聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學(xué) 號(hào) 10101001 </p><p>　　分 類 號(hào) Q81 </p><p><b>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</b></p><p>　　聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響

2、</p><p><b>　　2014年5月</b></p><p>　院（系）名稱生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院</p><p>　專業(yè)名稱生物工程</p><p>　學(xué)生姓名范 睿</p><p>　指導(dǎo)教師牛旭鋒</p><p><b>　　北京航空航天大學(xué)</

3、b></p><p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書(shū)</p><p>　?、瘛厴I(yè)設(shè)計(jì)（論文）題目：</p><p>　　聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響。 </p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）使用的原

4、始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計(jì)技術(shù)要求：</p><p>　　使用的原始數(shù)據(jù)來(lái)源于相關(guān)科技文獻(xiàn)，其中包括了制備膠原海綿的相關(guān)內(nèi)容、聚己內(nèi)酯支架性質(zhì)研究的相關(guān)內(nèi)容、聚己內(nèi)酯支架與膠原結(jié)合的相關(guān)內(nèi)容、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子性質(zhì)檢測(cè)方法相關(guān)內(nèi)容、HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)方法相關(guān)內(nèi)容。技術(shù)要求是制備膠原和海綿并使其附著于聚己內(nèi)酯支架內(nèi)表面（支架已存在）。 </p><p>　?、?、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）工作內(nèi)容：</p

5、><p>　　本課題研究?jī)?nèi)容主要包括：第一部分是支架的膠原化。聚己內(nèi)酯支架并不具有生物活性，且對(duì)于生長(zhǎng)因子的吸附性能也不盡人意。有大量的研究顯示膠原海綿經(jīng)常作為各種生長(zhǎng)因子的載體，并且具有很好的細(xì)胞吸附性。對(duì)于支架的膠原化主要采用方法為冷凍干燥法，即通過(guò)冷凍干燥膠原懸浮液來(lái)制得。由冷凍干燥獲得的膠原海綿的孔隙結(jié)構(gòu)屬于冰晶結(jié)構(gòu)。在冷凍干燥過(guò)程中，水分的升華引起膠原聚集物分子間的交聯(lián)作用。主要造作過(guò)程為將膠原溶液或凝膠在

6、－80℃－75℃冷凍12小時(shí)，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24小時(shí)后則形成膠原海綿。在不同文獻(xiàn)中提到的制備膠原海綿的冷凍時(shí)間有所差別（12小時(shí)、8小時(shí)或者5小時(shí)等），冷凍干燥機(jī)的真空壓力也不盡相同。此方法步驟簡(jiǎn)單，操作較方便，不混入化學(xué)雜質(zhì)。但是缺點(diǎn)是膠原海綿交聯(lián)程度一般，力學(xué)強(qiáng)度低。</p><p>　　第二部分是人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在支架上的接種研究。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)相比于癌細(xì)胞要困難很多，其要求更優(yōu)越的

7、環(huán)境以及更嚴(yán)格的無(wú)菌操作。將細(xì)胞接種在支架上需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定接種數(shù)量，以及讓細(xì)胞吸附在支架上的最少時(shí)間等關(guān)鍵因素。</p><p>　　第三部分則是檢測(cè)VEGF對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響。此實(shí)驗(yàn)需要將支架上加載血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子并將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于其上，培養(yǎng)一段時(shí)間通過(guò)MTS方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 　　　　　　　　　　　　

8、 Ⅳ、主要參考資料：</p><p>　　[1] Xiao C, Zhou H, Liu G, et al. Bone marrow stromal cells with a combined expression of BMP-2 and VEGF-165 enhanced bone regeneration[J]. Biomedical Materials, 2011, 6(1): 015013.<

9、/p><p>　　[2] Young S, Patel Z S, Kretlow J D, et al. Dose effect of dual delivery of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein-2 on bone regeneration in a rat critical-size defect model[

10、J]. Tissue Engineering Part A, 2009, 15(9): 2347-2362.</p><p>　　[3] Patel Z S, Young S, Tabata Y, et al. Dual delivery of an angiogenic and an osteogenic growth factor for bone regeneration in a critical siz

11、e defect model[J]. Bone, 2008, 43(5): 931-940. </p><p>　　生物與醫(yī)學(xué)工程 院（系） 生物工程 專業(yè)類 101011 班</p><p>　　學(xué)生 范

12、睿 </p><p>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）時(shí)間：自 2014 年 1 月 8 日至 2014年 5月 31 日</p><p>　　答辯時(shí)間： 年 月 日 成績(jī) </p><p>　　指導(dǎo)教師： 牛旭鋒 </p><p>　　兼職教師或答

13、疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分）：</p><p><b>　　無(wú)</b></p><p>　　教研室主任 </p><p>　　注：任務(wù)書(shū)應(yīng)該附在已完成的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的首頁(yè)。</p><p><b>　　本人聲明</b></p><p>　

14、　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，在完成論文時(shí)所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出。</p><p><b>　　作者：范睿</b></p><p><b>　　簽字：</b></p><p>　　時(shí)間： 2014 年 5 月</p><p>　　聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾

15、及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響</p><p>　　學(xué) 生：范 睿</p><p><b>　　指導(dǎo)教師：牛旭鋒</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　在組織工程中聚己內(nèi)酯多孔支架受到了高度的關(guān)注，但是因?yàn)槿狈ι锘钚运韵拗屏似浜芏喾矫娴膽?yīng)用。本研究的

16、目的是對(duì)聚己內(nèi)酯多孔支架進(jìn)行生物功能化的修飾，并檢測(cè)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響。應(yīng)用冷凍干燥法制備膠原海綿，并設(shè)計(jì)支架膠原化方法使得支架內(nèi)部和表面填充膠原海綿。利用掃描電鏡對(duì)支架孔隙和外表面進(jìn)行檢測(cè)，從而確定膠原化方法可行性。將50μL濃度為 0.1μg/μL的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子加載在支架上后，發(fā)現(xiàn)其可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但是用量為50μL 0.02μg/μL的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子不能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。所以此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明聚己內(nèi)酯多孔支架在體外

17、經(jīng)膠原化并加載5μg血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子后可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，證明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子仍具有生物活性，而過(guò)低濃度的生長(zhǎng)因子則不會(huì)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力產(chǎn)生影響。</p><p>　　關(guān)鍵詞：聚己內(nèi)酯多孔支架、膠原化、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、細(xì)胞增殖</p><p>　　Bioactive functionalization of porous poly(ε-caprolactone) scaffold a

18、nd its effect on proliferation of endothelial cells</p><p>　　Author: Rui Fan</p><p>　　Tutor: Xufeng Niu</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Poly(ε-caprolacton

19、e) (PCL) has received considerable attention in tissue engineering. However, the lack of bioactivity of PCL limits its application. The aim of this study was to functionalize the porous PCL scaffold with bioactivity and

20、to investigate its effect on the proliferation of endothelial cells (ECs). Freeze drying method was used to make collagen sponge. Scanning electron microscope (SEM) measurement demonstrated the porous PCL scaffold was su

21、ccessfully coated with collagen sponge ins</p><p>　　Key words: Poly(ε-caprolactone), collagen sponge, vascular endothelial growth factor, proliferation</p><p><b>　　1緒論</b></p>

22、<p><b>　　1.1課題背景</b></p><p>　　現(xiàn)在骨支架材料被大量的應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究，希望應(yīng)用工程設(shè)計(jì)的骨支架替代物尋求骨的再生，從而減少自體移植和同種異體移植的治療方法[1]。從現(xiàn)在的研究顯示小面積骨缺損中，利用支架材料使缺損愈合的恢復(fù)性良好，使人們對(duì)臨床骨修復(fù)充滿信心。但是大面積骨缺損的治療主要還是依賴于自體移植，骨支架并不能起到有效作用，其主要原因是大面積的

