香魚c9重組蛋白包涵體純化洗滌緩沖液的篩選【開題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　香魚C9重組蛋白包涵體純化洗滌緩沖液的篩選</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>&

2、lt;p>　　魚類體液中幾種主要抗菌因子在自身非特異性免疫中發(fā)揮著巨大作用。魚體液中幾種主要的抗菌因子有：補(bǔ)體、抗菌肽、凝集素、溶茵酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白、金屬硫蛋白等。其中補(bǔ)體系統(tǒng)是先天性免疫的一個(gè)重要效應(yīng)系統(tǒng)。它既是天然免疫防御的一部分，又是體液免疫的效應(yīng)機(jī)制，同時(shí)對(duì)特異性免疫應(yīng)答具有調(diào)節(jié)作用。補(bǔ)體是由血漿補(bǔ)體成分、可溶性和膜型補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、補(bǔ)體受體等30余種糖蛋白組成，是一個(gè)具有精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)。補(bǔ)體重要結(jié)構(gòu)之一末端補(bǔ)體分

3、子：C6，C7，C8和C9是構(gòu)成膜攻擊復(fù)合體（MAC）引起靶細(xì)胞溶解破壞的重要組成成分。其中C9分子是形成MAC的最后一個(gè)分子，為單鏈糖蛋白，分子量是79kd。</p><p>　　因此本課題擬通過優(yōu)化香魚C9重組蛋白包涵體，為進(jìn)一步抗血清制備奠定基礎(chǔ)。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容

4、：</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)主要是通過原核表達(dá)獲得大量香魚C9重組蛋白，并優(yōu)化純化方法，獲得較純的重組蛋白，為下一步C9抗血清制備奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　擬解決的問題：</b></p><p>　　研究香魚C9重組蛋白包涵體純化洗滌緩沖液的篩選。</p><p>　　三、研究的方法與

5、技術(shù)路線：</p><p><b>　?。ㄒ唬┭芯糠椒?lt;/b></p><p><b>　　2.2.1誘導(dǎo)表達(dá)</b></p><p>　　挑取單個(gè)pET-28a-C9/BL21 pLys E菌落，涂于含卡那霉素（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)14h。在過夜培養(yǎng)后的LB培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落接種于5 ml LB培養(yǎng)

6、液（含50 μg/mL卡那霉素），37℃搖床培養(yǎng)過夜。取1ml過夜培養(yǎng)的LB培養(yǎng)液，按1:100比例稀釋，接種于100 ml LB培養(yǎng)液（含50μg/mL卡那霉素）中，2h后，取1ml作為對(duì)照，記作樣品1。其余培養(yǎng)液中加入IPTG（終濃度為0.4mmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)4h。</p><p><b>　　2.2.2菌體破碎</b></p><p>　　將含有構(gòu)建的表達(dá)

7、載體的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)至100ml，在6000rpm下離心10min，棄上清，所得沉淀分別用20mL PBS洗滌液重懸浮，進(jìn)行超聲破碎（2s，間隔2s，90次）兩次，破碎液中取樣100μL，記作樣品2；其余破碎液13，000rpm離心10min，取100μl的上清液，記作樣品3，取100μl的沉淀，記作樣品4，其余的上清和樣品冷藏保存。</p><p>　　2.2.3電泳檢測(cè)目的蛋白是否為包涵體</p>

8、<p>　　將樣品1-4加入 2×SDS-PAGE上樣緩沖液（50mmol/L Tris-HCl pH 6.8，100mmol/L DTT，2%SDS，0.01%溴酚藍(lán)，20%甘油），煮沸5min，10000rpm離心10min后，取上清20μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用未誘導(dǎo)的菌體蛋白和BL21 pLys E菌體蛋白作對(duì)照，進(jìn)行電泳。樣品在進(jìn)入分離膠前用80V，進(jìn)入分離膠后加至95V。</p>&

9、lt;p>　　2.2.4染色與脫色</p><p>　　電泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝膠，切去濃縮膠，同時(shí)切一角作為方向標(biāo)記，接著用蒸餾水沖洗。用考馬斯亮藍(lán)R-250（0.25% Coomassie’s bright blue R-250）染色，室溫下，染色2 h后轉(zhuǎn)至脫色液中脫色，脫色1h后用清水漂洗至凝膠背景無顏色，蛋白條帶清晰，再進(jìn)行觀察、攝像。</p><p>　　2.2.5包

