豬Lipin和FIT基因的克隆與組織分布.pdf

1、脂肪誘導轉錄物（FIT）和Lipin都是與脂肪代謝有關的基因，F(xiàn)IT是對脂肪組裝成脂滴起關鍵作用的基因，是內質網(wǎng)膜蛋白，參與脂類代謝的氧化作用。Lipin是一種關鍵的脂肪調節(jié)酶，作為蛋白質在哺乳動物細胞中調節(jié)脂肪代謝。 為了研究Lipin和FIT蛋白的生物學功能，本試驗以EST片段為基礎，利用同源序列克隆原理設計引物，對豬各種組織提取的總RNA進行RT-PCR，通過RT-PCR技術克隆得到FIT（FIT1和FIT2）和Lipin

2、（Lipin1，2和3）的cDNA序列，利用生物信息學工具預測其相關生物學性質，并對其組織進行分布初探，試驗分兩個系列。 一、豬Lipin蛋白家族的克隆和組織分布。 Lipin1基因包含一個完整的開放閱讀框架（open reading frame，ORF）為2-2686bp，全長為2692bp，由894個氨基酸殘基組成，其中酸性氨基酸為189個，堿性氨基酸為122個，分子量為98．91kDa，等電點為6．40。結構域預測

3、含有LNS2結構域，位置在678-834aa，核定位NLS預測含有“KKRRKRRRK”結構，含有HAD-樣結構域“DIDGT”催化模序，Lipin1基因與小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分別為82．8％、85．0％、82．8％，預測的氨基酸序列與小鼠、人和大鼠的同源性分別為88．8％、89．9％和88．7％。 Lipin2基因全長為2693bp，ORF為11-2686bp，由891個氨基酸殘基組成，其中酸性氨基酸為190個，

4、堿性氨基酸為126個，分子量為98．89kDa，等電點為5．32。LNS2結構域位置在680-836aa，核定位NLS預測含有“KKKKRRRKK”結構，含有HAD-樣結構域“DIDGT”催化模序，Lipin2基因與小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分別為83．0％、86．7％、82．9％，預測的氨基酸序列的同源性分別為87．4％、90．3％和87．4％。 Lipin3基因變體1全長為2872bp，ORF為149-2728bp，

5、由859個氨基酸殘基組成，其中酸性氨基酸為165個，堿性氨基酸為105個，分子量為93．59kDa，等電點為5．42。LNS2結構域位置在648-804aa，核定位NLS預測含有“KKKRRRRKPRRKE”結構，含有HAD-樣結構域“DIDGT”催化模序，Lipin3基因變體1與小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分別為75．6％、83．4％、78．6％，預測的氨基酸序列的同源性分別為75．9％、81．6％和77．4％。變體2全長為28

6、48bp，ORF為149-2704bp，由851個氨基酸殘基組成，其中酸性氨基酸為163個，堿性氨基酸為104個，分子量為92．74kDa，等電點為5．42。LNS2結構域位置在640-796aa，核定位NLS預測含有“KKKRRRRKPRRKE”結構，含有HAD-樣結構域“DIDGT”催化模序，變體2與小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分別為75．6％、83．2％、78．5％，預測的氨基酸序列的同源性分別為76％、80．9％和77．4

7、％。 組織分布結果顯示：Lipin1在脾、肺、腎、膀胱、大腦、小腦、胃、空腸、肌肉和脂肪等多種組織中都有分布，而Lipin2和Lipin3僅在脾、肺、回腸和肌肉中有分布。 二、豬FIT蛋白家族的克隆和組織分布。 利用同源序列克隆原理設計克隆引物，對豬各種組織提取的總RNA進行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后轉化Ecol．JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、測序，并進行序列分析，克隆的豬FIT1

8、基因包含完整的開放閱讀框架，長為1310bp，ORF為400-1272bp，編碼290個氨基酸，其中酸性氨基酸為22個，堿性氨基酸為39個，分子量為32．17kDa，等電點為10．47，信號肽為1～35aa，含有6個跨膜結構域。豬FIT1的核酸序列與人、牛、大鼠和小鼠的同源性分別為92．1％、93．2％、87．4％和88．1％，氨基酸序列的同源性分別為97．2％、96．6％、94．8％和95．5％，為進一步研究FITI的生物學功能奠定了

9、基礎。 克隆的豬FIT2基因包含完整的開放閱讀框架，長為1776bp，ORF為82-870bp，編碼262個氨基酸，其中酸性氨基酸為28個，堿性氨基酸為31個，分子量為29．64kDa，等電點為8．91，信號肽為1～30aa，含有4個跨膜結構域。FIT2的核酸序列與小鼠、大鼠和人的同源性分別為85．0％、85．7％和88．1％，氨基酸序列的同源性分別為87．4％、87．4％和92．0％，為進一步研究FIT2的生物學功能奠定了基礎