23、骨支架在移植到骨缺損部位后因營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足導(dǎo)致支架部位骨生長(zhǎng)速度緩慢并且生長(zhǎng)后的骨會(huì)發(fā)生壞死，其次大面積的骨支架移植更容易引起生物相容性問(wèn)題[2]。另外一個(gè)有前景的治療方法則是自體內(nèi)預(yù)先構(gòu)建骨支架即異位成骨，所以為了使異位成骨的骨量可以在短期內(nèi)有較好的結(jié)果，需要著重于支架的生物功能化。在支架上僅添加促骨生長(zhǎng)因子經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后得到結(jié)果一般，為了進(jìn)一步優(yōu)化短期內(nèi)骨的生成量，則需要其它生物因子的配合。生長(zhǎng)因子的相互配合應(yīng)最大化的符合其在人體內(nèi)的生

24、理狀況，經(jīng)長(zhǎng)期研究表明，骨組織的生長(zhǎng)過(guò)程極其復(fù)雜，其中伴隨多種生長(zhǎng)因子的分泌與釋放。現(xiàn)在被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的是骨生長(zhǎng)過(guò)程中血管的生長(zhǎng)發(fā)生是必不可少的環(huán)節(jié)，血管的發(fā)生可以促進(jìn)骨的生長(zhǎng)，二者的作用相輔相成，這一點(diǎn)在組織工程中也漸漸受到重視[3,4]</p><p>　　圖1.1 生理骨修復(fù)過(guò)程示意圖 （a）血腫形成（在受傷后，受傷的血管組織很快形成血腫）；（b）軟骨痂的形成（在破損血管的部位會(huì)有心血管生成，也稱血管發(fā)生

25、。同時(shí)伴有外骨痂和內(nèi)骨痂的形成，形成外骨痂的過(guò)程稱為膜內(nèi)成骨，內(nèi)骨痂也稱為纖維軟骨）；（c）硬骨痂形成（骨痂進(jìn)行礦化，形成編織骨的硬骨痂）；（d）骨重建（大面積的骨痂由二次板層骨代替，血管供應(yīng)恢復(fù)正常）</p><p>　　在這個(gè)雙因子釋放系統(tǒng)中聚己內(nèi)酯（Poly(ε-caprolactone)，PCL）具有較高力學(xué)強(qiáng)度，可降解，而且容易加工成復(fù)雜的具有合理孔隙度的3D結(jié)構(gòu)。所以這種支架材料在組織工程中受到了很大

26、的關(guān)注，尤其是在骨再生方向。然而PCL并不是一個(gè)具有骨誘導(dǎo)能力的生物材料，這也是PCL的限制性[1]。</p><p>　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生且調(diào)節(jié)血管的發(fā)展[5,6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，此因子可以協(xié)助早期骨生長(zhǎng)并促進(jìn)支架上骨的進(jìn)一步生長(zhǎng)。受體VEGFR-2主要作用是與VEGF作

27、用后促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增值，VEGFR-1的功能研究的并不清楚，但有研究稱其可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)方向，向著管狀結(jié)構(gòu)發(fā)展，VEGF各個(gè)受體作用功能如圖1.2[10]。將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子加載在支架材料上可以為沒(méi)有生物活性的材料增添生物活性，在體內(nèi)移植后可以促進(jìn)局部血管的生成從而輔助骨的生成。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞重要的促細(xì)胞分裂劑，在血管發(fā)生中其最重要的作用也是被人們研究最多的作用則是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增值。VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞受體VEGFR-2相互作用

28、可以影響內(nèi)皮細(xì)胞的增值能力，所以為了檢測(cè)VEGF在體外的生物活性，現(xiàn)在最常用的方法則是檢測(cè)VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響。另外一個(gè)方法則是觀察內(nèi)皮小管的形成，因?yàn)閂EGF還可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的排布趨向，可以使其向管狀結(jié)構(gòu)發(fā)展[7-11]。</p><p>　　圖1.2 VEGF受體作用功能示意圖[10]</p><p>　　膠原海綿經(jīng)常作為各種生長(zhǎng)因子的載體，并且具有很好的細(xì)胞吸附性，降解

29、速度較快，經(jīng)常與不具有生物活性的材料結(jié)合作為復(fù)合生物材料，并加載生長(zhǎng)因子使材料具備一定的生物活性[12]。</p><p>　　雙因子釋放系統(tǒng)的研究并不是很廣泛，支架載體種類主要為聚己內(nèi)酯支架和聚乳酸支架，加載因子主要是促骨生長(zhǎng)因子和促血管生長(zhǎng)因子，研究最多的則是BMP-2和VEGF，兩種因子經(jīng)常為混合后再加載到支架上。實(shí)驗(yàn)顯示，雙因子釋放系統(tǒng)中有很多因素可以影響移植后骨生成量，如運(yùn)載載體的材料、生長(zhǎng)因子的劑量比

30、和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所用的動(dòng)物模型等[12-18]。</p><p>　　此雙因子釋放系統(tǒng)應(yīng)用于異位成骨研究，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)將其植入到小鼠皮下組織對(duì)骨生成量進(jìn)行觀察，從而確定VEGF與BMP-2相結(jié)合是否會(huì)在短期內(nèi)增加骨的生成量。如若骨量有較明顯的變化則會(huì)進(jìn)一步對(duì)雙因子釋放系統(tǒng)進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步研究雙因子釋放系統(tǒng)的作用機(jī)制。</p><p>　　1.2研究目的和意義</p>&l

31、t;p>　　以上述研究背景為基礎(chǔ)，整體實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑樵O(shè)計(jì)雙因子釋放系統(tǒng)以促進(jìn)異位早期骨生成量。設(shè)計(jì)分為兩大部分，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)主要包括對(duì)兩種生長(zhǎng)因子的結(jié)合釋放動(dòng)力學(xué)的研究以及兩種生長(zhǎng)因子分別在支架上生物活性的檢測(cè)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要包括檢測(cè)雙因子釋放系統(tǒng)植入到小鼠皮下4-8周后的骨生成量、血管生長(zhǎng)情況、以及軟骨生長(zhǎng)情況，并與單因子釋放的支架相比較這些指標(biāo)。簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖如下所示：</p><p>　　表1.

32、1 整體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)</p><p>　　我的畢設(shè)實(shí)驗(yàn)是此實(shí)驗(yàn)中的一部分（字體加粗部分）。將VEGF加載到空白支架上后需要檢測(cè)其是否還具有生物活性，若其仍具有生物活性那么在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)才是有參考價(jià)值的。判斷VEGF的生物活性需要檢測(cè)幾個(gè)指標(biāo)，而檢測(cè)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響是最常用也最有說(shuō)服力的檢測(cè)方法。所以我畢設(shè)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪菍?duì)PCL支架表面功能化，并檢測(cè)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響。</p>

33、<p>　　1.3國(guó)內(nèi)外研究狀況</p><p>　　針對(duì)雙因子釋放系統(tǒng)和本實(shí)驗(yàn)所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，我對(duì)進(jìn)幾年左右的文獻(xiàn)進(jìn)行了整理，并總結(jié)如下。</p><p>　　1.3.1雙因子釋放系統(tǒng)的研究</p><p>　　現(xiàn)在每年有超過(guò)6.2×106的骨折病例產(chǎn)生，這其中有5-10%的病例中的患者會(huì)在治療過(guò)程中因?yàn)橹委煼椒ú划?dāng)或不及時(shí)最后導(dǎo)致骨折不