10、涵體洗滌</p><p>　　將含有包涵體超聲波破碎液沉淀分成四份，每份10mL，分別用10mL四種不同PBS洗滌液洗滌沉淀。13，000rpm 10min ，去上清后，采用PBS-1（含2%脫氧膽酸鈉）洗滌沉淀，在37℃在分別振蕩溫育1h、2h、3h，每次分別取樣200μl，記作樣品5-1、5-2、5-3。沉淀用PBS-2（含0.5%Triton-X100）洗滌，在37℃在分別振蕩溫育1h、2h、3h，每次分

11、別取樣200μl，記作樣品6-1、6-2、6-3。13，000rpm ，離心10min，去上清，沉淀用PBS-3（含0.5%Triton-X100+4M 尿素）洗滌，在37℃在分別振蕩溫育1h、2h、3h，每次分別取樣200μl，記作樣品7-1、7-2、7-3。13，000rpm ，離心10min，去上清，沉淀用PBS-4（含0.5%triton X-100+4M尿素+2%脫氧膽酸鈉）洗滌，在37℃在分別振蕩溫育1h、2h、3h，每次分

12、別取樣200μl，記作樣品8-1、8-2、8-3。</p><p><b>　　2.2.6電泳檢測(cè)</b></p><p>　　樣品5-8，加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min，10000g離10min后，取上清20μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳，37oC染色2 h后轉(zhuǎn)至脫色液，脫色至蛋白條帶清晰，于純化前樣品2和樣品4做比較。</p>

13、<p><b>　　（二）技術(shù)路線</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度</p><p>　　2010.9-2010.10：畢業(yè)論文選題；</p><p>　　2010.10-2010.11：進(jìn)行文獻(xiàn)查閱和資料收集，.完成開題報(bào)告及任務(wù)書，制定具體研究計(jì)劃和試驗(yàn)方案；</p><p>　　2

14、010.12：開題答辯與綜述；</p><p>　　2010.12-2010.12：實(shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備；</p><p>　　2010.12-2011.2：目的蛋白大量表達(dá)；</p><p>　　2011.2-2011.3：數(shù)據(jù)和材料整理、分析；</p><p>　　2011.3-2011.5：完成2篇外文翻譯，論文撰寫、提交并答辯。</p&

15、gt;<p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 李明云, 丁天喜, 竺俊全等.我國(guó)香魚的研究現(xiàn)狀及增養(yǎng)殖前景[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版),1999,（04）:85-90</p><p>　　[2] 李長(zhǎng)紅, 陳炯, 史雨紅等.寧海地區(qū)香魚弧菌病病原菌鑒定[J].微生物學(xué)報(bào),2009,（07）:931-937</p

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32、研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)文摘(內(nèi)科學(xué)), 2006,(02):109-111</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　食品工程與科學(xué)</b></p><p>　　魚類補(bǔ)體和C9基因的研究進(jìn)展</p><p>　　摘要：魚類的補(bǔ)體在殺滅和中和微生物方面起著重要

33、作用，該系統(tǒng)系統(tǒng)可激活溶血途徑和調(diào)理作用來實(shí)現(xiàn)其對(duì)機(jī)體的防御功能，其中C9是構(gòu)成補(bǔ)體重要結(jié)構(gòu)之一的末端補(bǔ)體分子的一類分子。本文主要介紹了魚類補(bǔ)體特征、生物學(xué)作用以及魚類補(bǔ)體的合成發(fā)生。同時(shí)，也介紹了C9基因的研究進(jìn)展，以及適用于C9重組蛋白純化的試驗(yàn)方法。</p><p>　　關(guān)鍵詞：魚類；補(bǔ)體；C9基因；研究進(jìn)展</p><p><b>　　1 前言</b><

34、/p><p>　　地球上的生物都在經(jīng)歷上億年的時(shí)間和不斷變化的自然環(huán)境的過程中，慢慢的形成了它們自身特有的防御體系——免疫系統(tǒng)。動(dòng)物的免疫系統(tǒng)是由先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)兩部分組成(于善謙等,1999)。其中魚類是脊椎動(dòng)物中，種類數(shù)量占比重最多的一個(gè)類群，在進(jìn)化過程中，魚類是處于連接高等脊椎動(dòng)物和低等無脊椎動(dòng)物的一個(gè)特殊地位，但目前關(guān)于非特異性免疫因子以及其與高等脊椎動(dòng)物的比較研究還很有限，還缺乏更多的分子生物學(xué)方

35、面的證據(jù)。對(duì)魚類免疫系統(tǒng)的深入研究，在一定程度上有助于進(jìn)一步的了解到脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的發(fā)生、進(jìn)化以及其多樣性。和高等脊椎動(dòng)物一樣，魚類也是利用免疫系統(tǒng)來初步防御外來病原生物的侵害，其免疫抵御機(jī)制包括非特異性免疫和特異性免疫，它們的共同作用是都能夠維持機(jī)體的正常功能以及魚類自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。</p><p>　　補(bǔ)體(Complement，C)是在先天免疫防御中具有重要功能的體液分子，其被病原體或者抗原抗體復(fù)合物等

