食品科學(xué)與工程畢業(yè)論文林蛙皮中多糖提取方法的比較

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　林蛙皮中多糖提取方法的比較</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品科學(xué)與工程

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　摘 要</b></p

3、><p>　　中國(guó)林蛙（Rana chensinensis David）又名蛤什蟆，屬兩棲綱、無(wú)尾目、蛙科、蛙屬，是集藥用、食補(bǔ)、美容功能于一體的珍稀兩棲類動(dòng)物，具有很高的應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)潛力。</p><p>　　本文以東北林蛙皮為實(shí)驗(yàn)材料，以多糖的提取率為考察指標(biāo)，將林蛙皮粉碎，過(guò)篩，活性炭脫腥，比較熱水提取法、堿提取法、酶提取法三種不同提取方法的提取效果，并用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。實(shí)驗(yàn)

4、結(jié)果表明，酶法提取效果最佳，其次是熱水提取法和堿提取法。采用正交試驗(yàn)法對(duì)酶法提取多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出其最佳提取工藝條件為：酶用量2%，胃蛋白酶與胰蛋白酶比2:1，提取溫度50℃，提取時(shí)間7h，多糖提取率為0.91%。</p><p>　　關(guān)鍵詞：林蛙皮；多糖；酶法；正交試驗(yàn)</p><p><b>　　Abstract</b></p><p&g

5、t;　　Chinese forest frog ( Rana chensinensis David ) aka Hashima, belonging to the Amphibia,Anura, frog, Rana, is a set of medical, food, cosmetic functions in one of the rare amphibian animal, has very high value for app

6、lication and promising future.</p><p>　　The skin of Rana dybowskii is used as experimental material, with the extraction rate of polysaccharide as an index. Crushing the forest frog skin , sieving it, activa

7、ted carbon deodorization, compared with hot water extraction, alkali extraction, enzyme extraction of three different extraction methods, and by phenol sulfuric acid method for the determination of polysaccharide content

8、. The experimental shows that enzymatic extraction has the best effect, , followed by hot water extraction and al</p><p>　　Key words: forest frog skin; polysaccharide; enzyme method; orthogonal test </p&g

9、t;<p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘 要1</b></p><p>　　Abstract1</p><p><b>　　目 錄2</b></p><p><b>　　第一章 前 言4</b>&l

10、t;/p><p>　　第二章 文獻(xiàn)綜述5</p><p>　　2.1 中國(guó)林蛙5</p><p>　　2.1.1 中國(guó)林蛙的特征5</p><p>　　2.1.2 林蛙的功能作用6</p><p>　　2.1.3 林蛙的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀7</p><p><b>　　2.2林蛙皮

11、7</b></p><p>　　2.2.1林蛙皮的功能7</p><p>　　2.2.2 林蛙皮研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景10</p><p><b>　　2.3多糖11</b></p><p>　　2.3.1 多糖的概念11</p><p>　　2.3.2多糖的結(jié)構(gòu)12</p

12、><p>　　2.3.3 多糖的功效12</p><p>　　2.3.4 多糖的分離提純方法概述12</p><p>　　第三章 實(shí)驗(yàn)部分14</p><p>　　3.1材料與設(shè)備14</p><p>　　3.1.1原材料14</p><p>　　3.1.2主要儀器14</p>

13、;<p>　　3.1.3主要試劑14</p><p>　　3.2蛙皮多糖含量的測(cè)定15</p><p>　　3.2.1 苯酚-硫酸法測(cè)定蛙皮多糖的含量15</p><p>　　3.2.2 多糖提取率的計(jì)算15</p><p>　　3.3 林蛙皮多糖提取方法的比較15</p><p>　　3.3.

14、1 熱回流法提取蛙皮多糖15</p><p>　　3.3.2 酶法提取蛙皮多糖16</p><p>　　3.3.3 堿法18</p><p>　　3.4 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化蛙皮多糖的提取工藝19</p><p>　　3.5 結(jié)果與討論20</p><p>　　3.5.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制20</p>

15、;<p>　　3.5.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析21</p><p>　　3.5.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化蛙皮多糖提取工藝結(jié)果分析25</p><p>　　第四章 結(jié)論與展望28</p><p><b>　　4.1 結(jié)論28</b></p><p><b>　　4.2 展望28</b>&l

16、t;/p><p><b>　　致 謝29</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)30</b></p><p><b>　　第一章 前 言</b></p><p>　　中國(guó)林蛙( Rana chensinensis David) 又名蛤什蟆。屬兩棲綱、無(wú)尾目、蛙科、蛙

17、屬[1]，主產(chǎn)東北, 屬國(guó)家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究?jī)r(jià)值的陸生野生動(dòng)物中經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的兩棲動(dòng)物[2]，世界自然保護(hù)聯(lián)盟( IUCN) 列其為易危物種[3] 。</p><p>　　林蛙營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，俗稱“大補(bǔ)品” 由于其以昆蟲(chóng)類為食物亦稱“農(nóng)林衛(wèi)士”和“純綠色食品”，因此在近幾年的市場(chǎng)上顯現(xiàn)出巨大的商機(jī)。由于其具有極高的藥用和保鍵價(jià)值并且含有純正綠色野味的食用價(jià)值逐漸被人們認(rèn)識(shí)和利用開(kāi)發(fā)，導(dǎo)致東北林蛙

18、地區(qū)的人們無(wú)限制的滅絕式捕殺這一類野生動(dòng)物，使這一珍稀的野生資源逐年減少，產(chǎn)需失衡，日趨枯竭，成為瀕危物種。</p><p>　　隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和城市建設(shè)的不斷發(fā)展，人們對(duì)土地、森林、草場(chǎng)的利用不盡合理，中國(guó)林蛙的適生環(huán)境遭到破壞，導(dǎo)致生態(tài)平衡失調(diào)，從而危及中國(guó)林蛙的生存和繁衍。建國(guó)初期，中國(guó)林蛙分布區(qū)的森林覆蓋率為79.8%，1980年降為65.2%， 1987 年又降到58%[4] 。中國(guó)林蛙分布區(qū)內(nèi)廣泛使用

