利用飛行時間質(zhì)譜簡便、快速鑒定藍藻新方法的研究和應用.pdf

1、水體富營養(yǎng)化與其引發(fā)的藍藻水華現(xiàn)象以及產(chǎn)生的藻毒素問題，對我國的水環(huán)境產(chǎn)生了長期不良的影響與危害，是目前仍舊面臨的一個難題。在采取治理措施的同時，必須對發(fā)生藍藻水華的水體進行即時監(jiān)測，并對其發(fā)生的可能性提前做出預警，從而制定及時有效的治理手段。目前，盡管國內(nèi)外針對富營養(yǎng)化湖泊中藍藻水華的監(jiān)測已經(jīng)開發(fā)了多種方法，但是仍缺乏快速、簡便和精確的監(jiān)測方法。本研究建立了以核糖體蛋白質(zhì)為生物標識物，以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T

2、OF MS)為測試手段的鑒別藍藻新方法，并探討其在藍藻毒性鑒別與藍藻多樣性分析的應用以及在監(jiān)測方面應用的可能性。
　　首先，本研究通過對藍藻樣品三種前處理方法的篩選，探討使藍藻樣品的核糖體亞基蛋白質(zhì)在合適的范圍內(nèi)被檢測到并且信號達到最強，以及利用蛋白質(zhì)組學分析核糖體蛋白質(zhì)作為鑒別藍藻的生物標識物的可行性。結(jié)果表明，采用機械破碎和高速離心的前處理可獲得銅綠微囊藻標準株（Microcystis aeruginosa，NIES-843）

3、的核糖體亞單位，通過對核糖體亞單位進行MALDI-TOF MS測定并與其理論計算值進行比較，全部52個核糖體蛋白質(zhì)中有31個能夠被成功地檢測到，其中高頻度且高強度出現(xiàn)的13個核糖體蛋白質(zhì)（L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20和S14）被選作鑒別藍藻的特征生物標識物。
　　以建立的測定方法，對55株來自不同采集環(huán)境的M.aeruginosa進行測定和蛋白質(zhì)組學分析，同時利用非

4、加權(quán)組平均法(UPGMA)繪制出系統(tǒng)分類樹，對其進行種內(nèi)基因多樣性分析。結(jié)果表明，不同M.aeruginosa株的同種核糖體蛋白質(zhì)間存在不同類型(type);55株M.aeruginosa通過UPGMA分析被分為5個主要分支(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ)，其中，有毒藻藻株被分類至Ⅰ組和Ⅱ組，而無毒藻株則被分至Ⅲ-Ⅴ組。此結(jié)果表明利用核糖體蛋白質(zhì)為生物標識物的MALDI-TOF MS鑒別法可以實現(xiàn)在株水平上對藍藻的鑒別并可對有毒和無毒的藻株進行有

5、效區(qū)分。
　　為了探討所建立的MALDI-TOF MS法在實際水體中鑒別藍藻的可行性，先通過測定一系列不同細胞密度的M.aeruginosa NIES-843樣品，確定該方法的敏感性及實際應用中樣品體積的合理性，再通過測定4種不同種類的藍藻在不同濃度下的模擬實際水體而配成的人工混合樣品，確定該方法從混合物中檢測出目標M.aeruginosa的可行性。結(jié)果表明:MALDI-TOF MS法的最小生物量檢出限為1.955×106cell

6、s，特征核糖體蛋白質(zhì)檢出11個，檢出率為84.6％，與此相對應的有藍藻水華發(fā)生的湖泊水體采樣體積為0.1-1L，在日常水質(zhì)監(jiān)測中屬于合理的采樣體積;同時，MALDI-TOF MS法對四種不同種屬的藍藻配成的人工混合樣品的測定，證明了銅綠微囊藻NIES-843可以被有效地檢測出，最低生物量檢出限為2.88×106cells，相對應的混合樣品3中M.aeruginosa的占比為37％，特征核糖體蛋白質(zhì)的檢出率為76.9％。
　　最后，

7、將基于13個特征核糖體蛋白質(zhì)為生物標識物的MALDI-TOF MS法對采集于太湖夏季的四個不同地點的實際水樣進行檢測分析。結(jié)果表明，實際太湖樣品1和4中能檢測出9個特征標識峰，檢出率為69.2％，太湖樣品2和3中則能檢測出11個特征標識峰，檢出率為84.6％;同時，來自太湖的實際水樣中同種核糖體蛋白質(zhì)的不同類型也被檢測到(L32，L35，L29，L28和S14)，即在太湖不同地點存在不同株型的銅綠微囊藻，揭示了株水平上的多樣性。