36、多種物質(zhì)激活后，能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生、抗體的形成以及介導(dǎo)病原體的清除。補(bǔ)體被抗原-抗體復(fù)合體或微生物激活，然后可通過直接裂解或者促進(jìn)吞噬作用消滅病原微生物。在補(bǔ)體系統(tǒng)兩條激活途徑中，涉及到14個(gè)補(bǔ)體蛋白（C1-9，及B、D、P因子）的參與，近年來，其在分子遺傳學(xué)和分子克隆技術(shù)的應(yīng)用日漸廣泛。</p><p>　　本文對(duì)魚類補(bǔ)體系統(tǒng)的研究概況及與補(bǔ)體成分之一C9基因研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。</p><

37、p>　　2魚類補(bǔ)體系統(tǒng)研究進(jìn)展</p><p>　　補(bǔ)體(Complement,C)是先天免疫防御中重要的體液功能分子，在被病原體或者抗原抗體復(fù)合物等多種物質(zhì)激活后，能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和抗體的形成、介導(dǎo)病原體的清除(Ferreira et al,2000;Gasque,2004)。補(bǔ)體經(jīng)典溶血途徑能夠非特異性的補(bǔ)體系統(tǒng)與特異的獲得性免疫聯(lián)系起來，成為抗體介導(dǎo)的體液免疫的一種重要的效應(yīng)機(jī)制(Fujita et a

38、l,2004b;Morgan et al,2005)。自1894年P(guān)feiffer發(fā)現(xiàn)溶菌現(xiàn)象以來，對(duì)補(bǔ)體的研究己經(jīng)有100多年的歷史，而魚類補(bǔ)體的研究起步比較晚，對(duì)其系統(tǒng)研究是20世紀(jì)80年代以后才開始的(Dodds&Day,1993)。</p><p>　　2.1 補(bǔ)體活化途徑</p><p>　　補(bǔ)體系統(tǒng)是一個(gè)古老的防御機(jī)制，在無脊椎動(dòng)物階段就已經(jīng)存在(Nakao et al

39、, 2003)。魚類補(bǔ)體活化途徑有經(jīng)典途徑(Classic Complement Pathway，CCP)、旁路途徑(Alternative Complement Pathway，ACP)、凝集素途徑(Lectin Complement Pathway，LCP)和共同的終末途徑形成攻膜復(fù)合體(Membrane Attack Complex，MAC)。ACP和LCP在無頷類脊椎動(dòng)物已經(jīng)存在(Sunyer&Lambris,1998;

40、Fujita et al,2004b)。</p><p>　　補(bǔ)體活化途徑也稱作補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體的各成分，為抗原抗體復(fù)合體以及其他成分，離子等相繼會(huì)合連鎖被活化，結(jié)果引起免疫細(xì)胞溶解和免疫溶血，也就是細(xì)胞和細(xì)菌、紅血球等的溶解或免疫粘著等許多免疫生物學(xué)現(xiàn)象（C1-C9為補(bǔ)體的第一到第九成分），這一機(jī)制稱為補(bǔ)體活化途徑，大致可分為兩種途徑，第一補(bǔ)體途徑（classical pathway）和第二途徑，第二途徑亦稱為代

41、替途徑（alternate pathway）。</p><p>　　2.2補(bǔ)體的合成和發(fā)生</p><p>　　補(bǔ)體是存在于人和動(dòng)物血清與組織液中,由近40種可溶性蛋白和膜蛋白組成，可溶補(bǔ)體蛋白的主要功能是結(jié)合和破壞入侵的病原，補(bǔ)體系統(tǒng)的膜蛋白又分為補(bǔ)體受體和補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白。補(bǔ)體受體啟動(dòng)吞噬細(xì)胞結(jié)合和吞噬結(jié)合了補(bǔ)體調(diào)理素的病原。補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白保護(hù)機(jī)體正常組織免受可溶補(bǔ)體蛋白的意外損害(Boha

42、na-Kashtan et al,2004)。</p><p>　　許多不同的組織細(xì)胞能夠合成補(bǔ)體蛋白，包括肝細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞(腎臟，肺和腸道)，脂肪細(xì)胞(Volanakis,1995; 謝佩蓉,1997)，以及腦細(xì)胞(神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元)等(Fabry et al,1994)。血漿中大部分補(bǔ)體組分由肝細(xì)胞分泌。單核巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生幾乎所有具有活性的補(bǔ)