19、化學(xué)除草劑、殺蟲(chóng)劑、化學(xué)肥料等，以及山區(qū)、半山區(qū)的工廠、礦山長(zhǎng)期排放大量的廢水、廢氣、廢渣, 使中國(guó)林蛙的生存環(huán)境變得十分惡劣，蝌蚪難以成活，繁殖受阻，活動(dòng)空間變小。加上對(duì)野生資源的過(guò)度捕抓(利用)，目前約有60%～70%的適生區(qū)域，中國(guó)林蛙分布密度劇烈下降，有的地區(qū)甚至很難找見(jiàn)。近年來(lái)中國(guó)林蛙的人工養(yǎng)殖在其主產(chǎn)地東北已初具規(guī)模, 并且正朝著產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展, 養(yǎng)殖中國(guó)林蛙的經(jīng)濟(jì)效益十分可觀。開(kāi)展中國(guó)林蛙資源狀況調(diào)查, 對(duì)保護(hù)林蛙資源和促

20、進(jìn)中國(guó)林蛙養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展都具有重要意義[5]。</p><p>　　林蛙全身是寶：其中林蛙皮是高級(jí)制革業(yè)的主要資源；林蛙卵富含卵磷脂和性激素；林蛙肉因其高蛋白[6]、低脂肪的特性可加工高級(jí)保健品；林蛙雌蛙輸卵管干燥物即哈士蟆油，是極其珍貴的藥材。哈士蟆油是我國(guó)醫(yī)學(xué)中的滋補(bǔ)強(qiáng)壯之藥，有補(bǔ)虛、增精、退熱、解毒、消腫、潤(rùn)肺、健脾胃、益肝腎之功， 可治療失眠眩暈和神經(jīng)衰弱、脾胃虛弱、咳嗽肺虛、體弱氣虛、水腫腹脹、創(chuàng)

21、痛腫毒、瘡疾和肝炎、肺結(jié)核等疾病[7] 。</p><p>　　目前國(guó)內(nèi)外對(duì)林蛙的研究主要集中在膠原蛋白這一塊，對(duì)林蛙多糖的研究較少，其實(shí)動(dòng)物多糖在降血壓，增強(qiáng)免疫，抗腫瘤這些方面有很好的療效，—些動(dòng)物多糖具有排除腸道毒素和降低重金屬對(duì)人體的毒害、抗輻射、防齲齒等方面的保健作用。另外，殼聚糖含有游離氨基顯堿性，在胃里能中和胃酸，形成一層保護(hù)膜，可輔助治療胃酸過(guò)多癥和預(yù)防消化性胃潰瘍；透明質(zhì)酸具有保持皮膚彈性的功能

22、，還能保留大量水分子，對(duì)皮膚具有保濕作用[8]。</p><p>　　本論文的研究?jī)?nèi)容主要包括兩部分：第一部分是酶法，堿法[9]，熱水浸提法[10]林蛙皮中多糖的方法敘述；第二部分優(yōu)化比較最佳工藝。</p><p><b>　　第二章 文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　2.1 中國(guó)林蛙</b></p>

23、;<p>　　2.1.1 中國(guó)林蛙的特征</p><p>　　中國(guó)林蛙俗稱“哈士蟆”或“哈什蟆”、黃蛤蟆或油蛤蟆，醫(yī)藥界又稱“田雞”。在動(dòng)物學(xué)分類上，屬于脊索動(dòng)物門，脊椎動(dòng)物亞門，兩棲綱，無(wú)尾目，蛙科，林蛙屬，是中國(guó)著名的集藥。[本草綱目]記載：哈什螞，[本草綱目]中稱之“山哈”，別名哈什螞、雪哈。中國(guó)林蛙，形狀似蛤蟆，古時(shí)，女真人（滿族）稱之為哈什螞，意為圣潔。民間傳說(shuō)哈什螞以人參為食，吃靈芝草而

24、冬眠，是一種能賜福、消災(zāi)的吉祥物 ?，F(xiàn)今被命名為中國(guó)林蛙。主要產(chǎn)于我國(guó)東北的長(zhǎng)白山區(qū)，是東北地區(qū)特有的蛙種中國(guó)東北林蛙是國(guó)家保護(hù)動(dòng)物。自明代始，即為供品,被立為皇家食譜中“三寶”(哈什螞、紅景天、不老草)。清太祖努爾哈赤用中國(guó)林蛙祭祖,由此，中國(guó)林蛙成為清王朝宮廷貢品，被列為八珍之首（螞、參、翅、骨、肚、窩、掌、筋），中華人民共和國(guó)建國(guó)后，中國(guó)林蛙被立為中國(guó)“四大山珍”（熊掌、林蛙、飛龍、猴頭）。</p><p>

25、;　　從中國(guó)林蛙皮中提取到的保濕因子，添加到化妝品中，可以起到極佳的保濕效果。從中國(guó)林蛙卵中提取到的低分子活性物質(zhì)，可以用其生產(chǎn)美容產(chǎn)品，減緩人體皮膚衰老。蛙頭、蛙皮、蛙肝臟等部位均是制造保健、美容食品的極佳原料[11]。提取到林蛙油后的副產(chǎn)品，如骨骼、內(nèi)臟、肌肉等也可作為毛皮動(dòng)物的飼料，又可浸泡后入藥。林蛙除了藥用、美容、保健、飼料價(jià)值外，在中國(guó)東三省和廣東、臺(tái)灣及東南亞等地又被人們充分的認(rèn)可，具有純天然的綠色的藥用和食用價(jià)值，因而，

26、具有廣泛的消費(fèi)市場(chǎng)。 </p><p>　　中國(guó)林蛙雌蛙體長(zhǎng)約為71～90mm，雄蛙較??；頭長(zhǎng)寬相等或略寬，頭較扁平；吻棱較明顯，吻端鈍圓，略突出于下頜；鼻間距大于眼間距而與上眼瞼寬，鼻孔位于吻眼之間；鼓膜顯著，且大于眼徑的一半，位于內(nèi)鼻孔內(nèi)側(cè)的犁骨齒兩短斜行，前肢較為短壯，指端較圓，指細(xì)長(zhǎng)，指長(zhǎng)順序?yàn)?、4、2、第1、3指幾等長(zhǎng)；指基下瘤、關(guān)節(jié)下瘤及內(nèi)外掌突均較為顯著。后肢長(zhǎng)。脛跗關(guān)節(jié)前可達(dá)到眼或略超過(guò)，左右

