crisprcas基因編輯技術原理與應用

1、CRISPR-CAS基因編輯技術原理與應用,LOREM IPSUM DOLOR,Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.,Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems

2、 （常間回文重復序列叢集關聯(lián)蛋白系統(tǒng)）,What,01,02,CRISPR表示成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列，而Cas是一種和CRISPR系統(tǒng)相關聯(lián)的蛋白質、基因家族，其可以以序列依賴性的方式對DNA進行切割和靶向作用。,What,細菌和古細菌一種不斷進化適應的免疫防御機制 實際上就是一種基因編輯器,,,,,,,,,,,,,能,怎,好,CRISPR/Cas基因編輯技術能運用于實際中

3、了嗎？,相比其它編輯技術CRISPR/Cas基因編輯技術好用嗎？,怎么用CRISPR/Cas基因編輯技術？,,,,,,,,,發(fā)現(xiàn),原理,應用,優(yōu)點,缺點,發(fā)展,前景,發(fā)現(xiàn),,在1987年的一篇論文中，日本大阪大學的研究人員報告了一項表面上微不足道的研究發(fā)現(xiàn)。他們在調查一種編碼堿性磷酸酶的細菌基因序列時，發(fā)現(xiàn)了鄰近的一個不同尋常的DNA片段，這一DNA片段中間是一段短直接重復核苷酸序列，兩側為短特異片段。他們當時指出“這些序列的生物學意義

4、尚不清楚”。在幾乎過去快30年后，這一最初看起來不起眼的研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在為簡易操控大量生物體的基因組打開了大門。2000年，相似的重復序列在其它真細菌和古細菌中被發(fā)現(xiàn)并被命名為短間隔重復序列（Short Regularly Spaced Repeats，SRSR）。2002年SRSR被重命名為CRISPR。,,2013年2月發(fā)表在《Science》雜志上的兩篇文章發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能在293T,K562等多種細胞中進行有效的靶

5、向酶切,非同源末端連接同源重組效率約在在3-25%之間,與被《Science》雜志評為2012年十大科學突破之一的TALEN技術的酶切效果相當?？捎糜诰庉嬋祟惢蚪M。,發(fā)現(xiàn),,,,,,,原理,,CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過將入侵噬菌體和質粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相應的 CRISPR RNAs(crRNAs)來指導同源序列的降解，從而提供免疫性。CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 來

6、識別并剪切DNA以降解外來核酸分子。,原理示意圖,RNA指導的CRISPR/Cas9基因剪切系統(tǒng),利用CRISPRCas進行基因組工程，圖中不同顏色的剪刀代表著不同的Cas9酶,,,用CRISPR/Cas技術繞過了胚胎干細胞操作過程,可快速而有效地建立攜帶多個基因突變的小鼠。因其不依賴在胚胎干細胞上操作,可用于多生物細胞的基因操作。模型生物的建立也不再局限于小鼠及少數(shù)大鼠中,任何可進行胚胎操作的物種都能成為基因組工程的目標。,,,,,,

7、,,,,,,應用,應用,,Rudolf Jaenisch教授實驗室采用CRISPR/Cas技術繞過了胚胎干細胞操作過程，可快速而有效地建立攜帶多個基因突變的小鼠。這是CRISPR/Cas技術首次被用于多細胞生物的基因操作。,疾病模式動物,疾病模式動物,,,,,,,,,科學家們一直改變與特定疾病相關的基因來用小鼠或其他模型動物建立相應的疾病模型。研究者可以應用這些疾病模型研究疾病的發(fā)病機制,再現(xiàn)疾病發(fā)生過程;也可用于篩選有效治療藥物,或

8、通過研究特異的表面分子、信號通路等開發(fā)新的靶向治療藥物等。,疾病模式動物,,用特定的手段將目的DNA片段插入到小鼠胚胎干細胞中,篩選出成功修飾的胚胎干細胞,應用顯微操作技術將其移入到早期胚胎(即囊庇)中,將改造后的臟胎移植到假孕母鼠中,再自生出的小鼠篩選疾病模型。,,成本高,應用的物種有限,操縱的基因亦有限。,基因編輯功能應用,,CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯功能主要應用于在不同物種的基因組產生需要的等位基因突變,來研究基因功能或

9、建立疾病模型。 如果CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯功能如果真如研究者報道那樣強大的話，那該技術在先天性突變或獲得突變所致疾病的修復治療中將有巨大的潛在價值。這一點還有待研究。,疾病治療方向應用,,以CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯技術在一系列基因治療的應用領域都展現(xiàn)出極大的應用前景，如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病。CRISPR/Cas9在多種類型的細胞和組織中都具有高效精確的基因編輯能力，在CAR-