43、體成分，而其它類型的細(xì)胞或組織產(chǎn)生其中個(gè)別成分(Dalmo et al,1997)。</p><p>　　魚類肝臟是合成補(bǔ)體的主要器官(Ellingsen et al,2005;Huttenhuis et al,2006)，但在其它組織器官如眼視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、脊索、胃、腸道、胰腺、心臟、腦、脾臟、腎臟和鰓中也檢測(cè)到(Nakao,1998;Lange et al,2004b; Chondrou et al, 200

44、6b)。</p><p><b>　　2.3魚類補(bǔ)體特性</b></p><p>　　2.3.1 魚類補(bǔ)體具有較低的反應(yīng)溫度</p><p>　　硬骨魚類補(bǔ)體在較低的溫度下激活，魚類補(bǔ)體活化的最適溫度是20~25℃，哺乳動(dòng)物則是37℃；溫水魚類在45~50℃補(bǔ)體失活(Sakai et al,1981)，而虹蹲等冷水魚類補(bǔ)體的滅活溫度是40~4

45、5℃ (Magnadottir, 2000; Claire et al ,2002)，哺乳動(dòng)物的ACP滅活溫度是56℃，CCP的滅活溫度是50℃。許多種魚類在0~4℃也仍然顯示溶血活性，兩棲類和爬行類的補(bǔ)體也存在同樣的特性(Koppenheffer,1957;Sunyer&Lambris,1998)。低溫環(huán)境下，當(dāng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)減弱時(shí)，魚類補(bǔ)體系統(tǒng)仍然保持較高活性。</p><p>　　2.3.2 魚類

46、具有較高的ACP活性</p><p>　　魚類的ACP溶血活性(使用ACH50值表示)比哺乳動(dòng)物的ACH50值高5~10倍，體現(xiàn)了ACP在魚類先天性免疫中具有更重要的作用。也可能是對(duì)被溶解靶細(xì)胞的敏感性存在種類特異性差異(Claire et al,2002)，通過ACP魚類補(bǔ)體可以間接的裂解多種動(dòng)物紅細(xì)胞，魚類補(bǔ)體的這種性質(zhì)顯示可能具有較寬范圍的識(shí)別外源物種的能力，這種識(shí)別非己成分的能力可能歸因于魚類的一些補(bǔ)體成

47、分存在的多種亞型(Sunyer et al,1995)。</p><p>　　2.3.3 魚類補(bǔ)體成分的多態(tài)性</p><p>　　硬骨魚類補(bǔ)體的一些成分由多基因編碼。魚類多種補(bǔ)體蛋白都有多種亞型存在，這些多態(tài)性是不同基因的產(chǎn)物，顯示在硬骨魚類出現(xiàn)之前發(fā)生了一系列的基因復(fù)制事件(Holland&Lambris,2002)。虹蹲的4個(gè)C3亞型被鑒定(sunyer et al,199

48、6)，鯉的8個(gè)C3的cDNA和5個(gè)蛋白分別被鑒定和分離(Nakao et al,2003)，研究顯示金頭綢有5個(gè)C3亞型(Sunyer et al,1997)。</p><p>　　低等脊椎動(dòng)物補(bǔ)體基因多態(tài)性的產(chǎn)生與擴(kuò)增其自身的免疫識(shí)別能力和免疫反應(yīng)能力有關(guān)。變溫脊椎動(dòng)物的獲得性免疫容易受到環(huán)境水溫變化的影響，因此主要依賴其多樣化的先天性免疫機(jī)制，主要不同點(diǎn)體現(xiàn)在補(bǔ)體系統(tǒng)。魚類補(bǔ)體成分的多態(tài)性和反應(yīng)的高效性，為魚

49、類提供快速、強(qiáng)大而多樣的自然免疫能力(Sunyer et al,1997)。</p><p>　　3 C9基因研究進(jìn)展</p><p><b>　　3.1 C9分子</b></p><p>　　C9分子是補(bǔ)體溶解途徑膜攻擊復(fù)合體（MAC）的一個(gè)成員，為形成MAC的最后一個(gè)分子，是單鏈糖蛋白，分子量是79kd。C9分子的多肽鏈與c8a和c8b結(jié)構(gòu)

50、上相類似，也含有TSP-1、LDL受體前提結(jié)構(gòu)功能域，及與穿孔蛋白同源的結(jié)構(gòu)功能域。</p><p>　　圖1 膜攻擊復(fù)合體（MAC）的結(jié)構(gòu)模式圖</p><p>　　經(jīng)對(duì)cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，C9為一兩性分子。C端37kDa由疏水性氨基酸組成稱C9b，N端34kDa由親水性氨基酸組成稱C9a。因此C9以其羧基端部分嵌入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中，而N端則為與C 5b-8相結(jié)合的結(jié)構(gòu)