27、跟部則明顯重疊，脛長(zhǎng)超過(guò)體長(zhǎng)的一半，足與脛等長(zhǎng)或者略長(zhǎng)；趾端較鈍圓；趾較細(xì)長(zhǎng)，第3、5趾達(dá)第4趾的第2、3關(guān)節(jié)下瘤的中部，蹼發(fā)達(dá)，除第4趾以外，其余的各趾的蹼多少至趾端然而蹼緣缺刻較大，外側(cè)的跖間有蹼而不發(fā)達(dá)；關(guān)節(jié)下瘤小而明顯，內(nèi)跖突窄而長(zhǎng)，外跖突小而圓。皮膚上微小痣粒較多，口角后端的頜腺非常明顯，背側(cè)的褶在顳部不平直而且成曲折狀，在鼓膜上方的側(cè)褶略微斜向外側(cè)，隨即又折向中線處，再向后延伸達(dá)胯部；兩側(cè)的褶間有少數(shù)分散疣粒，在肩部則有排成

28、“人”形者。腹面皮膚光滑。兩眼間深色橫紋及鼓膜處三角斑較清晰，背面與體側(cè)有分散黑斑點(diǎn)，通常都在疣粒上；四肢的橫斑清晰；腹面的灰色斑點(diǎn)頗多，有的甚至從咽至腹后都存在斑紋。雄蛙前肢較為粗壯，第1</p><p>　　蛤士蟆1年的生活周期可分為水中生活和陸地生活兩個(gè)明顯不同的階段。水中生活階段是在較深的水域中進(jìn)入冬眠狀態(tài)，以渡過(guò)寒冷的冬季，一般從9月下旬到翌年4月中旬，歷時(shí)150～180天。此時(shí)的蛤士模多群集于水下穴洞

29、之中，不食少，新陳代謝降到極低水平；陸地生活階段是到春季冰雪溶化，水溫變暖時(shí)，冬眠的蛤士蟆漸漸開(kāi)始活動(dòng)，隨著水溫和氣溫的升高陸續(xù)上岸。此時(shí)的雌雄蛙體生殖腺均已成熟，在溫暖的淺水池沼、田水中“抱對(duì)”和產(chǎn)卵，排精，在水體外受精，形成受精卵。蛤十蟆完成生殖活動(dòng)后，即進(jìn)入陸地山林的草叢或灌叢中，營(yíng)陸地生活。隨著氣溫的升高，蛤士模逐漸由低地向高地，由陽(yáng)坡向明坡遷移。此時(shí)援食旺盛，蛙體漸肥，幼蛙也正處于迅速生長(zhǎng)時(shí)期，從9月中旬開(kāi)始，氣溫降到15℃以

30、下時(shí)，蛤土蟆開(kāi)始向山下遷移，陸續(xù)到達(dá)越冬水域周圍，在氣溫降到10℃以下時(shí)，即陸續(xù)進(jìn)入水中，又從陸地生活轉(zhuǎn)入水中生活。蛤士蟆蝌蚪在水中為鰓呼吸，以植物碎屑、藻類、植物嫩芽、嫩葉等為食，為植物性食性期，約30d左右。變成蛙后即離水登陸，轉(zhuǎn)變成動(dòng)物性食性，以昆蟲(chóng)，蜘蛛，蝸牛等活餌為食，因有特殊結(jié)構(gòu)和功能的蛙舌，故有很強(qiáng)的放舌捕捉各種小型飛蟲(chóng)的能力。</p><p>　　2.1.2 林蛙的功能作用</p>

31、<p>　　林蛙因其肉質(zhì)細(xì)嫩、易于消化吸收，受到各種年齡段人的青睞。特別適合體弱多病及老年人食用，具有極高的食補(bǔ)價(jià)值。林蛙經(jīng)烹調(diào)能釋放出大量的肌溶蛋白和氨基酸等含氮浸出物，味道香濃。中國(guó)林蛙因其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，在明清時(shí)已成為貢品，被列為“東北新三寶”（不老草、哈什蟆、紅景天），“四大山珍”（哈什蟆、熊掌、猴頭、飛龍）和宮廷“八珍”（參、骨、肚、翅、蒿、掌、蟆、筋）之列。</p><p>　　林蛙在醫(yī)

32、藥和滋補(bǔ)美容方面均具有卓越功效，如：滋陰補(bǔ)腎、平肝養(yǎng)胃、健腦益智、抗衰駐顏、降血脂血壓、增強(qiáng)免疫力、嫩肌活膚等；對(duì)凍瘡、腳氣和水火燙傷均有奇效。</p><p>　　林蛙還具有滋陰補(bǔ)腎、潤(rùn)肺養(yǎng)胃、補(bǔ)腦益智、提高人體免疫力的功能。林蛙是一種強(qiáng)身健體的滋補(bǔ)中藥，對(duì)氣血兩虧、體虛氣弱、神經(jīng)性頭痛、心悸失眠、精力虧損和產(chǎn)后出血等病癥有顯著療效，是國(guó)內(nèi)外極為緊缺的名貴藥材，在國(guó)際市場(chǎng)享有很高聲譽(yù)，產(chǎn)品供不應(yīng)求[12]。 &

33、lt;/p><p>　　哈士蟆“油”為雌性哈士蟆的輸卵管和卵巢、脂狀物。哈士蟆歷來(lái)作為皇室進(jìn)貢珍品，清朝時(shí)被列為“上八珍”和“八大山珍”之一。在李時(shí)珍的《本草綱目》記載哈士蟆油味甘咸、性平和。具解虛癆發(fā)熱利水、消腫、補(bǔ)虛、尤益產(chǎn)婦。在《中國(guó)藥典》、《中藥大詞典》、《中草藥手冊(cè)》《中國(guó)藥志》等中也記載到哈士蟆油潤(rùn)肺養(yǎng)陰．化精添髓、補(bǔ)腦益智、延緩衰老、用于身體衰弱、產(chǎn)后氣虛、肺癆咳嗽、內(nèi)分泌失調(diào)等。醫(yī)學(xué)研究現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析鑒

34、定哈士蟆油含豐富的不飽和脂肪酸、雌二醇、孕酮、磷脂、18種氨基酸（含8種人體必需氨基酸）、多種維生素和多種人體必需、半必需的微量元素等成分，適應(yīng)用于提高人體的機(jī)體免疫能力、促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、補(bǔ)充雌激素、軟化心惱血管、補(bǔ)腎益精、潤(rùn)肺養(yǎng)陰、延緩衰老、滋膚、降脂等效果?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱其為“綠色軟黃金”而且被定為國(guó)家二級(jí)保護(hù)中藥材[13]。</p><p>　　2.1.3 林蛙的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀</p>

