversitySun Yat-sen

20、University,Pharmacogenetic dosing of warfarin: a controlled randomized trial臺(tái)灣，至少600例患者，驗(yàn)證基因介導(dǎo)方法能提高華法林安全性 。主要指標(biāo)：INR達(dá)標(biāo)時(shí)間；穩(wěn)定INR維持時(shí)間長(zhǎng)短。次要指標(biāo)：不良事件數(shù)量；劑量調(diào)整次數(shù)。預(yù)計(jì)2012年底完成。,臺(tái)灣正在進(jìn)行的基因介導(dǎo)華法林劑量試驗(yàn),基因檢測(cè)指導(dǎo)華法林劑量逐步為醫(yī)患雙方接受，已有公式被大量驗(yàn)證，

21、包含更多因素更優(yōu)化的公式會(huì)被提出，推動(dòng)華法林更安全更廣泛的使用。,實(shí)驗(yàn)流程及試劑盒注意事項(xiàng),第三節(jié),實(shí)驗(yàn)第一部分：DNA提取,DNA提?。翰捎肂aiO血液DNA提取純化試劑盒（手工40-60min）。,,,,,,,,加樣：擴(kuò)增液+反應(yīng)液+DNA模板（手工10min）上機(jī)PCR（自動(dòng)60min）,實(shí)驗(yàn)第二部分：PCR擴(kuò)增,,分裝試劑：（手工10min） 雜交：（自動(dòng)2.

22、5h）,實(shí)驗(yàn)第三部分：全自動(dòng)雜交（一代機(jī)）,,,,,,,,實(shí)驗(yàn)第三部分：全自動(dòng)雜交（二代機(jī)）,,放置芯片: 24片通量，3個(gè)溫區(qū)，一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)多種產(chǎn)品。,放置試劑: 試劑預(yù)分裝，8聯(lián)條管，1人份1個(gè)條管。,載入程序，點(diǎn)擊運(yùn)行。,試劑盒中PCR擴(kuò)增所需的試劑（擴(kuò)增液和反應(yīng)液），受溫度和反復(fù)凍融影響較大，必須盡力保護(hù)。經(jīng)銷商冰箱合格，-20°C（<-17°C），經(jīng)常檢查溫度；收到試劑盒時(shí)及時(shí)存入冰箱，并