34、愈合。如果現(xiàn)在不找出一個(gè)有效的方法來(lái)解決這種現(xiàn)狀，患者們的殘疾率將會(huì)大大提升，而他們的生活質(zhì)量也會(huì)降低很多。骨是高度血管化的組織并且血管發(fā)生對(duì)骨再生非常重要，因?yàn)檠芸梢赃\(yùn)輸養(yǎng)分和廢物，為骨的生長(zhǎng)提供支持。骨中血管不足會(huì)導(dǎo)致骨形成和骨量的下降。新血管的形成在骨修復(fù)過(guò)程中會(huì)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，而且實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在一些骨折模型中血管發(fā)生可以促進(jìn)骨的發(fā)生和生長(zhǎng)。所以解決骨再生過(guò)程中血管發(fā)生問(wèn)題是很重要的[19]。</p&

35、gt;<p>　　血管生成和骨生成這兩種因子的可控制的釋放系統(tǒng)可以模擬生物體內(nèi)骨修復(fù)過(guò)程，VEGF是一種重要的促血管生長(zhǎng)因子，在骨修復(fù)中的膜內(nèi)和軟骨內(nèi)成骨都有很重要的作用。BMP-2是促骨生長(zhǎng)因子，在異位和原位成骨的應(yīng)用都很廣泛。經(jīng)調(diào)研文獻(xiàn)它曾被用在大鼠，兔子和狗的骨折位置和缺陷處以檢測(cè)其對(duì)骨生成的影響。大部分雙因子釋放系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)是在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的，研究此系統(tǒng)在原位骨生成中的作用，使用的動(dòng)物模型多為臨界缺陷（critica

36、l size defects， CSDs）骨折模型。CSDs是一種臨界體積的骨缺陷，當(dāng)骨達(dá)到這種缺陷的尺寸后，其再生時(shí)不能通過(guò)自我調(diào)節(jié)生成足夠的骨量而彌補(bǔ)缺陷的距離。大部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雙因子釋放系統(tǒng)相比較于單因子的應(yīng)用可以促進(jìn)一定時(shí)間內(nèi)骨的生成，進(jìn)一步研究稱雙因子釋放系統(tǒng)的作用在于骨修復(fù)的早期，所以雙因子釋放系統(tǒng)可以促進(jìn)骨修復(fù)的速度。Z.S. Patel et al.[19]的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了其設(shè)計(jì)的雙因子釋放系統(tǒng)。VEGF和BMP-2加載到

37、具有明膠微顆粒的聚丙烯酰胺[poly(propylene fumarate),PPF]多孔支架上以制得雙因子釋放系統(tǒng)，檢測(cè)其在8mm臨界大鼠顱骨缺損模型</p><p>　　對(duì)于雙因子釋放系統(tǒng)還有少量關(guān)于劑量對(duì)于作用程度的研究。在Young et al.[20]實(shí)驗(yàn)研究中假設(shè)雙因子釋放系統(tǒng)中BMP-2的劑量減少會(huì)導(dǎo)致骨量生成的減少，而這種下降會(huì)因?yàn)樘嵘齎EGF的劑量而得到抑制。在8mm臨界大鼠顱骨缺損模型上進(jìn)行動(dòng)

38、物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BMP-2相比較于VEGF可以更持續(xù)的釋放。降低BMP-2的含量會(huì)降低最終骨的生成量，但是增加VEGF的含量并不能抑制這一趨勢(shì)。在Hernandez et al.[21]的實(shí)驗(yàn)中也進(jìn)行了相關(guān)雙因子釋放系統(tǒng)劑量的研究。此實(shí)驗(yàn)在聚乳酸微球上面加載VEGF（0.35μg和1.75μg）和BMP-2（3.5μg和17.5μg），再將微球加載到聚乳酸支架上，將其植入到兔子的股骨處進(jìn)行原位成骨研究。這樣設(shè)計(jì)的目的是想要控制不同劑量的生長(zhǎng)

39、因子的釋放并保持生長(zhǎng)因子釋放部位始終在缺損部位。在第4周的時(shí)候后幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不同劑量間兩種因子的配合有什么特別的作用，在第12周實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種因子的配合并沒(méi)有起到什么明顯作用。說(shuō)明進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)該優(yōu)化VEGF的劑量、兩種因子的釋放順序以及兩種因子的劑量比以達(dá)到更好的雙因子釋放系統(tǒng)的效果以促進(jìn)骨的再生。</p><p>　　對(duì)于雙因子釋放系統(tǒng)在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)于異位成骨影響的研究也有涉及。主要結(jié)論有之前Kakudo et

40、 al.[22]的研究，將VEGF和BMP-2加載在膠原水凝膠中，使其在異位成骨部位釋放（老鼠的小腿肌肉）。證實(shí)了雙因子釋放系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)組在第3周時(shí)毛細(xì)血管密度和骨生成量比只有單因子BMP-2存在的血管密度和骨生成量要多。</p><p>　　骨再生是一個(gè)受到調(diào)節(jié)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，由多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子所控制。血管生長(zhǎng)因子是在骨修復(fù)過(guò)程早期為了重建血管系統(tǒng)被表達(dá)的，與此同時(shí)促骨生長(zhǎng)因子在骨形成和重塑過(guò)程中一直持續(xù)表達(dá)著

41、。D.H.R. Kempen et al.[23]的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖翘骄咳魧⒋傺苌L(zhǎng)因子VEGF和促骨生長(zhǎng)因子BMP-2有順序的釋放，是否能促進(jìn)骨的生成（相比較于只釋放BMP-2的系統(tǒng)）。實(shí)驗(yàn)將各實(shí)驗(yàn)組植入到大鼠體內(nèi)（包括異位成骨和原位成骨的研究）。經(jīng)檢測(cè)復(fù)合物在前三天VEGF會(huì)大量釋放，BMP-2連續(xù)56天持續(xù)釋放。盡管VEGF并沒(méi)有達(dá)到促進(jìn)骨生成的目的但是在異位成骨的移植中其促進(jìn)了血管網(wǎng)絡(luò)的形成。在原位移植的實(shí)驗(yàn)組中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)血管和骨量

42、的增加（兩類實(shí)驗(yàn)都是與單獨(dú)存在BMP-2的試驗(yàn)組相比較）。</p><p>　　對(duì)于雙因子釋放系統(tǒng)的構(gòu)建方法在一些文獻(xiàn)中也有所提及。Z.S. Patel et al.[19]實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的復(fù)合支架包括明膠微顆粒和多孔聚丙烯酰胺[poly(propylene fumarate),PPF]支架。在明膠微顆粒上分別吸附定量的VEGF或者BMP-2，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的定量和比例將加載有不同生長(zhǎng)因子的明膠顆?；旌喜⒓虞d到支架上，

43、對(duì)照組中明膠顆粒吸附的是PBS。在C Xiao et al.[24]的研究中，在天然珊瑚支架上加載雙因子，加載方法是將VEGF和BMP-2的基因轉(zhuǎn)染到兔子的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中，再將轉(zhuǎn)染后的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞加載在支架上。最后將支架植入到兔子的臨界骨缺損部位進(jìn)而觀察雙因子釋放系統(tǒng)的作用。D.H.R. Kempen et al.[23]實(shí)驗(yàn)中的設(shè)計(jì)更加精細(xì)，因?yàn)閷煞N因子分別分布在復(fù)合支架的不同空間上以達(dá)到兩種因子不同釋放速度的目的。復(fù)合物包括聚

44、乳酸微球，微球上面加載BMP-2，后將微球加載在聚丙烯支架上，聚丙烯支架周?chē)虞d了VEGF的明膠水凝膠，這個(gè)復(fù)合物可以達(dá)到讓兩個(gè)因子不同速度釋放的目的，VEGF首先快速釋放而B(niǎo)MP-2緩慢長(zhǎng)期釋放，如圖1.3。</p><p>　　圖1.3復(fù)合支架示意圖。明膠水凝膠和PPF支架兩個(gè)部分在移植進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)前復(fù)合到一起。</p><p>　　通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，方法和結(jié)果的總結(jié)可知現(xiàn)在雙因子