35、<p>　　目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)中國(guó)林蛙的研究多見(jiàn)于雌性林蛙輸卵管——蛤士蟆油的成分和功能等方面的報(bào)道，而有關(guān)林蛙皮廢棄物——林蛙皮中多糖報(bào)道極少。林蛙皮中富含多糖，膠原蛋白等具有特殊分子結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜多樣的生物活性物質(zhì)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值及較大的開(kāi)發(fā)潛力。</p><p><b>　　2.2林蛙皮</b></p><p>　　2.2.1林蛙皮的功能</p

36、><p>　　“東北林蛙皮”有一千古之謎，在其生命停止后，無(wú)論是在水中泡、烈日下曬，還是在陰干的地方存放，它的形體幾十年不會(huì)變質(zhì)、不會(huì)霉?fàn)€。冬季東北林蛙在河水凍成冰時(shí)，由于胸腹呼吸困難，因此可用皮膚進(jìn)行呼吸，夏季在進(jìn)入森林中，用皮膚從土地中、露水中吸水，其性格被堪稱動(dòng)物中典范。林蛙可以用皮膚呼吸并吸收水分，其機(jī)體具有完善的保濕系統(tǒng)，林蛙的某些組織中天然保濕因子含量較高，尤其是保濕因子的典型代表物透明質(zhì)酸(Hyalu

37、ronic acid，HA)的含量與牛眼玻璃體中HA的含量接近，而牛眼玻璃體中HA的含量是至今為止動(dòng)物性原料中HA含量最高的。HA是目前世界公認(rèn)的性能優(yōu)越的保濕因子，其分子中的羧基和其他極性基團(tuán)可與水形成氫鍵而結(jié)合大量的水，當(dāng)含量低于0．1％ 時(shí)，HA可結(jié)合其質(zhì)量1000倍的水 。這種天然保濕因子可使皮膚含水量增加，表皮角質(zhì)層柔軟，改善皮膚表面的血液循環(huán)，增強(qiáng)皮膚彈性，阻止表皮細(xì)胞纖維化。 ，從而起到護(hù)膚作用。HA是皮膚固有的生物物質(zhì)，

38、當(dāng)皮膚所含HA濃度下降時(shí)[14]，可導(dǎo)致皮膚干燥和皺紋的產(chǎn)生，而通過(guò)口服或涂抹HA，可增加體內(nèi)HA及其合成前體，從而有效改善皮膚的保水性和彈性 。HA可維</p><p>　　2.2.1.1 食療價(jià)值</p><p>　　哈士蟆是蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙或黑龍江林蛙的肉。前者，分布于中國(guó)遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、河北、山西、陜西、河南、青海、四川等地；后者，分布于中國(guó)黑龍江、吉林、遼寧等地

39、。獲得雌蛙后，先取出輸卵管，再除去內(nèi)臟；獲得雄蛙，即剖腹去內(nèi)臟。洗凈曬干備用。若鮮用，須除去肉臟和皮。 　　</p><p>　　【性能】味甘、咸，性微溫。能滋養(yǎng)補(bǔ)虛，益腎氣。 　　</p><p>　　【用途】用于體虛營(yíng)養(yǎng)不良或小兒疳積，瘦弱少食；腎氣虛衰，陽(yáng)虛精少。 　　</p><p>　　【用法】煮湯，入菜肴等。 　　</p><p>

40、;　　【附方】雪哈湯：鮮哈士蟆3~5個(gè)，落花生60克。加水煮，以鹽、豬脂 少許調(diào)味服食。落花生與哈士蟆配伍，以增強(qiáng)滋養(yǎng)補(bǔ)虛的作用。用于身體虛弱或疳疾消瘦。哈士蟆油歷來(lái)作為皇室進(jìn)貢珍品，清朝時(shí)被列為“上八珍”和“八大山珍”之一。在李時(shí)珍的《本草綱目》記載哈士蟆油味甘咸、性平和。具解虛癆發(fā)熱利水、消腫、補(bǔ)虛、尤益產(chǎn)婦。在《中國(guó)藥典》、《中藥大詞典》、《中草藥手冊(cè)》《中國(guó)藥志》等中也記載到哈士蟆油潤(rùn)肺養(yǎng)陰．化精添髓、補(bǔ)腦益智、延緩衰老、用于身

41、體衰弱、產(chǎn)后氣虛、肺癆咳嗽、內(nèi)分泌失調(diào)等。醫(yī)學(xué)研究現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析鑒定哈士蟆油含豐富的不飽和脂肪酸、雌二醇、孕酮、磷脂、18種氨基酸（含8種人體必需氨基酸）、多種維生素和多種人體必需、半必需的微量元素等成分，適應(yīng)用于提高人體的機(jī)體免疫能力、促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、補(bǔ)充雌激素、軟化心惱血管、補(bǔ)腎益精、潤(rùn)肺養(yǎng)陰、延緩衰老、滋膚、降脂等效果?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱其為“綠色軟黃金”而且被定為國(guó)家二級(jí)保護(hù)中藥材。</p><p>　　

42、2.2.1.2 林蛙皮的保濕功能</p><p>　　林蛙皮中膠原蛋白的含量可達(dá)48％，而多肽類的含量可達(dá)10％以上。更為難得的是，在林蛙皮中含有天然的保濕因子、典型的代表是透明質(zhì)酸（HA）。目前透明質(zhì)酸（HA）被世界公認(rèn)為是人體皮膚的最理想保濕物質(zhì)，可以通過(guò)其補(bǔ)充體內(nèi)保濕因子的含量，起到鎖住全身水分作用，是目前眼科用藥、美容保健品及國(guó)際上高檔化妝品中必需的保濕營(yíng)養(yǎng)成份。</p><p>

43、　　2.2.1.3 林蛙皮的治療痤瘡功能</p><p>　　研究表明，大孔多肽因子為蛙皮的有效成份且具有廣譜殺菌的功效，可有效的殺滅由皮膚表層引起的豆口、痤瘡而產(chǎn)生的細(xì)菌，在加上其保濕因子的作用，使皮膚表面溫度上升、表皮角質(zhì)層柔軟、血液的循環(huán)得到改善，進(jìn)而可以達(dá)到治療痤瘡、皮膚濕潤(rùn)祛斑的目的。</p><p>　　2.2.1.4 林蛙皮的祛斑功能</p><p>

