Cecropin AD在畢赤酵母中的組成型表達及對斷奶仔豬生長性能的影響.pdf

1、抗菌肽CecropinAD是人工合成的由CecropinA的N端1～11肽段和CecropinD的C端12～37肽段組成的雜合肽。本試驗的目的是利用組成型表達方法在畢赤酵母SMD1168菌株表達抗菌肽CecropinAD，探討優(yōu)化發(fā)酵重組SMD1168菌株的條件，并研究抗菌肽CecropinAD對斷奶仔豬生長性能的影響。主要從以下幾方面進行研究:
　　 1抗菌肽CecropinAD在畢赤酵母中的組成型表達
　　 利用化學(xué)

2、方法合成編碼抗菌肽CecropinAD的基因片段SH，并進行PCR擴增?；蚱蜸H與表達載體pGAPZa-A經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切后連接構(gòu)建為重組表達質(zhì)粒pGAPZa-ASH。經(jīng)過鑒定并測序正確后將pGAPZa-ASH電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母SMD1168中，通過Zeocin抗性篩選陽性重組畢赤酵母工程菌。Tricine-SDS-PAGE分析表明在3.0KD處有目的條帶，并且表達產(chǎn)物抗菌肽CecropinAD有生物活性。20μL濃縮10倍

3、的表達上清液對E.coliDH5α的抑菌直徑可達到17.5mm，小于20μLAmp（100μg/mL）相應(yīng)的抑菌直徑(20.5mm)。外源基因在酵母中的穩(wěn)定性很高。重組酵母與其受體菌的生長曲線相近。試驗結(jié)果表明，用組成型表達方法在畢赤酵母菌株成功表達了抗菌肽CecropinAD并且其基因片段SH的插入對酵母菌的生長規(guī)律影響不顯著。
　　 2抗菌肽CecropinAD小規(guī)模發(fā)酵主要參數(shù)的優(yōu)化
　　 按表達手冊進行表達試驗，

4、從發(fā)酵液pH、溶氧和補料等方面優(yōu)化重組畢赤酵母SMD1168的主要發(fā)酵參數(shù)。采用優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)進行發(fā)酵，對上清液TCA沉淀純化后以Tricine-SDS-PAGE鑒定。優(yōu)化后的重組畢赤酵母SMD1168發(fā)酵主要參數(shù):發(fā)酵液pH5.5，溶氧30％～40％，補料采用變速流加方式。發(fā)酵周期為60h，上清液中CecropinAD的表達量為225mg/L，CecropinAD占表達總蛋白量的26％。發(fā)酵液離心后的上清液占總發(fā)酵液體積的70％。

5、r>　　 3抗菌肽CecropinAD對斷奶仔豬生長性能的影響
　　 試驗選取體重約10kg的杜×大×長三元雜交斷奶仔豬300頭，采用單因子完全隨機區(qū)組設(shè)計，分為對照組、抗生素組、試驗1組、試驗2組、試驗3組，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)10頭豬，研究畢赤酵母組成型表達的抗菌肽對斷奶仔豬生長性能的影響。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，抗生素組在基礎(chǔ)日糧中添加10％的硫酸抗敵素300mg/kg和10％的桿菌肽鋅1500mg/kg，試驗1組、試

6、驗2組、試驗3組分別在基礎(chǔ)日糧中添加抗菌肽CecropinAD10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg。試驗結(jié)果表明，與對照組相比，日糧中添加抗生素或抗菌肽有提高斷奶仔豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率的趨勢，但沒達到顯著差異（P＞0.05）;試驗各組仔豬的腹瀉率均顯著低于對照組（P＜0.05），表明抗菌肽CecropinAD可以達到與抗生素類似的防腹瀉效果。綜合考慮仔豬的生長性能和腹瀉指數(shù)，以添加10mg/kgCecropinAD效果最佳。