45、釋放系統(tǒng)的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，其作用的結(jié)果受多種因素影響，如兩種因子的劑量比、加載方式、釋放順序以及實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的動(dòng)物模型。所以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)應(yīng)該尋找雙因子釋放系統(tǒng)的共性并結(jié)合劑量變化進(jìn)一步研究。通過(guò)現(xiàn)象對(duì)雙因子釋放系統(tǒng)進(jìn)行機(jī)制上的研究也是必不可少的一部分。</p><p>　　1.3.2制作膠原海綿</p><p>　　制作膠原海綿的過(guò)程中首先需要純化膠原材料，將其溶解于酸堿度合適的水溶液或者懸浮液

46、中（此步驟對(duì)于膠原纖維的溶脹程度和纖維結(jié)構(gòu)的水解程度有很大影響）。接下來(lái)經(jīng)過(guò)一系列操作使膠原溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原海綿，在這些方法中，最基本的就是冷凍干燥法。另外還有兩種方法化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)可以對(duì)膠原進(jìn)行交聯(lián)并且相比較于冷凍干燥法這兩種方法可以進(jìn)一步加強(qiáng)膠原交聯(lián)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[25]。</p><p><b>　　（1）冷凍干燥法</b></p><p>　　膠原海綿可以通過(guò)

47、冷凍干燥膠原懸浮液來(lái)制得。由冷凍干燥獲得的膠原海綿的孔隙結(jié)構(gòu)屬于冰晶結(jié)構(gòu)。其原因是在冷凍干燥過(guò)程中，水分的升華引起膠原聚集物從而產(chǎn)生分子間的交聯(lián)作用[26]。</p><p>　　主要操作過(guò)程為將膠原溶液或凝膠在－80℃至75℃冷凍12小時(shí)左右使膠原中的水分完全結(jié)成冰晶，在冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24小時(shí)后水分升華，則形成膠原海綿。在不同文獻(xiàn)中提到的制備膠原海綿的冷凍時(shí)間有所差別（12小時(shí)、8小時(shí)或者5小時(shí)等）[27

48、-30]，冷凍干燥機(jī)的真空壓力也不相同，但是根據(jù)樣品容量進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，只要符合原理即可以成功制備膠原海綿[31,32]。</p><p><b>　?。?）化學(xué)交聯(lián)法</b></p><p>　　化學(xué)交聯(lián)物包括醛、?；B氮、碳化二亞胺、聚環(huán)氧樹(shù)脂復(fù)合物等，比如戊二醛就是現(xiàn)在是用途很廣泛的一種醛類交聯(lián)劑。不同的交聯(lián)劑的交聯(lián)原理不同，結(jié)構(gòu)的改變形式也不同，所以使用不同的

49、交聯(lián)劑使得膠原海綿結(jié)構(gòu)穩(wěn)定程度不同，使得穩(wěn)定程度由小到大的試劑順序是：氨腈<二氯乙烷<六亞甲基氨基甲酸二胺<聯(lián)氨<二苯基磷酰基疊氮化物<戊二醛[33]。</p><p>　　經(jīng)總結(jié)文獻(xiàn)，以戊二醛為例主要有兩種操作方法。其一主要操作過(guò)程為：將膠原支架放入100ml 含有0.02%或者0.2%戊二醛的0.05M的醋酸溶液中，實(shí)驗(yàn)條件為4℃，24小時(shí)，之后將處理的膠原海綿放在50mM甘氨酸

50、水溶液中，保持溫度37℃，浸泡1小時(shí)以阻斷未反應(yīng)的戊二醛醛基[34]。</p><p>　　另一種較常用的方法是將膠原海綿用戊二醛蒸氣處理，戊二醛蒸汽是由飽和的25%戊二醛溶液制得，將膠原海綿與蒸汽在37℃下反應(yīng)4小時(shí)。交聯(lián)后，用0.1M甘氨酸水溶液處理海綿阻斷未反應(yīng)的戊二醛醛基[29,30]。</p><p>　　以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的戊二醛化學(xué)交聯(lián)過(guò)程是比較有代表性的，所使用的實(shí)際濃度應(yīng)根據(jù)實(shí)

51、際實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮O(shè)計(jì)進(jìn)一步設(shè)定。</p><p><b>　　（3）物理交聯(lián)法</b></p><p>　　物理交聯(lián)的方法主要包括干熱交聯(lián)處理，紫外線照射和γ射線照射[25]。</p><p>　　最常用的方式是干熱交聯(lián)處理。在處理后用70%乙醇或者環(huán)氧乙烷對(duì)膠原海綿進(jìn)行殺菌處理。</p><p>　　物理交聯(lián)方法應(yīng)注意的是

52、對(duì)生物大分子活性的影響，因?yàn)樵诮?jīng)過(guò)干熱，紫外或者射線處理后大部分生物大分子已經(jīng)變性，如膠原溶液在長(zhǎng)時(shí)間紫外照射后不能再進(jìn)行交聯(lián)，所以應(yīng)該在考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的前提下慎重使用物理交聯(lián)方法[29,30,35]。</p><p>　　1.3.3膠原海綿/凝膠和VEGF</p><p>　　因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)涉及將VEGF加載在膠原海綿上的實(shí)驗(yàn)步驟，所以總結(jié)近期研究，主要有三種膠原與VEGF結(jié)合的方式，包括吸附

53、，共價(jià)連接與混合。</p><p><b>　?。?）吸附法</b></p><p>　　VEGF溶液可吸附在冷凍干燥后的膠原海綿上，如果VEGF水溶液的容量沒(méi)有超過(guò)膠原海綿的最大吸水量，那么其可以完全被冷凍干燥的膠原海綿所吸收。此方法利用膠原海綿吸水性的特征，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行，缺點(diǎn)是不易定量控制VEGF的加載量[34]。</p><p>　　在

54、Kampmann A et al.[36]的實(shí)驗(yàn)中，在有膠原覆蓋的聚乳酸支架上加載VEGF的步驟是將鼠科VEGF164溶于2μl含有1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中。將此溶液逐滴滴到支架上，并在空氣中干燥16－18小時(shí)。</p><p><b>　　（2）共價(jià)交聯(lián)法</b></p><p>　　共價(jià)交聯(lián)法則是利用共價(jià)鍵將VEGF與膠原海綿相連接，VEGF在膠原海綿上穩(wěn)

55、定性較好，其釋放的速度也可以等到較好的控制，但是實(shí)驗(yàn)引入了不同交聯(lián)劑[37,38]。</p><p>　　在Miyagi Y et al.[37]的實(shí)驗(yàn)中，支架浸泡于含有二氯乙烷和N-羥基硫代琥珀酰亞胺的磷酸鹽緩沖液中20分鐘，后將支架在VEGF溶液中浸泡2小時(shí)已達(dá)成共價(jià)交聯(lián)。</p><p><b>　?。?）混合法</b></p><p>

56、　　混合法則指的是膠原溶液于VEGF溶液的混合，即在制備出膠原海綿的同時(shí)VEGF就已經(jīng)存在于膠原海綿中了，此方法可以使得VEGF分布較為平均，但是制備過(guò)程需要嚴(yán)格控制條件避免VEGF的失活。</p><p>　　在Singh S et al.[39]實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)了混合法的操作過(guò)程如下：將人源VEGF165溶液加入到中性膠原溶液中，之后將提前浸濕過(guò)的支架浸泡在混合液中，保持環(huán)境為4℃，過(guò)夜。取出支架后空氣干燥則得到了