44、　　林蛙皮的透明質(zhì)酸HA在抗氧化試驗(yàn)中表現(xiàn)出了與谷胱甘肽等非酶自由基清除劑相同的作用，所以它具有對(duì)理想細(xì)胞的保護(hù)作用，可以延緩因?yàn)樽杂苫那趾Χ鸬纳爻林推つw衰老，并且可以改善皮膚的新陳代謝，以此加速皮膚中黑色素的分解，達(dá)到提高皮膚抗病能力的作用。</p><p>　　2.2.1.5 林蛙皮的抗菌功能</p><p>　　林蛙皮膚中的小分子抗菌活性肽具有較強(qiáng)的抗菌的活性，并且他對(duì)革蘭

45、氏陽(yáng)性細(xì)菌均具有抑制作用。通過(guò)與傳統(tǒng)食品防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀活性的比較發(fā)現(xiàn)，林蛙皮膚中的多肽粗提物-多肽Fm對(duì)所選用的4種細(xì)菌種的抑制作用較強(qiáng)。而且經(jīng)一定手段純化后，他的抑菌效果會(huì)更高這是傳統(tǒng)的食品防腐劑所無(wú)法匹敵的，為開(kāi)發(fā)出安全無(wú)毒副作用的天然食品防腐劑來(lái)取代傳統(tǒng)的具有一定毒副作用的化學(xué)合成防腐劑奠定了基礎(chǔ)。另外，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌都是引起某些疾病的致病菌，因此也可以利用抗菌肽于常見(jiàn)的抗生素作用機(jī)理不同，不易產(chǎn)

46、生抗菌株這一特征，將其開(kāi)發(fā)成為新一代的抗菌藥物。</p><p>　　2.2.1.6 林蛙皮的去皺功能</p><p>　　研究結(jié)果表明，林蛙皮中膠原蛋白的含量可達(dá)48％，而多肽類的含量可達(dá)10％以上。林蛙皮中的膠原蛋白，經(jīng)過(guò)口服吸收，可以有效的補(bǔ)充人體衰老的肌膚中流失的膠原蛋白，能提高皮膚彈性，并且能減少皺紋生成。此外，林蛙皮中保濕因子--透明質(zhì)酸HA可以有效提高皮膚中保濕因子的含量，增

47、強(qiáng)皮膚的保水性，并能夠減少由紫外線照射而產(chǎn)生的自由基損害皮膚，可提高皮膚的抗病能力。綜合以上結(jié)果，膠原蛋白可以減輕皮膚的衰老癥狀，使皮膚逐漸恢復(fù)原有彈性。  </p><p>　　林蛙皮中含有大量的多肽類成分，可以防治自身受感染。它的皮腺內(nèi)包含各種活性因子，其包括多肽生長(zhǎng)因子、保濕因子、血管緊張素因子、林蛙生物抗菌因子、舒緩激肽樣多肽、鈴蟾肽類因子、嗎啡因子、促甲狀腺素肽類等14種多肽類因子。

48、研究表明，林蛙皮當(dāng)中抗菌多肽有廣譜抗菌作用，其包括對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌特別對(duì)耐藥株有明顯的抑制作用，還可殺滅皮膚當(dāng)中各種有害的細(xì)菌，有助于減少青春痘生成，并且以不損害真核細(xì)胞為前提對(duì)癌細(xì)胞、病毒和真菌有抑殺作用。亦可用來(lái)治療腸炎、痢疾、胃痛等某些炎癥類的疾病?！?lt;/p><p>　　在世界范圍內(nèi)林蛙油保健效果已得到普遍的共識(shí)，林蛙皮當(dāng)中的活性成分同林蛙油類似，即可促進(jìn)細(xì)胞的修復(fù)，亦可延緩組織細(xì)胞的衰老

49、。當(dāng)代研究證明，林蛙皮的成分組成當(dāng)中含有不同種類的活性因子，它的作用是由一種或幾種生長(zhǎng)因子協(xié)同作用誘導(dǎo)細(xì)胞DNA的分裂和合成。林蛙皮當(dāng)中含有蛙皮素，含豐富的脯氨酸抗菌肽可以預(yù)防創(chuàng)面感染，它的特點(diǎn)是抗菌譜廣，并能在幾分鐘或幾小時(shí)內(nèi)殺死病原菌，且對(duì)正常細(xì)胞是沒(méi)有害的。林蛙的活性蛙皮在治療創(chuàng)傷的過(guò)程中，即有抗感染又有止痛、止血、透氣、保濕和隔絕創(chuàng)面的作用，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的敷料，一方面主動(dòng)參與，促進(jìn)創(chuàng)面愈合；同時(shí)，可以覆蓋創(chuàng)面，是一種新型的膠體生

50、物敷料。</p><p>　　成纖維細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)極為重要的一種細(xì)胞，在創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。隨著年齡的增長(zhǎng)人體內(nèi)透明質(zhì)酸HA的含量逐漸降低，極可能與老化時(shí)皮膚彈性的下降有關(guān)。林蛙皮當(dāng)中膠原蛋白的含量可達(dá)到48%，多肽類得含量可達(dá)到10%以上，透明質(zhì)酸（HA）的含量極為豐富，這幾種成分則是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所必需的基質(zhì)。人類的皮膚內(nèi)透明質(zhì)酸HA伴隨著衰老，特別是光導(dǎo)致的老化，透明質(zhì)酸（HA

51、）的含量會(huì)逐漸減少，同時(shí)皮膚的保濕能力也有所下降。在機(jī)體內(nèi)透明質(zhì)酸HA以它特有的理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)成就了很多重要的生理功能。它具有特殊的持水作用，是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的在自然界中保濕性最佳的一種物質(zhì)，故被稱為理想天然保濕因子（NMF)。人類皮膚的成熟和老化過(guò)程亦隨著透明質(zhì)酸（HA）的新陳代謝和含量多少而變化，適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充透明質(zhì)酸（HA）可以改善皮膚的營(yíng)養(yǎng)代謝，從而使皮膚去皺、光滑、柔嫩、提高彈性、預(yù)防皮膚衰老。通過(guò)研究可知，林蛙皮的提取液能顯著提高

