Gluc-GFP雙標(biāo)記系統(tǒng)及H5N1假病毒的構(gòu)建與驗(yàn)證.pdf

1、光學(xué)分子影像學(xué)對(duì)于病毒的標(biāo)記研究有著重要的意義。在流感病毒研究領(lǐng)域，標(biāo)記病毒的研究一直層出不窮，對(duì)于流感病毒致病機(jī)理和感染規(guī)律的研究有著巨大的推動(dòng)作用。對(duì)于一些傳染性強(qiáng)、致死率高的流感病毒來說，假病毒的構(gòu)建消除了其存在的安全隱患，以其優(yōu)良的安全性和穩(wěn)定性為病毒致病機(jī)理的研究和疫苗的研發(fā)提供了有效的技術(shù)手段。
　　在生物學(xué)研究領(lǐng)域最常用的分子影像學(xué)方法是熒光分子成像（Fluorescence）和生物發(fā)光成像（Bioluminesce

2、nce）兩大類。熒光分子成像技術(shù)和生物發(fā)光成像技術(shù)它們都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)：生物發(fā)光無自發(fā)熒光,特異性強(qiáng)，靈敏度高，能夠精確定量，但信號(hào)較弱，檢測(cè)時(shí)間較長，要求高，實(shí)驗(yàn)成本高；熒光分子成像信號(hào)強(qiáng)度高，成像速度快，實(shí)驗(yàn)成本低，能夠保持研究的連貫性，但檢測(cè)深度受限制，較難精確體內(nèi)定量。本實(shí)驗(yàn)選用了其中的綠色熒光蛋白Green fluorescent protein（GFP）和Gaussia熒光素酶Gaussia luciferase（Gluc）

3、同時(shí)用于分子成像，綜合了兩者優(yōu)勢(shì)的同時(shí)彌補(bǔ)了彼此的不足。
　　H5N1禽流感屬高致病性流感病毒，傳播快，病死率高。對(duì)于高致病性的病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究需要在高等級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，增加了實(shí)驗(yàn)的成本和難度，H5N1假病毒的構(gòu)建克服了其生物安全問題，在低等級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室即可完成相關(guān)病毒實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)H5N1假病毒的構(gòu)建為H5N1病毒致病性的研究和抗病毒藥物研制及篩選提供了一種安全有效的技術(shù)手段。
　　本課題根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道合成 sp

4、lit-GFP基因，分別構(gòu)建含 G1-10與 G11的pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒并通過熒光觀察驗(yàn)證其相互作用。然后通過融合PCR技術(shù)將Gluc基因與G11基因通過Linker連接并插入到pcDNA3.1上，與G1-10表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞上清中Gluc熒光素酶的活性，并進(jìn)行GFP熒光觀察。為了更方便對(duì)病毒進(jìn)行細(xì)胞水平的觀測(cè)和篩選，利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá) G1-10的 MDCK細(xì)胞系，再向細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染 G11質(zhì)粒，

5、通過 RFP標(biāo)記和嘌呤霉素的抗性對(duì)細(xì)胞系以及 GFP活性進(jìn)行篩選與驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gluc-G11與 G1-10質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞能夠發(fā)出明亮的綠色熒光，上清中熒光素的活性也較高。在此基礎(chǔ)上，建立的 G1-10 MDCK細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)出G1-10，用G11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系后，可檢測(cè)到GFP熒光。本課題成功構(gòu)建的含Gluc-GFP的雙標(biāo)記系統(tǒng)，為在細(xì)胞和活體水平研究病毒致病機(jī)制提供了技術(shù)手段。
　　本課題應(yīng)用構(gòu)建好的含H5N1