51、域。由12-16個(gè)C9分子聚合形成的多聚體C9，可形成內(nèi)徑10nm、壁厚2nm的中空穿膜孔道嵌入膜內(nèi)。孔道的內(nèi)面由許多親水性氨基酸殘基和碳水化物組成，而與雙層脂接觸的管壁外面則是疏水性氨基酸殘基。由于細(xì)胞內(nèi)容物的外漏，最終可導(dǎo)致細(xì)胞溶解破壞。編碼入C9的基因定位于第5號(hào)染色體上，末發(fā)現(xiàn)C9有多態(tài)性(Willian E,2003)。</p><p>　　C9重組蛋白的提取純化方法</p><p&

52、gt;　　適用于C9重組蛋白的分離提取的方法有：無機(jī)物沉淀法、高分子有機(jī)聚合物沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、超濾法。</p><p>　　適用于C9重組蛋白的純化精制方法有：離子交換色譜法（周鳳蘭和張頁,1992）、凝膠過濾法(李培成,1991)、嗜硫色譜法、親和色譜法(秦衛(wèi)松和李芳秋,2001)、疏水作用色譜法。</p><p>　　以上提取純化方法中，超濾法雖然所得純度不高，但操作簡(jiǎn)單，與水

53、稀釋法連用可不加任何化學(xué)試劑而用于食品級(jí)Ig的分離；色譜的純化效率雖高，但抗體損失較大，多種色譜聯(lián)合使用可以達(dá)到較高純度，但往往得率低，操作費(fèi)時(shí)；嗜硫色譜在Ig的純化中顯示出選擇性強(qiáng)、活性回收率高、易于工業(yè)化放大的優(yōu)點(diǎn)，已成功用于重組單鏈抗體片段與Fab段的分離；生物工程構(gòu)建配體TG19318親和色譜的應(yīng)用簡(jiǎn)化了免疫球蛋白的分離，但其制備和使用成本相對(duì)較高，對(duì)Ig的非特異性一步色譜純化可用嗜硫色譜法；應(yīng)用于免疫檢測(cè)的抗體，宜用抗原偶聯(lián)的

54、色譜柱純化獲得特異性Ig；金屬離子色譜法可用于Ig亞群的分析分離研究（徐欽和劉成國(guó),2010）。</p><p>　　C9缺乏與生理疾病研究進(jìn)展</p><p>　　補(bǔ)體重要結(jié)構(gòu)之一末端補(bǔ)體分子：C6，C7，C8和C9是構(gòu)成膜攻擊復(fù)合體（MAC），是能夠引起靶細(xì)胞溶解破壞的重要組成成分。補(bǔ)體成分的缺失，會(huì)影響動(dòng)物體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的正常工作，C9作為MAC重要組成之一，目前有應(yīng)用于一些相關(guān)疾病的

55、檢測(cè)，隨著研究成果的不斷深入和具體，C9的研究也越來越廣泛?，F(xiàn)今已通過研究證實(shí)和C9有關(guān)的疾病主要有食管癌、腦出血、心臟病、SLE樣綜合征和干燥綜合征等。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 于善謙, 王洪海, 朱乃碩等. 免疫學(xué)導(dǎo)論 [M]. 北京:高等教育出版社, 1999.</p><p>　　[2]

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73、35.</p><p>　　[26] 徐欽, 劉成國(guó). 牛初乳免疫球蛋白的提取與純化方法研究[J], 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2010, 1: 72-74.</p><p>　　指導(dǎo)教師簽字 史雨紅 </p><p>　　2010 年 12 月 13日</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p&

74、gt;<p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　香魚C9重組蛋白包涵體純化洗滌緩沖液的篩選</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1前言16</b></p><p>　　2實(shí)驗(yàn)材料與方法17</

75、p><p>　　2.1 原料、儀器和試劑17</p><p>　　2.1.1 原料與試劑17</p><p>　　2.1.2主要儀器18</p><p>　　2.1.3主要試劑及其配制19</p><p>　　2.2實(shí)驗(yàn)方法20</p><p>　　2.2.1誘導(dǎo)表達(dá)20</p&g

76、t;<p>　　2.2.2菌體破碎20</p><p>　　2.2.3電泳檢測(cè)目的蛋白是否為包涵體20</p><p>　　2.2.4 染色與脫色20</p><p>　　2.2.5包涵體洗滌20</p><p>　　2.2.6電泳檢測(cè)21</p><p><b>　　3 結(jié)果21&

77、lt;/b></p><p>　　3.1 菌株誘導(dǎo)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果21</p><p>　　3. 2 重組蛋白質(zhì)是否為包涵體的檢測(cè)結(jié)果22</p><p>　　3.3 C9重組蛋白質(zhì)包涵體洗滌效果檢測(cè)結(jié)果23</p><p><b>　　4 討論24</b></p><p>　　4.