52、成纖維細(xì)胞增殖，其中透明質(zhì)酸HA成分極可能起重要作用，從而進(jìn)一步證明林蛙皮可以促進(jìn)傷口愈合、恢復(fù)衰老皮膚的彈性以及治療燒傷等過(guò)程作用機(jī)制，成為林蛙皮應(yīng)用于臨床的理論根據(jù)。</p><p>　　2.2.2 林蛙皮研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景</p><p>　　中國(guó)林蛙皮成份組成中含有活性因子―――它是蛋白質(zhì)和肽類，其作用是一種或幾種生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA的合成和分裂，其結(jié)構(gòu)與人體生物皮類

53、同。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)此已有所熟悉，如：血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮因子、酸性或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、生物抗菌因子等，某些生長(zhǎng)因子也有趨化作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的血管形成因子?？煞乐箘?chuàng)面感染，其特點(diǎn)是抗菌譜廣，能在幾分鐘或幾小時(shí)內(nèi)殺死病原菌，而且對(duì)正常細(xì)胞是無(wú)害的。中國(guó)林蛙活性蛙皮在治療創(chuàng)傷中，即有隔絕創(chuàng)面又有止血、止痛、保濕、透氣、抗感染的作用，是不可多得的生物敷料?？纱?zhèn)?/p>

54、統(tǒng)敷料，它一方面可以覆蓋創(chuàng)面，同時(shí)，主動(dòng)參與和促進(jìn)創(chuàng)面愈合，是一種新型膠體生物敷料。</p><p>　　同時(shí)林蛙皮中含有豐富的透明質(zhì)酸，HA是一種高分子量的直鏈多糖，由N-乙酰氨基葡糖和葡糖醛酸二糖單位重復(fù)交替連接形成。HA廣泛的分布于動(dòng)物和人體的結(jié)締組織中，但不同組織來(lái)源的HA化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同，只是在含量多少和相對(duì)分子量大小上存在差異，沒(méi)有種屬特異性。經(jīng)過(guò)多年的研究，人們對(duì)HA的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生理功能已有了

55、明確的認(rèn)識(shí)。它在水溶液中的無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)和它的流體動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)賦予其重要的物理特性，即高度粘彈性、可塑性、滲透性和良好的生物相容性，作為一種可吸收、可降解的生物材料，其應(yīng)用研究領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，表現(xiàn)出良好的市場(chǎng)前景。由于HA具有保濕功能，廣泛用于化妝品和口服美容保健食品中；作為粘彈性保護(hù)劑，用于眼科手術(shù)和關(guān)節(jié)疾病的治療；作為媒介在滴眼液中廣泛應(yīng)用；交聯(lián)的HA在粘連的預(yù)防和軟組織修復(fù)等應(yīng)用中獲得成功；HA與其他藥物反應(yīng)形成的加合物對(duì)藥物發(fā)揮控釋

56、作用，可達(dá)到定向和定時(shí)釋放的目的。林蛙皮表面濕潤(rùn)、裸露，為抵御環(huán)境有害因子侵襲，在自然選擇的過(guò)程中，經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化，其皮膚分泌液中含有大量具有防御功能的抗菌活性物質(zhì)。此種物質(zhì)能抑制部分菌種的生長(zhǎng)，可以將其開(kāi)發(fā)為低毒、高效藥用資源或食物保鮮劑。</p><p>　　目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)中國(guó)林蛙的研究多見(jiàn)于雌性中國(guó)林蛙輸卵管——蛤士蟆油的成分和功能等方面的報(bào)道，而對(duì)中國(guó)林蛙皮膚活性物質(zhì)的研究少有報(bào)導(dǎo)。蛙類皮膚中含有豐富的具有特

57、殊分子結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜多樣的生物活性物質(zhì)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值及較大的開(kāi)發(fā)利用潛力。</p><p>　　國(guó)外對(duì)蛙類皮膚中的活性多肽的研究有40多年的歷史。從70年代開(kāi)始，就已大規(guī)模地從兩棲類動(dòng)物皮膚及其分泌物中尋找具有藥用價(jià)值的生物活性物質(zhì)，已涉及到600多種蛙類，從中提取出100多種活性肽，其中對(duì)部分蛙皮多肽抗生素的結(jié)構(gòu)、功能與性質(zhì)等方面, 已做了深入研究。這些活性肽的結(jié)構(gòu)功能各不相同，其中抗菌肽具有分子量小、水

58、溶性好、抗原性低、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，不但能夠抗細(xì)菌，而且能夠抗真菌、抗原蟲(chóng)、抗腫瘤、抗病毒，對(duì)哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞卻只有很低的毒性?？稍谑称饭I(yè)中作為天然防腐劑加以應(yīng)用。</p><p><b>　　2.3多糖</b></p><p>　　2.3.1 多糖的概念</p><p>　　均一性多糖：由一種單糖分子縮合而成的多糖，叫做均一性多糖。自然界中最

59、豐富的均一性多糖是淀粉和糖原、纖維素。它們都是由葡萄糖組成。淀粉和糖原分別是植物和動(dòng)物中葡萄糖的貯存形式，纖維素是植物細(xì)胞主要的結(jié)構(gòu)組分。</p><p>　　動(dòng)物多糖是從動(dòng)物體內(nèi)分離提取出的，具有多種生物活性的一類多糖，主要有海參多糖( sea cucumber polysaccharides)、殼聚糖( chitosan)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)等。 </p>&

60、lt;p>　　2.3.2多糖的結(jié)構(gòu)</p><p>　　多糖（polysaccharide）是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過(guò)10個(gè)以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式（C6H10O5）n表示。由相同的單糖組成的多糖稱為多糖，如淀粉、纖維素和糖原；以沒(méi)的單糖組成的多糖稱為雜多糖，如阿拉伯膠是由戊糖和半乳糖等組成。多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì)，而是聚合程度不同的物質(zhì)的混合物。多糖類一般不溶于水，無(wú)甜味

61、，不能形成結(jié)晶，無(wú)還原性和變旋現(xiàn)象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解過(guò)程中，往往產(chǎn)生一系列的中間產(chǎn)物，最終完全水解得到單糖。</p><p>　　2.3.3 多糖的功效</p><p>　　2.3.2.1 降血脂</p><p>　　如殼聚糖可降低血清和肝臟組織中的膽固醇含量和脂肪水平，在降血脂、減肥、預(yù)防高血壓等方面發(fā)揮著重要的保健作用。</p>