10、T、造血干細胞等體外治療手段中是一個非常理想的操作平臺，在體內也可適用。,,CRISPR/Cas技術靈魂人物——Feng Zhang（張鋒）MIT麥戈文腦研究所（McGovernInstitute for Brain Research）助理教授Feng Zhang獲得瓦利基金青年研究家獎（Vallee Foundation Young Investigator Award）。Feng Zhang目前的研究方向是設計新的分子工具

11、來操控活體大腦，他同時也是布羅德研究所（Broad Institute）的核心成員。,,“現(xiàn)在，人們可以用這一技術在活細胞中有效啟動任何基因。這個系統(tǒng)可以讓科學家們更簡便地研究不同基因的功能?！备脑旌蟮腃RISPR技術，可以快速對整個基因組進行功能篩選，幫助人們鑒定涉及特定疾病的基因。張鋒等人在這項研究中就鑒定了讓黑色素瘤細胞抵抗癌癥藥物的幾個基因。,鋅指核酸酶(ZFN),ES 細胞打靶,類轉錄活化因子核酸酶(TALEN),CRIS

12、PR/Cas基因編輯技術,構成：鋅指核糖核酸酶（ZFN） 由一個 DNA 識別域和一個非特異性核酸內切酶構成。,作用：增強線蟲的同源重組,前景：ZFN技術亦具有潛在的臨床應用前景。,缺陷：1、不能預期引入的ZFN蛋白是 不是會引起免疫系統(tǒng)的進攻。 2、直接體內注入基因的效率低。 3、在細胞內精確度難以預估。,優(yōu)點：設計更簡單，特異性更高。,缺點：具有一定細胞毒性，模塊組裝過程繁瑣

13、，一般需要求助于外包公司,應用：基于TALE的基因組編輯技術已經被廣泛作用于基因敲除、敲入、轉錄激活等。,簡介;TALENs是一種可靶向修飾特異DNA序列的酶，它借助于TAL效應子一種由植物細菌分泌的天然蛋白來識別特異性DNA堿基對。,,利用CRISPR/Cas技術構建基因敲出小鼠的效率非常高，可以非常高效率地在四個位點上對兩個基因進行敲出，效率達到了80%左右。如果利用TALENT技術，單基因敲出的效率只有30%。傳統(tǒng)的基因敲除方法需

14、要通過打靶載體構建、ES細胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、技術要求很高，而且費用大、耗時較長，成功率受到多方面因素的限制。,其他技術的不足,,,,,,,,,操作簡單，靶向精確性更高，成本低,可對靶基因單個位點或多個位點同時敲除,可同時對多個靶基因進行敲除,是由RNA調控的對DNA的修飾，其基因修飾可遺傳,可應用于任何物種,擁有CRISPR/Cas9腺病毒/慢病毒系統(tǒng)，對分裂期和非分裂期細胞均有感染作用。,更容易得到純合

15、子突變體,,,,,,,,,,,,,缺點,,傳統(tǒng)的轉基因和基因打靶技術，由于技術穩(wěn)定成熟，可以對小鼠和大鼠的基因組序列進行各種修飾，仍將是模式動物的構建的主要技術。該系統(tǒng)是否有脫靶效應尚需進一步的研究,缺點,,CRISPR-Cas技術尤其是CRISPR-Cas9作為基因編輯的核心技術，它仍然是一項非常新穎的技術，除了存在“脫靶”的主要問題外，還有許多的技術難點尚未突破，尤其是臨床應用的有效性和安全性依然是科學家關注和爭論的焦點。,進展,,

16、,,,,,細菌，哺乳動物,干細胞的定點突變,多基因 打靶,斑馬魚,擬南芥,靶序列互補,,1 隨著 CＲISPＲ/Cas 技術的快速發(fā)展,它已經被廣泛應用于細菌、人類胚胎干細胞、哺乳動物細胞、釀酒酵母、線蟲、果蠅和農作物等的基因研究，并具有操作簡單、快速、靶向精確性高、可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除等特點。在細菌研究方面，確定了副溶血性弧菌的 6 個不同的 CＲISPＲ序列類型，同時 CＲISPＲ 序列類型被認為與毒力因子測試和MLS

17、T 基因型明顯相關。,進展,,2 在斑馬魚研究方面，通過注射兩個簡單的體外合成的組件(即使用一個密碼子優(yōu)化的Cas9 和單鏈向導 sgＲNA)到單細胞期胚胎中，使目標基因突變。這種靈活的基因失活的方法為斑馬魚基因功能和基因相互作用提供了一個有效的方式。,進展,,,3 干細胞中的定點突變，包括引進或疾病患者特異性突變模型的修正。然而，在人類胚胎干細胞中將一個報告基因整合成一種內源性基因還需要漫長艱苦的兩步:首先要正確識別目標然后要排除

