對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)滅活制劑及多糖對(duì)克氏原螯蝦抗WSSV作用的研究.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）是對(duì)全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)危害最大，傳播最廣的病毒之一，尤其是對(duì)中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了毀滅性的打擊，至今已經(jīng)造成了數(shù)十億美元的損失。但目前尚無(wú)行之有效的防治手段，因此尋找預(yù)防和控制該病毒病一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。許多研究結(jié)果表明WSSV囊膜蛋白可以誘導(dǎo)甲殼動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)WSSV的抵抗力，從而大幅提高WSSV攻毒后的成活率。多糖（如葡聚糖、殼聚糖、甲殼素）也被認(rèn)為能提高甲殼動(dòng)物的免疫力，并被廣泛用于提高甲殼動(dòng)物抗細(xì)菌性和病

2、毒性疾病的研究。
　　 本研究從制作WSSV滅活制劑著手，經(jīng)口服途徑免疫克氏原螯蝦，進(jìn)行主動(dòng)免疫保護(hù)克氏原螯蝦抗WSSV感染的效果試驗(yàn)，并初步研究WSSV滅活制劑的保護(hù)作用機(jī)理。同時(shí)在螯蝦飼料中添加不同比例（5mg/g、10mg/g、15mg/g）的三種多糖（殼聚糖、甲殼素、葡聚糖），研究多糖對(duì)克氏原螯蝦抗WSSV感染的影響。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：1 BEI滅活WSSV制劑（BIW）的研制
　　 應(yīng)用雙乙烯亞胺（Bin

3、ary Ethyleneimine，BEI）滅活WSSV，經(jīng)螯蝦肌肉注射試驗(yàn)證實(shí)白斑綜合征病毒（WSSV）在2mM BEI，37℃下處理24h可以被完全滅活，注射試驗(yàn)表明死亡率為零，同時(shí)PCR檢測(cè)也表明受試螯蝦沒(méi)有感染W(wǎng)SSV，結(jié)果表明BEI滅活WSSV制劑（BIW）對(duì)于螯蝦是安全的。
　　 對(duì)BEI滅活WSSV的PCR檢測(cè)證明了BEI的作用是破壞病毒的DNA分子，雖然掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)WSSV粒子的囊膜表面有輕微的變化，但是SD

4、S-PAGE分析說(shuō)明結(jié)構(gòu)蛋白的基本組成幾乎沒(méi)有改變，在滅活后WSSV的主要囊膜蛋白VP19、VP28、VP281、VP38A、VP51B和VP110等條帶均清晰可辨，說(shuō)明BEI的滅活作用對(duì)WSSV的囊膜蛋白基本無(wú)損壞影響，從而保持了其誘導(dǎo)甲殼動(dòng)物抗白斑綜合征的能力。2口服BIW誘導(dǎo)螯蝦抗白斑綜合征效果的研究
　　 結(jié)果表明口服BIW能顯著提高克氏原螯蝦攻毒后的相對(duì)存活率。不同次數(shù)口服免疫試驗(yàn)表明，隨著口服BIW次數(shù)的增多，螯蝦對(duì)

5、WSSV的抵抗力也相應(yīng)增強(qiáng)，但隨著口服次數(shù)增多差異也越小，結(jié)果顯示口服三次BIW就可以誘導(dǎo)螯蝦對(duì)WSSV產(chǎn)生較強(qiáng)的抵抗力?？诜蜝IW后，螯蝦在第7、14、21、28天攻毒的相對(duì)存活率RPS分別為70％、53％、38％和20％，均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。但是口服BIW螯蝦的死亡率隨著攻毒時(shí)間的推后也持續(xù)的升高，存活率隨之下降，在14天之內(nèi)口服BIW的螯蝦可以保持50％以上的存活率。
　　 口服BIW的螯蝦在口服結(jié)束后第