78、1 包涵體洗滌劑效果分析25</p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)26</b></p><p>　　摘要：魚類的補(bǔ)體在機(jī)體抵御致病微生物感染中起重要作用，該系統(tǒng)能夠激活溶血途徑和免疫調(diào)理作用來實(shí)現(xiàn)其對(duì)機(jī)體各種病害的防御功能，其中C9是構(gòu)成補(bǔ)體重要結(jié)構(gòu)之一末端補(bǔ)體分子的一類分子；為了制備香魚C9抗

79、血清，以在香魚養(yǎng)殖中提高香魚免疫力減少病害造成的損失，利用基因重組技術(shù)，將重組蛋白純化變性等處理即得到抗血清。本實(shí)驗(yàn)研究目的：鑒定目的蛋白為包涵體，并分析篩選純化包涵體較優(yōu)的洗滌緩沖液配方。研究方法：使用不同配方的洗滌液純化目的蛋白，通過SDS-PAGE電泳分析各配方效果優(yōu)劣。結(jié)果：驗(yàn)證了香魚C9重組蛋白是以包涵體形式存在，在對(duì)配方組成及結(jié)果分析中，篩選得到的最適香魚C9重組蛋白包涵體純化洗滌緩沖液配方為PBS pH 8.0 + 0.5

80、%Triton-X100 + 4M尿素洗滌C9包涵體1 h。</p><p>　　關(guān)鍵詞：包涵體；洗滌純化；補(bǔ)體；C9基因</p><p>　　Abstract: Complement system plays an important role in killing microorganisms and in the centor of fish immune system. The s

81、ystem functions as a defense against diseases by activating the immune hemolytic pathway and immunoregulating. C9 is an one of the important elements of a terminal complement molecules. Ayu is of great economic value. Th

82、e history of ayu farming in China is short. The disease control technology and experience are not mature. The diseases in the culture process has a serious </p><p>　　Keywords: Inclusion body; Washing and pur

83、ification; Complement; C9 gene</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　香魚(Plecoglossus altivelis)，是溯河性一年生的一種小型經(jīng)濟(jì)魚類。因它的脊背上有一條充滿香脂的腔道，能夠散發(fā)出香味，所以被稱為香魚。世界上的香魚已經(jīng)很稀少，只有在我國(guó)的閩南、臺(tái)灣局部地區(qū)仍存在豐富的資源。香魚的肉質(zhì)醇厚、細(xì)

84、嫩味美并帶有殊香，就像從香水里撈出來一樣，并且也無其他魚腥味，人們對(duì)它評(píng)價(jià)很高很是喜愛，所以香魚養(yǎng)殖具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和效益，如現(xiàn)市場(chǎng)鮮魚價(jià)已高達(dá)160-180元/kg，而“色如黃金，可攜千里”的香魚干，其價(jià)格已高達(dá)650元/kg [1]。但是香魚的養(yǎng)殖歷史卻比較短，香魚的疾病防治技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)均還不成熟，在香魚養(yǎng)殖過程中，香魚疾病問題已嚴(yán)重影響了香魚養(yǎng)殖業(yè)更好的發(fā)展。在日本還有我國(guó)臺(tái)灣，常有香魚養(yǎng)殖病害的報(bào)道，尤其弧菌類疾病的發(fā)病率較高[

85、2]。所以隨著養(yǎng)殖業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們意識(shí)到必須加強(qiáng)病害防治及香魚疫苗方面的研究。目前日本已成功地研制出假單孢菌病的疫苗，已使得香魚的成活率高達(dá)82%3]。近年來，隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展以及分子生物學(xué)技術(shù)逐步完善的條件下，魚類免疫學(xué)和免疫防病技術(shù)引起了人們的極大重視，即通過免疫手段特異性或非特異性作用來增強(qiáng)水</p><p>　　地球上的生物都在經(jīng)歷上億年的時(shí)間和不斷變化的自然環(huán)境的過程中，慢慢的形成了它們