62、<p>　　2.3.2.2 抗病毒及抗癌[15]</p><p>　　海參多糖可對(duì)抗多種動(dòng)物腫瘤的生長(zhǎng)，并能提高機(jī)體的細(xì)胞免疫力，改善和增強(qiáng)因腫瘤或使用抗癌藥物引起的機(jī)體免疫功能低下?tīng)顩r[16]。殼聚糖也有增強(qiáng)免疫力、防腫瘤作用，能促進(jìn)動(dòng)物對(duì)大腸桿菌和病毒感染產(chǎn)生非專一性的宿主抵抗性，增加抗體生成，并可以誘導(dǎo)白介素、增殖因子和干擾素的產(chǎn)生，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)劑的功能[17]。</p><p

63、>　　2.3.2.3 其它用途</p><p>　　—些動(dòng)物多糖具有排除腸道毒素和降低重金屬對(duì)人體的毒害、抗輻射[18]、防齲齒等方面的保健作用。另外，殼聚糖含有游離氨基顯堿性，在胃里能中和胃酸，形成一層保護(hù)膜，可輔助治療胃酸過(guò)多癥和預(yù)防消化性胃潰瘍；透明質(zhì)酸具有保持皮膚彈性的功能，還能保留大量水分子，對(duì)皮膚具有保濕作用。</p><p>　　2.3.4 多糖的分離提純方法概述<

64、;/p><p>　　2.3.3.1 熱水提取法[19]</p><p>　　該法所得多糖提液可直接或離心除去不溶物；或者利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，用高濃度乙醇沉淀提純多糖[20]；但由于不同性質(zhì)或不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖沉淀所需乙醇濃度不同，它也可以用于樣品中不同多糖組分的分級(jí)分離；還可按多糖不同性質(zhì)在粗分階段利用混合溶劑提取法對(duì)植物中不同的多糖進(jìn)行分離；其中，以乙醇沉淀最為普遍。<

65、/p><p>　　2.3.3.2 堿法提取多糖</p><p>　　有些多糖適合用稀酸或堿溶液提取，才能得到更高的提取率[21]。但酸堿提取法有其特殊性，因多糖類的不同而異。只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢(shì)，而且即使有優(yōu)勢(shì)，在操作上還應(yīng)嚴(yán)格控制酸堿度。因?yàn)槟承┒嗵窃谒嵝曰蛘邏A性較強(qiáng)時(shí)，可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。另外，稀酸、稀堿提取液應(yīng)迅速中和或迅速透析，濃縮與醇析而獲得多糖沉

66、淀。</p><p>　　2.3.3.3 酶提取法[22]</p><p>　　酶技術(shù)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用到有效成份提取中的一項(xiàng)生物技術(shù)，在多糖的提取過(guò)程中，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件中分解植物組織，加速多糖的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等的產(chǎn)物，常用的酶有蛋白酶，纖維素酶，果膠酶等.</p><p>　　2.3.3.

67、4 苯酚-硫酸法測(cè)多糖[23]</p><p>　　可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖[24]。苯酚法測(cè)定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10－100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長(zhǎng)下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長(zhǎng)下測(cè)定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測(cè)定，方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)時(shí)基本不受蛋白質(zhì)存在的影

68、響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160min以上[25].</p><p><b>　　第三章 實(shí)驗(yàn)部分</b></p><p><b>　　3.1材料與設(shè)備</b></p><p><b>　　3.1.1原材料</b></p><p>　　林蛙皮粉：林蛙曬干，剝下林蛙皮，用粉碎機(jī)粉碎。

69、</p><p><b>　　3.1.2主要儀器</b></p><p>　?。?）TDZ5-WS型離心機(jī)，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；</p><p>　?。?）GYB30－6D型高壓均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；</p><p>　?。?）HV-10電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；</p>&l

70、t;p>　?。?）UV1102型紫外分光光度儀，上海天美科學(xué)儀器公司；</p><p>　?。?）DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；</p><p>　　（6）FD-1C型冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技有限公司；</p><p>　?。?）RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；</p><p>　　（8）KQ-

71、250DB型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；</p><p>　　3.1.3主要試劑 </p><p>　?。?）濃鹽酸，分析純，北京試劑廠；</p><p>　?。?）濃硫酸，分析純，北京試劑廠；</p><p>　?。?）95%乙醇，分析純，北京試劑廠；</p><p>　?。?）氫氧化鈉，分析純

72、，北京試劑廠；</p><p>　?。?）氯胺T ，分析純，北京試劑廠；</p><p>　?。?）胃蛋白酶，分析純，北京試劑廠；</p><p>　?。?）醋酸鈉 ，分析純，北京試劑廠；</p><p>　　（8）活性炭，北京試劑廠；</p><p>　?。?）硝酸，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；</p>&

73、lt;p>　?。?0）對(duì)苯二酚，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；</p><p>　　（11）亞硫酸鈉，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；</p><p>　?。?2）磷酸二氫鉀，分析純，北京試劑廠；</p><p>　?。?3）高氯酸，分析純，北京試劑廠；</p><p>　?。?4）二甲氨基苯甲醛，分析純，沈陽(yáng)市試劑五廠；</p>&l

74、t;p>　?。?5）異丙醇，分析純，北京試劑廠；</p><p>　　3.2蛙皮多糖含量的測(cè)定</p><p>　　3.2.1 苯酚-硫酸法測(cè)定蛙皮多糖的含量</p><p>　　采用苯酚-硫酸法測(cè)定蛙皮多糖的含量，具體操作步驟如下：精確稱取干燥的葡萄糖0.1g，準(zhǔn)確定溶至1000mL容量瓶。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0. 2、0.4、0. 6、0.8、1.0

75、mL。再加入蒸餾水至1mL, 迅速加入苯酚1mL, 硫酸5mL 后搖勻, 靜止5min, 置沸水浴中加熱15 min，取出迅速冷卻至室溫。用分光光度計(jì)在490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。并且以吸光度值y為縱坐標(biāo)、溶液中葡萄糖濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　表3-1 苯酚-硫酸法中各試劑添加量</p><p>　　3.2.2 多糖提取率的計(jì)算</p><

76、;p>　　式中：C為由吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的相應(yīng)的多糖含量（μg/mL）；</p><p>　　V為樣品稀釋后的體積（ml）；</p><p>　　m為多糖粗提物的質(zhì)量(g);</p><p>　　M為實(shí)驗(yàn)前所用林蛙皮的質(zhì)量(g);</p><p>　　3.3 林蛙皮多糖提取方法的比較</p><p>　　3.