57、表面加載有膠原-VEGF的復(fù)合支架。</p><p>　?。?）膠原凝膠和VEGF</p><p>　　應(yīng)用較多的膠原的狀態(tài)有海綿或者凝膠，在一些實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用膠原凝膠作為VEGF的載體，膠原凝膠飽含水分適合細(xì)胞的吸附與生長(zhǎng)，但是膠原凝膠不易定型。</p><p>　　在I. d’Angelo et al.[40]實(shí)驗(yàn)中，使膠原凝膠具有VEGF活性的過(guò)程如下，首先將VE

58、GF溶液加入到未交聯(lián)的膠原溶液中（VEGF的最終濃度是70ng/ml），之后將膠原溶液放入環(huán)境為37℃的溫箱中，24小時(shí)后獲得混合有VEGF的膠原凝膠。</p><p>　　1.3.4具有膠原覆蓋的PCL支架和聚乳酸支架</p><p>　　（1）膠原與聚乳酸支架結(jié)合法</p><p>　　很多實(shí)驗(yàn)是將聚乳酸支架與膠原相結(jié)合，這個(gè)復(fù)合物既具備合成高分子的力學(xué)強(qiáng)度，又

59、具備膠原海綿上生物因子所帶來(lái)的生物活性[28]。</p><p>　　在A. Kampmann et al.[36]實(shí)驗(yàn)中兩者相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：將具有特定結(jié)構(gòu)的聚乳酸支架系在線上，將其在含有0.2%一型鼠尾膠原溶液中浸泡1分鐘，后在空氣中干燥1小時(shí)。此過(guò)程重復(fù)一遍。之后將覆蓋有膠原的支架用PBS清洗1小時(shí)并在空氣中干燥。將其保存在4℃條件下以備使用。</p><p>　　（2）膠原與PC

60、L支架結(jié)合法</p><p>　　膠原與PCL支架相結(jié)合也是很多實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。其中有一個(gè)實(shí)驗(yàn)所提到的結(jié)合方法是：將膠原（0.5μM）和PCL（溶解在冰醋酸中）相互混合并調(diào)節(jié)酸堿度到4.2，混合的摩爾比分別為1：1，1：2，1：3和1：4，在4℃下不斷攪拌。用掃描電鏡觀察所制成復(fù)合物的形貌特征[41]。</p><p>　　1.3.5 VEGF體外生物活性檢測(cè)</p><

61、;p>　　經(jīng)文獻(xiàn)總結(jié)對(duì)于體外檢測(cè)VEGF生物活性的方法主要有兩種，其一是檢測(cè)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響，其二是檢測(cè)其是否能趨使內(nèi)皮細(xì)胞形成內(nèi)皮細(xì)胞小管。</p><p>　　聚乳酸/聚乙二醇微球可以作為生物活性因子的載體，并且此載體可以在一定程度上控制生物因子的釋放，在組織工程中收到重視。在King, T.W et al.[42]的實(shí)驗(yàn)中VEGF作為促血管生成因子被加載到聚乳酸/聚乙二醇微球復(fù)合體系中。實(shí)驗(yàn)

62、中檢測(cè)了VEGF的加載效率、釋放動(dòng)力學(xué)，還有體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，用以檢測(cè)此復(fù)合支架上VEGF的生物活性。經(jīng)檢測(cè)結(jié)果顯示一定量的存在于微球上的VEGF可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，說(shuō)明體外加載在支架上的VEGF具有生物活性。</p><p>　　同樣在Richardson, T.P et al.[43]的實(shí)驗(yàn)中，在一種聚酯支架上添加兩種具有不同釋放動(dòng)力學(xué)的因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子。兩種因

63、子分別在體外進(jìn)行生物活性檢測(cè)，檢測(cè)血小板衍生生長(zhǎng)因子加載后的生物活性應(yīng)用平滑肌細(xì)胞增值檢測(cè)，檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子加載后的生物活性應(yīng)用的方法是內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力檢測(cè)。</p><p>　　同時(shí)還有一種廣泛應(yīng)用的方法用于檢測(cè)VEGF在體外的生物活性，即內(nèi)皮小管形成的實(shí)驗(yàn)。在J.M. Kanczler et al.[44]的實(shí)驗(yàn)中將VEGF利用超臨界二氧化碳萃取的方法加載到多孔聚乳酸支架上。為了檢測(cè)利用超臨界二氧化碳萃

64、取處理的VEGF是否還具有生物活性，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用人工基底膜管形成分析法進(jìn)行檢測(cè)，即在人工基底膜上接種內(nèi)皮細(xì)胞，膜上含有經(jīng)超臨界二氧化碳萃取處理的VEGF。經(jīng)過(guò)16小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)，利用蔡司倒置顯微鏡觀察膜管長(zhǎng)度以及網(wǎng)絡(luò)的形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理VEGF可以使內(nèi)皮細(xì)胞興成小管類似的形狀說(shuō)明VEGF仍具有生物活性，內(nèi)皮細(xì)胞小管形成見(jiàn)圖1.4</p><p>　　圖1.4 內(nèi)皮小管形成圖。A是不加入VEGF的顯微鏡下內(nèi)皮細(xì)

65、胞觀察圖；B是加入VEGF的顯微鏡下內(nèi)皮小管觀察圖；C是經(jīng)加入超臨界二氧化碳萃取處理的VEGF的內(nèi)皮小管的顯微鏡下圖；D是對(duì)三組內(nèi)皮小管長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；E是三組內(nèi)皮小管網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)</p><p>　　2聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾</p><p><b>　　2.1前言</b></p><p>　　聚己內(nèi)酯（Poly(ε-caprolacto

66、ne)，PCL）具有較高力學(xué)強(qiáng)度，可降解，而且容易加工成復(fù)雜的具有合理孔隙度的3D結(jié)構(gòu)。所以這種支架材料在組織工程中受到了很大的關(guān)注，尤其是在骨再生方向。然而PCL并不是一個(gè)具有骨誘導(dǎo)能力的生物材料，這也是PCL的限制性。所以對(duì)支架進(jìn)行生物功能化有很重要的意義。在此實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用的聚己內(nèi)酯多孔支架是一個(gè)長(zhǎng)寬高分別為6.3mm×6.3mm×4mm的多孔支架，如圖2.1。為了達(dá)到令VEGF快速釋放的目的，實(shí)驗(yàn)將支架膠原化并

67、應(yīng)用膠原海綿作為VEGF的載體，通過(guò)文件調(diào)研已知膠原海綿在體內(nèi)的降解時(shí)間為1-2周，而PCL的降解時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1年左右。</p><p>　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生且調(diào)節(jié)血管的發(fā)展，血管的生長(zhǎng)可以促進(jìn)骨的生長(zhǎng)。利用VEGF對(duì)聚己內(nèi)酯多孔支架進(jìn)行生物功能化并且希望此生長(zhǎng)因子可以從支架上

68、較快速的釋放的實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)計(jì)是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)，這個(gè)過(guò)程考慮了整體實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮O(shè)計(jì)，還有應(yīng)用過(guò)程的實(shí)用性和簡(jiǎn)便性，第二部分則是檢測(cè)生長(zhǎng)因子在支架上生物活性的實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　圖2.1 聚己內(nèi)酯多孔支架示意圖。（a）實(shí)驗(yàn)所用支架的結(jié)構(gòu)圖；（b）實(shí)驗(yàn)所用支架的實(shí)物圖</p><p><b>　　2.2實(shí)驗(yàn)部分</b></p><p>

69、<b>　　2.2.1試劑材料</b></p><p>　　聚己內(nèi)酯多孔支架，鼠尾一型膠原蛋白（8.97mg/ml）,Sylgard@184硅橡膠，10×PBS，1M NaOH，超純水等試劑。</p><p>　　2.2.2支架表面修飾方法</p><p>　　1、制備硅膠模具。將兩種試劑按比例10：1混合后倒入容器內(nèi)，除去氣泡后將與