86、自身特有的防御體系——免疫系統(tǒng)。動(dòng)物的免疫系統(tǒng)是由先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)兩部分組成[5]。其中魚類是脊椎動(dòng)物中，種類數(shù)量占比重最多的一個(gè)類群，在進(jìn)化過程中，魚類是處于連接高等脊椎動(dòng)物和低等無脊椎動(dòng)物的一個(gè)特殊地位，但目前關(guān)于非特異性免疫因子以及其與高等脊椎動(dòng)物的比較研究還很有限，還缺乏更多的分子生物學(xué)方面的證據(jù)。對(duì)魚類免疫系統(tǒng)的深入研究，在一定程度上有助于進(jìn)一步的了解到脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的發(fā)生、進(jìn)化以及其多樣性。和高等脊椎動(dòng)物一樣，魚

87、類也是利用免疫系統(tǒng)來初步防御外來病原生物的侵害，其免疫抵御機(jī)制包括非特異性免疫和特異性免疫，它們的共同作用是都能夠維持機(jī)體的正常功能以及魚類自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。</p><p>　　補(bǔ)體(Complement，C)是在先天免疫防御中具有重要功能的體液分子，其被病原體或者抗原抗體復(fù)合物等多種物質(zhì)激活后，能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生、抗體的形成以及介導(dǎo)病原體的清除 [6, 7]。補(bǔ)體的組成：它是由血漿補(bǔ)體成分、可溶性和膜型補(bǔ)體

88、調(diào)節(jié)蛋白以及各種補(bǔ)體受體等30余種糖蛋白組成，是一個(gè)具備精密調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)[8]。其中補(bǔ)體的重要結(jié)構(gòu)之一末端補(bǔ)體分子膜攻擊復(fù)合體(MAC)：MAC是在細(xì)胞膜上形成許多親水性穿膜孔道，能夠使得水和電解質(zhì)通過，但不讓蛋白質(zhì)類等大分子逸出，最終因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的滲透壓改變，而使得細(xì)胞溶解破壞。MAC在細(xì)胞免疫中有重要作用，如創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷可激活補(bǔ)體，可使膜攻擊復(fù)合物(C5b-9/MAC)形成并沉積，這對(duì)細(xì)胞病勢(shì)漸退和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的

89、亞溶解有重要作用[9]。C6、C7、C8和C9是構(gòu)成膜攻擊復(fù)合物中引起靶細(xì)胞溶解破壞的重要組成成分。其中C9分子為形成MAC的最后一個(gè)分子，它是一種單鏈糖蛋白[10]，分子量是79kd。C9作為MAC重要組成之一，目前主要有應(yīng)用于一些相關(guān)疾病的檢測(cè)。近年來，補(bǔ)體的應(yīng)用在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域和分子克隆技術(shù)日漸廣泛，魚類補(bǔ)體的生物學(xué)</p><p>　　在多種重組基因已在原核表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)的過程中，一部分的重組蛋白多

90、以沒有生物活性的形式即包涵體的形式存在，而包涵體是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，尤其在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，形成了一些由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在包涵體中除了包含大量的重組蛋白，也含有一些菌體成分，如一些核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白、環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，還有脂體、脂多糖等，大小為0.5～1μm，它們具有很高的密度(約為1.3mg/ mL) ，無定形，呈非水溶性。當(dāng)重組蛋白以包涵體的形式存在時(shí)，能夠獲得高表達(dá)、高

91、純度的重組蛋白，去除了幾乎全部的細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)[14]，同時(shí) ，因形成包涵體避免了蛋白水解酶對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的降解而大大提高產(chǎn)率[15,16]，通常其表達(dá)量可占菌體總蛋白的 10 %～30 %，甚至高達(dá) 50 %[17]，但包涵體不具有生物活性，需要通過體外重折疊技術(shù)使包涵體復(fù)性才能恢復(fù)其天然構(gòu)象并表現(xiàn)出生物活性[18]。</p><p>　　包涵體形成的原因主要有以下幾種：(1)重組蛋白表達(dá)量過高 ，以往研究發(fā)現(xiàn)

92、在重組蛋白低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高就越容易形成包涵體[19]。其原因可能是由于合成速度太快 ，以至于沒有足夠的時(shí)間對(duì)重組蛋白進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)，過多蛋白間的非特異性結(jié)合，致使蛋白質(zhì)沒辦法達(dá)到足夠的溶解度等。(2)所需的目的重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，真核糖蛋白無法糖基化致使中間體溶解度下降，導(dǎo)致不溶解包涵體形成[20]。(3)重組蛋白分泌序列的存在阻礙其進(jìn)行折疊，導(dǎo)致有錯(cuò)誤折疊的分子產(chǎn)生。(4)重組蛋白的氨基酸組成