18、耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，tracrＲNA 和crＲNA 分開單獨表達，還能夠提高切割的效率。這個發(fā)現(xiàn)讓大家意識到:可以通過進一步修改 sgＲNA 的設計方案，讓它與雙 ＲNA 復合體的結構更加相近，就能夠進一步提高 Cas9 系統(tǒng)的基因組編輯效率。,進展,,4 在擬南芥研究方面，利用CＲISPＲ/Cas 系統(tǒng)對分裂組織有針對性地定點誘變產生遺傳突變，結果表明，在擬南芥中使用 CＲISPＲ/Cas系統(tǒng)為 RNA 引導的核酸內切酶(RGE

19、N)定點突變分裂組織提供了一種有效的遺傳基因工程的方法。,進展,進展,,5 CRISPR/Cas 的 打 靶 效 率 比 較 高，最 高 可 達 80% ，且靶位點設計靈活、方便，載體構建簡單;CRISPR/Cas 技術已經做到了降低脫靶的幾率，降低細胞毒性，但這并不是代表不會產生; 此外較于 ZFN與 TALEN，CRISPR/Cas 的設計更為簡單、廉價，一般普通的試驗也可自行操作; 現(xiàn)在的技術已經做到，可使CRISPR/Cas

20、同時打靶多個基因，且每多一個靶位點只需多一個 gRNA 質粒。,1. 目前 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中仍有一系列有待解決與發(fā)展的問題，例如如何突破 PAM 序列的限制、如何建立對 Cas9 特異性(脫靶效應)的全面評價體系、如何構建不同物種中可通用的 Cas9 與 sgRNA 導入與表達系統(tǒng)以及如何更有效的激活同源重組修復等。但是基于CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的迅猛發(fā)展速度，我們可以預見，隨著相關基礎科學研究的深入，CＲISPＲ-

21、Cas9系統(tǒng)將在基因組水平上的基因改造、轉錄調控與表觀遺傳調控等不同層次上得到更廣闊的發(fā)展與應用。,前景,2. 自 Cas9 被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員一直把它作為一把有潛力的鑰匙來開啟遺傳疾病的新療法，并且利用ＲNA 導向的 Cas9 核酸酶在哺乳動物細胞和斑馬魚胚胎中進行基因組編輯。研究發(fā)現(xiàn)，Cas9/gＲNA 有效誘導了生成的體細胞中 etsrp 或 gata5 的雙等位基因轉換。研究者通過 Cas9/gＲNA 系統(tǒng)的誘導在斑馬魚胚胎

22、中獲得了位點特異性的 mloxP 序列插入。因此，Cas9 核酸酶的功能遠遠大于目前所了解到的，加大對 Cas9 核酸酶的特異性研究并深入了解，有助于生命科學的研究。,前景,3. 外源性基因的插入會引起很多負面影響和意外突變，成為研究者們必須解決的問題。而 CＲISPＲ/Cas 系統(tǒng)的深入研究將是解決這一問題的關鍵。在人類疾病的研究上，癌癥基因的敲除、艾滋病毒等治療，CＲISPＲ/Cas9 技術擁有很大優(yōu)勢，這也將成為未來的研究趨勢。

23、同時也將為人類不可戰(zhàn)勝的疾病提供了更好的治療方法,前景,4. 通過目前對 CRISPR/Cas 系統(tǒng)研究，不管是在細胞中還是在動物胚胎中已經能夠對基因進行敲除或是修飾來優(yōu)化品種或者治療疾病 。為了對遺傳缺陷進行糾正或刪除，將 Cas9 系統(tǒng)和相應的靶向致病基因的 sgRNA 載體導入機體，這種技術在未來較短的時間內會成為一種成熟的非常有效的治療手段。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在疾病治療 、基礎理論研究和農牧漁業(yè)等領域已經得到廣泛研

24、究，這將對分子生物學研究和基因治療領域產生深遠影響。,前景,5. 許多研究利用這種技術為各種人類疾病構建出動物模型，已經取得重大成果。為了擴大這項技術的使用范圍，研究者們將 CＲISPＲ/Cas9 系統(tǒng)與其他的基因組改造技術(如巨核酶技術、鋅指核酶技術及 TALEN 技術等)進行更加深入的比較研究。研究表明，CＲISPＲ 系統(tǒng)還參與細菌生長代謝的調控，這說明Cas 蛋白和 CＲISPＲ ＲNA 的功能已經不只能局限于免疫抑制，對于它的

25、研究還需要更加深入。同時它也呈現(xiàn)出越來越多的可能性和不可知性，這都需要研究者去發(fā)現(xiàn)、利用。,前景,6. 隨著基因測序技術的不斷成熟，3 種技術不斷完善。ZFN 作為第一代人工核酸內切酶技術，敲開了基因精確編輯的大門，但是由于存在計復雜、敲出效率低和脫靶嚴重等缺陷，使得其應用程度受到限制;TALEN 在 ZFN 的基礎上不斷改進，使得基因編輯的效率與特異性加速提高，目前來說，TALEN 是比較成熟的基因編輯工具，但是由于其成本高、可操