6、一天血清酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶活力和溶菌酶活力均有一定程度的提高，但差異不顯著（P＞0.05）；口服BIW結(jié)束后第七天四種酶活力水平有顯著的提高（P<0.05），后逐步下降，至第4周基本與對(duì)照組無(wú)明顯差異。PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病死螯蝦的肝胰腺、中腸、肌肉、鰓、性腺、心臟六種組織的PCR結(jié)果均為WSSV陽(yáng)性，而口服BIW螯蝦的各組織檢測(cè)結(jié)果均為陰性。光鏡和電鏡觀察也證實(shí)了這一點(diǎn)，病死螯蝦的肝胰腺、中腸、肌肉、鰓、性腺、心臟等組織均發(fā)

7、生了不同程度的病變，而口服BIW螯蝦的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)與健康螯蝦無(wú)明顯差異。3 BIW誘導(dǎo)螯蝦抗白斑綜合征機(jī)理的研究
　　 口服BIW的螯蝦，在口服結(jié)束后第7天和第21天后攻毒存活率均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），相對(duì)存活率分別為60％和42％，而口服熱滅活WSSV的相對(duì)存活率僅為10％和5％。注射BIW的螯蝦在免疫結(jié)束第7天和21天后攻毒存活率均顯著高于對(duì)照組，相對(duì)存活率分別為75％和60％。而注射熱滅活WSSV的相對(duì)存活率僅為

8、10％和5％。另外，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在BEI滅活WSSV的囊膜表面僅有輕微的變化，而熱滅活WSSV的囊膜則幾乎從核衣殼上脫落，說(shuō)明BEI滅活對(duì)WSSV囊膜的影響要比熱滅活小的多。SDS-PAGE也證明了這一點(diǎn)，BEI滅活WSSV可見(jiàn)VP19、VP28、VP281等囊膜蛋白條帶都十分清晰，而熱滅活WSSV則未見(jiàn)清晰的條帶。對(duì)照攻毒試驗(yàn)說(shuō)明WSSV滅活制劑所提供的保護(hù)作用是與滅活WSSV囊膜蛋白密切相關(guān)的。4多糖添加劑對(duì)克氏原螯蝦抗WSSV影響

9、的研究
　　 在蝦飼料中添加不同比例（5mg/g、10mg/g、15mg/g）的三種多糖（殼聚糖、甲殼素、葡聚糖），連續(xù)投喂20天以后口服攻毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陽(yáng)性對(duì)照相比，殼聚糖組5mg/g,10mg/g和15mg/g三個(gè)濃度的相對(duì)存活率分別為25％、40％和25％；甲殼素組三個(gè)濃度的相對(duì)存活率分別為5％、15％和15％；葡聚糖組三個(gè)濃度的相對(duì)存活率分別為20％、25％和30％。其中以10mg/g殼聚糖組的保護(hù)作用最好，15mg/

10、g葡聚糖組次之，相對(duì)存活率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。但同種多糖添加劑不同濃度的相對(duì)存活率之間卻無(wú)顯著差異（P>0.05）。酶活力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，殼聚糖、甲殼素、葡聚糖對(duì)螯蝦酶活力的提高作用以葡聚糖最好，殼聚糖次之，甲殼素則較差。而10mg/g殼聚糖組的酶活力水平相對(duì)較高，與該組較高的存活率相一致。結(jié)果表明，上述四種酶活力水平可能與螯蝦抗WSSV的能力有一定的相關(guān)性。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，2mM雙乙烯亞胺（BEI）對(duì)WSSV有確切的

11、滅活效果，BEI滅活的WSSV經(jīng)PCR檢測(cè)和SDS-PAGE分析表明，BEI破壞了病毒的DNA，而對(duì)WSSV的囊膜蛋白無(wú)損壞影響，保持了其誘導(dǎo)甲殼動(dòng)物抗白斑綜合征的能力。三次可使螯蝦對(duì)WSSV產(chǎn)生較強(qiáng)的抵抗力，在14天之內(nèi)攻毒可以保持50％以上的存活率，且螯蝦血清酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶活力、溶菌酶活力均顯著提高。通過(guò)光鏡和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，口服BEI滅活WSSV攻毒后存活螯蝦的肝胰腺、中腸、肌肉、鰓、性腺、心臟六種組織均未感染W(wǎng)SSV