H5N1病毒RNA聚合酶PAc-PB1n蛋白的表達(dá)純化及晶體篩選.pdf

1、禽流感是由A型流感病毒引起的一種禽類急性傳染病，近年來(lái)，高致病型禽流感病毒H5N1亞型突破種間屏障引起人的感染，嚴(yán)重危害人類安全。 1997年，中國(guó)香港發(fā)生高致病性禽流感H5N1感染人類事件，這是禽流感病毒首次突破種間屏障直接傳染給人[2]。 此后，H5N1禽流感病毒感染人類事件不僅在東南亞國(guó)家不斷發(fā)生，而且感染范圍不斷擴(kuò)大，病例遍及越南、波蘭等10余個(gè)國(guó)家和地區(qū)。截至2007年10月2日，WHO確認(rèn)全球已有329人受感

2、染，其中201人死亡，中國(guó)H5N1的感染人數(shù)為25例，其中16例死亡(http：//www.who.it/)。高致病性禽流感已成為嚴(yán)重危害禽類和人類的烈性傳染病。 PA、PB1和PB2作為禽流感病毒RNA聚合酶的三個(gè)亞基，在宿主體內(nèi)翻譯表達(dá)后與病毒RNA形成聚合酶-RNA復(fù)合體，參與病毒RNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過(guò)程。 其中，PA已被證明具有蛋白酶活性[4-9]，且有可能參與病毒RNA的復(fù)制[10-13]；PB1可以與其它兩

3、個(gè)亞基相結(jié)合，確保形成穩(wěn)定的蛋白復(fù)合體，此外，它還具有核酸內(nèi)切酶的活性，用來(lái)切除宿主RNA5’端的cap結(jié)構(gòu)；PB2則主要負(fù)責(zé)結(jié)合宿主RNA的cap結(jié)構(gòu)，并交與PB1切下cap結(jié)構(gòu)作為vRNA合成的引物[14，26，42-44]。 目前對(duì)于禽流感RNA聚合酶三個(gè)亞基是如何與病毒RNA相結(jié)合，以及它們的作用機(jī)制還沒有一個(gè)清楚的結(jié)論。 在本課題中，我們首先克隆了H5N1病毒RNA聚合酶PA亞基C末端460個(gè)氨基酸(257-

4、716Aa，PA_C257)和PB1亞基N末端25個(gè)氨基酸(1-25Aa，PB1_N25)的基因，并構(gòu)建了帶有GST標(biāo)簽的重組PA C257和PB1_N25蛋白。 然后利用原核表達(dá)系統(tǒng)E.coil BL21(DE3)成功表達(dá)了這兩個(gè)蛋白，而且通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明它們之間具有相互作用。原核表達(dá)的重組蛋白經(jīng)過(guò)GST親和層析和Sephadex G-100層析柱純化，最終得到了高純度的PA_C257和PB1_N25蛋白復(fù)合體。我們采用懸滴氣