70、支架結(jié)構(gòu)相契合的PCL圓柱體插入液體中，固定好后一并放入烤箱，將烤箱溫度調(diào)整到50℃并維持8小時(shí)。取出盛有模具的容器放在丙酮中浸泡8小時(shí)，目的是將外部塑料溶解，后取出模具。將模具放入70%乙醇中再浸泡8小時(shí)進(jìn)行消毒，取出后空氣干燥。模具如圖2.2。</p><p>　　圖2.2 Sylgard@184硅橡膠模具實(shí)物圖</p><p>　　2、根據(jù)膠原溶液使用說(shuō)明書(shū)配置1.05ml 5mg/

71、ml的膠原中性稀釋液。</p><p>　　配置膠原中性稀釋液過(guò)程中各個(gè)試劑添加順序及計(jì)算公式如下：</p><p>　　（1）首先確定所需制備的膠原中性稀釋液的體積（V）和濃度（C）</p><p>　?。?）加入V1體積的10╳PBS，計(jì)算公式：ml </p><p>　?。?）計(jì)算實(shí)際所需膠原原溶液的體積V2，計(jì)算公式：</p&g

72、t;<p>　?。?）計(jì)算所需1M NaOH體積V3，計(jì)算公式：V2×0.023ml=V3</p><p>　?。?）計(jì)算所需超純水的體積V4，計(jì)算公式：V-V1-V2-V3=V4</p><p>　?。?）將上述體積的各種溶液混合在一起，注意最后添加膠原原溶液，并混合均勻</p><p>　　針對(duì)本實(shí)驗(yàn)具體配置步驟如下：</p>

73、<p>　?。?）首先取105μl 10×PBS溶液放入容器中</p><p>　?。?）加入13μl 1M NaOH 溶液</p><p>　?。?）加入347μl 超純水</p><p>　?。?）加入585μl 8.97mg/ml 膠原溶液</p><p>　?。?）混合均勻，放置在低溫環(huán)境保存以免快速成膠<

74、;/p><p>　　3、用1×PBS浸泡支架2分鐘，取出支架后將其放入模具中。</p><p>　　4、并向支架中分別注射70，80，90μl膠原中性稀釋液。</p><p>　　5、將模具放入37℃溫箱30分鐘，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱8小時(shí)，再放入冷凍干燥機(jī)24小時(shí)，取出后用鑷子將支架取出即獲得膠原化的聚己內(nèi)酯多孔支架。</p><p>

75、　　6、分別配置0.02和0.1μg/μl濃度的VEGF溶液，分別滴注50μl兩種濃度的VEGF溶液在支架上即完成支架表面的修飾。 </p><p>　　2.2.3實(shí)驗(yàn)測(cè)試儀器</p><p>　　掃描電鏡：將膠原化后的支架表面磨平，噴金后進(jìn)行JEOL掃描電鏡不同區(qū)域的檢測(cè)，加速電壓分別為是10kV和20kV。</p><p><b>　　2.3結(jié)果與討論

76、</b></p><p>　　在本階段實(shí)驗(yàn)中的主要實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍?duì)支架進(jìn)行膠原化。實(shí)驗(yàn)中利用冷凍干燥法使支架表面和內(nèi)部形成膠原海綿，通過(guò)掃描電鏡對(duì)膠原化后的支架表面進(jìn)行觀察，沒(méi)有對(duì)支架膠原化的優(yōu)劣進(jìn)行過(guò)多詳細(xì)的檢測(cè)評(píng)價(jià)。</p><p>　　此階段實(shí)驗(yàn)中要分為兩部分，第一部分是掌握膠原海綿的制備方法并確定配置膠原中性稀釋液的濃度。膠原海綿的制備方法較多，其中包括冷凍干燥法、化學(xué)交聯(lián)

77、法和干熱交聯(lián)法等等。選擇冷凍干燥法的原因有二，其一是此制備方法不可以對(duì)支架上已存在的BMP-2的生物活性造成影響（注意，此實(shí)驗(yàn)中因?yàn)閷?shí)驗(yàn)主要目的并不是研究?jī)煞N因子相互作用所以支架在膠原化之前并沒(méi)有吸附BMP-2，但是后面的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中雙因子釋放系統(tǒng)的制備流程是：吸附BMP-2，膠原化，吸收VEGF，植入動(dòng)物體內(nèi)，所以膠原化過(guò)程后必須保證BMP-2生物活性依然存在）；其二是盡量選擇簡(jiǎn)單易行的實(shí)驗(yàn)方法，并對(duì)體內(nèi)試驗(yàn)不造成影響。冷凍干燥法主

78、要包括三個(gè)階段，37℃成膠，-80℃冷凍，-55℃冷凍干燥，經(jīng)調(diào)查文獻(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)中此方法每個(gè)階段的溫度條件幾乎一致，但是時(shí)間條件不盡相同。所以根據(jù)文獻(xiàn)參考制定了每個(gè)階段的最優(yōu)時(shí)間段，在實(shí)驗(yàn)中選擇最優(yōu)時(shí)間段中最小的時(shí)間限度進(jìn)行制備并檢測(cè)BMP-2生物活性情況，最后得出實(shí)驗(yàn)方法為37℃成膠30分鐘，-80℃冷凍8小時(shí)，-55℃冷凍干燥24小時(shí)。</p><p>　　確定實(shí)驗(yàn)方法后進(jìn)一步對(duì)膠原中性稀釋液的濃度進(jìn)行選擇。分

79、別設(shè)定了三種濃度0.3mg/ml、1mg/ml、5mg/ml，經(jīng)冷凍干燥法分別制備1ml液體體積的膠原海綿（容器為1.5ml EP管）。可非常明顯觀察到相同體積的液體制備出不同體積的膠原海綿，濃度越小制備出的膠原海綿收縮越嚴(yán)重。并且從實(shí)物圖可以看出0.3mg/ml的膠原海綿只可觀察到少量的纖維，另外一部分為粉末狀；1mg/ml 的膠原海綿纖維膠細(xì)，柔軟；5mg/ml的膠原海綿結(jié)構(gòu)較完整，收縮程度最小，如圖2.2。</p>

80、<p>　　圖2.3 三中濃度的膠原海綿實(shí)物圖</p><p>　　此階段試驗(yàn)的第二部分就是在應(yīng)用冷凍干燥法制備膠原海綿的基礎(chǔ)上對(duì)支架進(jìn)行膠原化，實(shí)驗(yàn)主要目的是對(duì)支架內(nèi)部填充膠原海綿以作為VEGF的載體。支架膠原化的方法使用的較多的為反復(fù)浸泡-干燥法，填充法，還有將液體高分子（支架材料）與膠原混合后進(jìn)行支架制備的方法。實(shí)驗(yàn)選擇填充法的原因有兩個(gè)，其一是希望膠原海綿較多的形成于支架內(nèi)部，同時(shí)在支架表面也有

81、覆蓋，這樣可以增加每個(gè)支架攜帶海綿的體積，有助于吸收生長(zhǎng)因子溶液。經(jīng)調(diào)研文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)因?yàn)槟z原溶液在干燥后會(huì)發(fā)生一定的萎縮，所以反復(fù)的浸泡-干燥對(duì)于膠原內(nèi)部海綿的形成不利，其可以在支架表面形成海綿。直接混合法從實(shí)驗(yàn)源頭改變的實(shí)驗(yàn)條件與本實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环?。填充法向模具中的支架?nèi)部填充足量的體積溶液，溶液在制備過(guò)程中不會(huì)流出；其二是填充法中各個(gè)變量容易控制，如注射液體積，操作過(guò)程適用于較多樣本且方便操作。</p><p>　