93、中，通常其含硫氨基酸越多就越容易形成包涵體。(5)從包涵體形成動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，包涵體是由部分變性的中間體聚合而成。因此，任何能夠影響到中間體穩(wěn)定性的因素，如 pH值(pH接近重組蛋白等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體)、離子強(qiáng)度和溫度都能夠引起蛋白聚合反應(yīng)。(6)在細(xì)菌分泌的某個(gè)階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、 疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。(7)有報(bào)道認(rèn)為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質(zhì)的表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)條件不佳時(shí)，容易形成包涵體[21]。&

94、lt;/p><p>　　本論文選擇香魚補(bǔ)體C9蛋白作為研究對(duì)象，通過利用大腸桿菌對(duì)C9重組蛋白的大量表達(dá)，在對(duì)C9重組蛋白包涵體進(jìn)行提取純化過程中，利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析篩選出最適的洗滌液配方，以便為后續(xù)分析其蛋白功能關(guān)系及C9抗血清制備奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2實(shí)驗(yàn)材料與方法</b></p><p>　　2.1 原料、儀

95、器和試劑 </p><p>　　2.1.1 原料與試劑 </p><p><b>　　(1)菌株：</b></p><p>　　(2)質(zhì)粒：

96、 </p><p>　　(3)主要化學(xué)試劑：</p><p>　　2.1.2主要儀器 </p><p>　　2.1.3主要試劑及其配制</p><p>　　(1) 菌體培養(yǎng)及

97、保存所用試劑 </p><p>　　(a) LB液體培養(yǎng)基：NaCl 0.5%，酵母抽提物0.5%，胰蛋白胨1%，用NaOH調(diào)pH至7.4，在151bf∕in(1.034x105)高壓蒸汽中滅菌20min。

98、 </p><p>　　(b) LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂至1.5%，高壓滅菌。</p><p>　　(c) 20%甘油：加20mL甘油于適量水中，加水定容至100mL過壓滅菌后于4℃保存，備用。</p>&

99、lt;p>　　(d) IPTG保存液(100mM):500mg IPTG溶于20mL蒸餾水，用濾膜進(jìn)行無菌過濾，分裝保存于-20℃。 </p><p>　　(e) 卡那霉素注射液：硫酸卡那霉素360mg和甲氧芐啶18mg，蒸餾水定容至2mL。</p><p>　　(2) 2×SDS-PAGE上樣緩沖液：50mmol/L Tris-HCl(pH 6.8)，100mmol/L

100、 DTT，2%SDS，0.01%溴酚藍(lán)，20%甘油，配制20mL。</p><p><b>　　(3) 洗滌液配方</b></p><p>　　(a) PBS洗滌液：300mM KCl，稱取KCl 11.185g； 50mM KH2PO4，稱取KH2PO4 3.4g，加入容量瓶中，用蒸餾水定容500 mL，攪拌充分溶解，用KOH和HCl調(diào)節(jié)pH至8.0；</p&

101、gt;<p>　　(b) PBS-1(PBS pH 8.0+2%脫氧膽酸鈉)：加0.05g 脫氧膽酸鈉于50mLPBS洗滌液中；</p><p>　　(c) PBS-2(PBS pH 8.0+0.5%Triton-X100)：加250μL Triton-X100于50 mLPBS洗滌液中；</p><p>　　(d) PBS-3(PBS pH 8.0+0.5%Triton-X

102、100+4M尿素)：加250μL Triton-X100和12g 尿素于50mLPBS洗滌液中；</p><p>　　(e) PBS-4(PBS pH 8.0+0.5% Triton-X100+4M 尿素+2%脫氧膽酸鈉)：加250μLTriton-X100、12g 尿素和0.05g 脫氧膽酸鈉于50mL PBS洗滌液中。</p><p>　　(4) SDS-PAGE凝膠電泳所用試劑

103、 </p><p>　　(a) 30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N，N’－亞甲丙烯酰胺1g，溶于60mL水中，定容至100mL，濾紙過濾后使用。</

104、p><p>　　(b) 5xTris-甘氨酸電泳緩沖液：15.1g Tris堿，44g甘氨酸，5g SDS，加水至1000mL。</p><p>　　(c) 1.5mmol∕L Tris-Cl(pH8.8)：在800mL水中溶解186.71gTris，調(diào)pH8.8，定容至1000mL。

105、 </p><p>　　(d) 0.5mmol∕L Tris-Cl(pH6.8)：在800mL水中溶解121.14gTris，調(diào)pH6.8，定容至1000mL。 </p><p>　　(e) 10%SDS：900mL水中溶解100g電泳級(jí)SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，加水定容至1L，分裝備