82、　支架膠原化實(shí)驗(yàn)中根據(jù)支架的幾何模型計(jì)算出內(nèi)部空間理論體積，根據(jù)此體積設(shè)計(jì)了三個(gè)注射量體積70、80、90μl進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意兩點(diǎn)，第一，因支架表面疏水，所以為了提高膠原溶液在支架內(nèi)部的填充體積應(yīng)對(duì)支架進(jìn)行浸泡濕潤(rùn)；第二，利用真空泵將膠原溶液中的氣泡抽出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三種注射量的支架內(nèi)部均有膠原海綿的填充，表面也都有膠原海綿的覆蓋。注射量為90μl制得的膠原化支架可明顯看出支架外部有大量溢出剩余海綿，所以判斷為注射量過(guò)大。注射量

83、為70μl和80μl的支架經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，注射量為70μl的支架空隙中膠原纖維形狀較長(zhǎng)較大，纖維分布不密集，有明顯空白區(qū)域，如圖2.4B。而在支架的外表面可以看到只有部分覆蓋了成纖維狀的膠原海綿，還有部分表面呈不規(guī)則顆粒狀，其為未被膠原畫(huà)面覆蓋的PCL支架表面，如圖2.4D；注射量為80μl的支架空隙中膠原海綿纖維密集，填充情況較好，如圖2.4A。在支架外表面幾乎全部覆蓋上了膠原海綿觀察不到成顆粒狀的PCL支架表面，如圖2.4C。所

84、以在最終膠原化的方法中選擇80μl的注射量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　圖2.4 膠原化后支架的掃描電鏡圖。（A）向支架中注射膠原中性稀釋液80μl 后制備成的支架孔洞處掃描圖；（B）向支架中注射膠原中性稀釋液70μl 后制備成的支架孔洞處掃描圖；（C）向支架中注射膠原中性稀釋液80μl 后制備成的支架外表面掃描圖；（D）向支架中注射膠原中性稀釋液70μl 后制備成的支架外表面掃描圖。</p>&

85、lt;p>　　3表面修飾的聚己內(nèi)酯支架對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力影響的檢測(cè)</p><p><b>　　3.1前言</b></p><p>　　向膠原化的支架上加載VEGF后檢測(cè)其是否對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力有影響的主要目的是確定體外固定在支架上的VEGF是否還存在生物活性。對(duì)支架進(jìn)行生物活性的修飾現(xiàn)在在組織工程中收到了很大的重視，生物因子與沒(méi)有生物活性的高分子支架相結(jié)合的方

86、式主要有化學(xué)連接，物理吸附等等。在生物因子加載到支架上后會(huì)產(chǎn)生與高分子支架的相互作用，主要有共價(jià)鍵的變換，離子鍵以及氫鍵的變換， 這些變換很有可能變換生物因子的結(jié)構(gòu)甚至使其失活。所以在體外的生物大分子支架的生物功能修飾后生物因子的活性檢測(cè)必不可少。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增值能力的促進(jìn)是廣為研究者們熟知的，根據(jù)研究顯示VEGF在具有活性的情況下會(huì)與內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-2號(hào)受體相結(jié)合，產(chǎn)生促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。同時(shí)利用內(nèi)皮細(xì)胞增

87、值能力的檢測(cè)方法是檢測(cè)體外VEGF是否具有生物活性的普遍方法。</p><p>　　對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)主要應(yīng)用的是MTS染色法。[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] (MTS)是一種用比色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中的活細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)試劑。MTS 被細(xì)胞生

88、物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶解于培養(yǎng)基中。這種轉(zhuǎn)化很可能是在代謝活躍的細(xì)胞中的脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH的作用下完成的。在490nm處檢測(cè)到的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)中的活細(xì)胞數(shù)成正比，所以應(yīng)用這種方法可以快捷的檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量。</p><p>　　3.2實(shí)驗(yàn)試劑與材料</p><p>　　0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸，胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)基（高糖），1×HBSS，臍

89、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，MTS檢測(cè)試劑。</p><p><b>　　3.3實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　3.3.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)</p><p>　　（1）向75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中添加水浴溫?zé)岷玫?5ml細(xì)胞培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中30min。</p><p>　?。?）將一瓶含有5×105細(xì)胞的

90、冷凍管從液氮中取出后水浴溫?zé)幔ú怀^(guò)2分鐘），將所有細(xì)胞液吸出加入到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。</p><p>　?。?）24小時(shí)后觀察細(xì)胞是否貼壁，若細(xì)胞已經(jīng)貼壁則進(jìn)行換液，培養(yǎng)基體積15ml。</p><p>　　（4）每48小時(shí)換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上進(jìn)行細(xì)胞傳代。</p><p>　?。?）收獲細(xì)胞時(shí)將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸出，加入15ml

91、 1×HBSS清洗兩次。</p><p>　?。?）加入6ml胰蛋白酶/乙二胺四乙酸，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱等待5分鐘后，顯微鏡觀察，若有90%細(xì)胞已經(jīng)漂浮則說(shuō)明可以進(jìn)行下一步。</p><p>　　（7）加入9ml終止胰酶反應(yīng)液，對(duì)培養(yǎng)瓶底部輕輕吹打，吸出細(xì)胞液并進(jìn)行離心（1100rpm，5min）。</p><p>　　（8）將細(xì)胞重新懸浮在5ml培養(yǎng)基中

92、，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。</p><p>　?。?）進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、傳代或冷凍。</p><p>　　3.3.2內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)</p><p>　　（1）細(xì)胞計(jì)數(shù)后經(jīng)計(jì)算取出細(xì)胞數(shù)為9×104，1.8×105，12.7×105，3.6×105對(duì)應(yīng)的細(xì)胞液體積，分別補(bǔ)足細(xì)胞培養(yǎng)基至1.5ml。將四份細(xì)胞液混勻分別分三份加入到48孔

93、板中（每孔加入500μl），將孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)基放置1小時(shí)。</p><p>　?。?）取出后每孔加入100μlMTS檢測(cè)試劑，將孔板放入培養(yǎng)基放置4小時(shí)。</p><p>　?。?）取出后每孔取3個(gè)樣分別為100μl，加入到96孔板中再放入酶標(biāo)儀。</p><p>　?。?）波長(zhǎng)在490nm處檢測(cè)各個(gè)樣品吸光度，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>

94、;　?。?）確保膠原化后的支架無(wú)菌干燥，將其放入防止細(xì)胞吸附的24孔板中。如第二章實(shí)驗(yàn)步驟所述將VEGF溶液滴注在支架上后，維持20分鐘后滴加50μl細(xì)胞培養(yǎng)基，維持25分鐘。</p><p>　?。?）將細(xì)胞數(shù)為4×104對(duì)應(yīng)的細(xì)胞液體積滴加在支架上，將支架放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，每隔30分鐘在支架同一面滴加50μl細(xì)胞培養(yǎng)基，2小時(shí)后翻面再滴加相同體積的細(xì)胞液，放入培養(yǎng)箱，每隔30分鐘在同一面50μl細(xì)胞培

95、養(yǎng)基，2小時(shí)后每孔中添加1.2ml培養(yǎng)基，將孔板放入培養(yǎng)箱中，如圖3.1。</p><p>　　圖3.1 細(xì)胞接種在支架上的流程示意圖</p><p>　　（7）每48小時(shí)更換細(xì)胞液，3天后進(jìn)行MTS檢測(cè)。</p><p>　?。?）將支架取出放入48孔板中，每孔加入500μl培養(yǎng)基和100μlMTS檢測(cè)試劑，將孔板放入培養(yǎng)箱中，放置4小時(shí)。取出后每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取三個(gè)平

96、行式樣在490nm測(cè)量吸光度。</p><p><b>　　3.3結(jié)果與討論</b></p><p>　　本階段試驗(yàn)也主要分為兩個(gè)部分，第一個(gè)部分是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)。首先根據(jù)調(diào)研文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不能多次傳代，否則細(xì)胞性質(zhì)、形態(tài)以及增殖都會(huì)發(fā)生不良變化，所以此實(shí)驗(yàn)細(xì)胞都保持在3-4代之間進(jìn)行MTS檢測(cè)。另外在細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)程中，總結(jié)了細(xì)胞的增長(zhǎng)速度為30小

97、時(shí)翻一番，所以經(jīng)解凍后的細(xì)胞（5×105）培養(yǎng)5-6天后細(xì)胞增值到7×106左右可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或者傳代。第三因人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的解凍較為困難，細(xì)胞不易存活，根據(jù)所購(gòu)買(mǎi)得細(xì)胞培養(yǎng)基說(shuō)明書(shū)上操作，解凍細(xì)胞時(shí)不進(jìn)行離心，即直接將化凍的細(xì)胞加入到培養(yǎng)瓶中，24小時(shí)后待細(xì)胞成功貼壁更換新培養(yǎng)基（此處將細(xì)胞凍存液中的二甲基亞砜去除）。</p><p>　　第二部分是對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)。首先在實(shí)驗(yàn)

98、方法上有一些注意點(diǎn)，第一是VEGF在滴加到支架上后，注意保持一定時(shí)間后再滴加細(xì)胞培養(yǎng)基，之后再進(jìn)行細(xì)胞接種。原因是維持時(shí)間有助于膠原海綿吸收VEGF；在滴注細(xì)胞培養(yǎng)基并維持一定時(shí)間后，支架上膠原海綿會(huì)轉(zhuǎn)變成膠原凝膠狀態(tài)，細(xì)胞較干燥的膠原海綿更易于吸附于濕潤(rùn)并具有培養(yǎng)基的膠體表面。第二是延長(zhǎng)細(xì)胞吸附時(shí)間的操作步驟，在支架上下兩個(gè)表面分別滴加相同體積的細(xì)胞液，并使其在培養(yǎng)集中維持一定時(shí)間后，在孔板中加入液體培養(yǎng)基。經(jīng)調(diào)研文獻(xiàn)總結(jié)得到此方法有

99、助于增加細(xì)胞吸附在支架上的比例。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)探究得出，支架上細(xì)胞接種量為8×104個(gè)效果較好，且細(xì)胞與MTS檢測(cè)試劑反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)效果較好。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了兩種不同量的VEGF對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響，兩組支架上分別吸附有1μg和5μg的VEGF。經(jīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)化后得出圖3.2，可以看出加入1μgVEGF的細(xì)胞增殖與未加入VEGF的細(xì)胞增殖能力沒(méi)有較大區(qū)別，說(shuō)明

100、1μgVEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯影響；而加入5μgVEGF的細(xì)胞增殖能力較明顯的大于未加入VEGF的細(xì)胞，說(shuō)明5μgVEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增值能力有促進(jìn)作用。說(shuō)明5μgVEGF加載到支架上后仍具有一定生物活性，配合其他檢測(cè)生物活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為之后動(dòng)物體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。</p><p>　　圖3.2 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力結(jié)果統(tǒng)計(jì)。（a）MTS方法中吸光度與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系（標(biāo)準(zhǔn)曲線）；（b）VEGF用量

101、分別為0,1,5μg時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞增值數(shù)量</p><p>　　在實(shí)驗(yàn)之前對(duì)雙因子釋放系統(tǒng)文獻(xiàn)調(diào)研的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，VEGF在雙因子釋放系統(tǒng)中每個(gè)樣品的用量主要范圍是0.5-10μg，針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用量會(huì)有一定幅度的偏差。不同用量的VEGF對(duì)于生物體作用的效果是不同的，用量過(guò)少不會(huì)產(chǎn)生效應(yīng)，而用量過(guò)多在體內(nèi)試驗(yàn)中會(huì)引發(fā)局部炎癥。針對(duì)于本實(shí)驗(yàn)選擇的低濃度和中等濃度得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合上述調(diào)研后的結(jié)論。</p>

102、<p>　　實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)問(wèn)題，首先第一個(gè)問(wèn)題是細(xì)胞數(shù)量較低。分析此原因首先我們考慮的原因是細(xì)胞接種的問(wèn)題。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知將8×104個(gè)的細(xì)胞接種到支架上后，經(jīng)過(guò)分步滴加細(xì)胞液培養(yǎng)基的步驟后，細(xì)胞的吸附程度并不好，吸附率為10%左右。吸附率較低說(shuō)明細(xì)胞不易貼附在膠原化后的支架上。此問(wèn)題的原因可能為，第一因?yàn)橹Ъ苁求w積比較小的長(zhǎng)方體，經(jīng)膠原化后再在其表面滴加細(xì)胞，細(xì)胞不易進(jìn)入支架內(nèi)部生長(zhǎng)，所以多聚集在膠原化的支架表面

103、，又因?yàn)榈渭蛹?xì)胞液的時(shí)候由于水的張力會(huì)將一部分細(xì)胞沖離支架表面，在滴加細(xì)胞后經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有大部分細(xì)胞處在支架四周或在孔板的空白區(qū)域。第二由于調(diào)研文獻(xiàn)知膠原是很好的三維培養(yǎng)細(xì)胞的材料，貼壁細(xì)胞比較容易在此材料上貼壁生長(zhǎng)。但是膠原的性質(zhì)會(huì)影響細(xì)胞的吸附程度，如膠原的酸堿性，膠原纖維孔隙性狀和大小等，所以細(xì)胞吸附度較低與之前制備膠原海綿的方法有關(guān)，在制備膠原海綿的步驟中滴加堿液的體積是經(jīng)公式計(jì)算的，并沒(méi)有單獨(dú)檢測(cè)膠原溶液的酸堿度，所以此處

104、控制的并不準(zhǔn)確會(huì)影響之后細(xì)胞接種的過(guò)程。第三細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)速度較慢，一般細(xì)胞不愿意在支架中生長(zhǎng)，因?yàn)橹Ъ苤腥狈I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與氧氣，并且支架需要具有一定的表</p><p>　　第二個(gè)我們考慮細(xì)胞數(shù)量低是因?yàn)镸TS染色方法的原因。在進(jìn)行支架上細(xì)胞染色的檢測(cè)過(guò)程中用槍頭吹打支架周?chē)梢悦黠@看到孔板整體培養(yǎng)基顏色加深，說(shuō)明一開(kāi)始顏色的分布是不均勻的。同時(shí)在支架空隙內(nèi)部可以發(fā)現(xiàn)有一些夜色較深的部位但因?yàn)槟z原凝膠處于支架內(nèi)

105、部所以用槍頭并不容易吹打。經(jīng)調(diào)研文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)也有類似實(shí)驗(yàn)研究在進(jìn)行MTS染色前用膠原水解酶將支架上膠原凝膠水解將顏色釋放出來(lái)。這樣可以增加染色的深度從而增加對(duì)應(yīng)細(xì)胞數(shù)量。不過(guò)此原因并不確定因?yàn)榭紤]到細(xì)胞產(chǎn)生的甲瓚物質(zhì)是水溶性的，即使被膠原凝膠束縛也應(yīng)該是少量的。</p><p>　　第二個(gè)問(wèn)題是VEGF使用劑量的問(wèn)題。 經(jīng)調(diào)研文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)大部分實(shí)驗(yàn)使用的VEGF的劑量都較大，所以在進(jìn)行體外活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)中都與對(duì)照組有明顯