77、3.1 熱回流法提取蛙皮多糖</p><p>　　多糖溶于熱水，不溶于60%以上乙醇，也不溶于氯仿正丁醇。所以用熱水提取，乙醇沉淀除去部分醇溶性雜質(zhì)。因?yàn)闊崴部梢詫⒌鞍最愇镔|(zhì)提取出來(lái)，所以用氯仿正丁醇萃取除去提取液中的蛋白。</p><p>　　將林蛙皮用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，料液比1:8加入蒸餾水，在50℃水浴加熱12h，用離心機(jī)離心取上清液。加入等量體積95%乙醇，靜置24h，用離

78、心機(jī)離心取沉淀物，用95%乙醇洗滌脫水，在50℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥至恒重。</p><p>　　圖3-1 熱水浸提法工藝流程</p><p>　　3.3.1.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比1∶8、林蛙皮20g于35、40、45、50、55℃提取多糖12h，分別離心，取上清液。，用95%醇沉，干燥，得到干粉，準(zhǔn)確稱量干粉

79、的質(zhì)量，計(jì)算提取率和多糖含量，確定合適的提取溫度。</p><p>　　3.3.1.2 液料比對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，分別按液料比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12和林蛙皮20g于錐形瓶中，并于50℃提取12。離心后取上清液，用95%醇沉，干燥，得到干粉，準(zhǔn)確稱量干粉的質(zhì)量，計(jì)算提取率和多糖含量，確定合適的料液比。</p><

80、p>　　3.3.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比1∶5、稱林蛙皮20g于50℃分別提取多糖9、10、11、12、13 h，離心后取上清液，用95%醇沉，干燥，得到干粉，準(zhǔn)確稱量干粉的質(zhì)量，計(jì)算提取率和多糖含量，確定合適的提取時(shí)間。</p><p>　　3.3.2 酶法提取蛙皮多糖</p><p>　　酶法是通

81、過(guò)酶反應(yīng)將原料組織分解，加速有效成分的釋放和提取，選擇適宜條件將影響提取的雜質(zhì)分解去除，促進(jìn)促進(jìn)某些極性低脂溶性成分轉(zhuǎn)化成糖苷類，易溶于水的成分，但因?yàn)槎嗵遣蝗苡?5%以上濃度的乙醇，所以最后用乙醇提取出多糖粗提物。</p><p>　　將林蛙皮用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，料液比1:8加入蒸餾水，勻漿，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至2-3，加2%胃蛋白酶，在50℃水浴加熱6h酶解，在用5%KOH調(diào)節(jié)pH至8-9，加2%的胰蛋白

82、酶，在50℃水浴加熱6h酶解，用離心機(jī)離心取上清液。加入等量體積95%乙醇，靜置24h，用離心機(jī)離心取沉淀物，用95%乙醇洗滌脫水，在50℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥至恒重。</p><p>　　圖3-2 酶法提取蛙皮多糖的工藝流程</p><p>　　3.3.2.1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比1∶5、林蛙皮20g于35、40

83、、45、50、55℃提取多糖6h，分別離心，取上清液。用95%醇沉，干燥，得到干粉，準(zhǔn)確稱量干粉的質(zhì)量，計(jì)算提取率和多糖含量，確定合適的提取溫度。</p><p>　　3.3.2.2 酶比對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，分別按液料比1∶5和林蛙皮20g于錐形瓶中，分別用胃蛋白酶和胰蛋白酶之比為2:1、1:1、1:2、2:2于50℃提取6h。離心后取上清液，用95

84、%醇沉，干燥，得到干粉，準(zhǔn)確稱量干粉的質(zhì)量，計(jì)算提取率和多糖含量，確定合適的酶比。</p><p>　　3.3.2.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比1∶5、稱林蛙皮20g于50℃分別用胃蛋白酶和胰蛋白酶提取多糖4、5、6、7、8 h，離心后取上清液，用95%醇沉，干燥，得到干粉，準(zhǔn)確稱量干粉的質(zhì)量，計(jì)算提取率和多糖含量，確定合適的提取時(shí)間。&

85、lt;/p><p><b>　　3.3.3 堿法</b></p><p>　　堿能破壞細(xì)胞膜，使多糖析出更迅速，選擇適宜條件將影響提取的雜質(zhì)分解去除，促進(jìn)促進(jìn)某些極性低脂溶性成分轉(zhuǎn)化成糖苷類，易溶于水的成分，但因?yàn)槎嗵遣蝗苡?5%以上濃度的乙醇，所以最后用乙醇提取出多糖粗提物。不過(guò)堿能破壞多糖的空間結(jié)構(gòu)和多糖的活性。</p><p>　　圖3-3

86、堿法提取蛙皮多糖的工藝流程</p><p>　　粉碎林蛙皮，過(guò)40目篩，然后加5%KOH5倍，在50℃水浴鍋上攪拌提取2h,用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至7.0，離心取沉淀，沉淀用95％乙醇洗滌脫水，沉淀用鼓風(fēng)干燥機(jī)干燥至恒重。</p><p>　　3.3.3.1 浸提液濃度對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比1∶5、林蛙皮20g于錐形瓶中分別加

87、3%、4%、5%、6%、7%等量于林蛙皮的KOH浸提液50℃提取多糖2h，分別離心，取上清液。，用95%醇沉，干燥，得到干粉，準(zhǔn)確稱量干粉的質(zhì)量，計(jì)算提取率和多糖含量，確定合適的提取溫度。</p><p>　　3.3.3.2 液料比對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，分別按液料比1∶3、1∶4、1∶5、1∶7、1∶8和林蛙皮20g于錐形瓶中，并于50℃提取12。離心

88、后取上清液，用95%醇沉，干燥，得到干粉，準(zhǔn)確稱量干粉的質(zhì)量，計(jì)算提取率和多糖含量，確定合適的料液比。</p><p>　　3.3.3.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　按照上述的提取方法，以液料比1∶5、稱林蛙皮20g于50℃分別提取多糖1、2、3、4、5 h，離心后取上清液，用95%醇沉，干燥，得到干粉，準(zhǔn)確稱量干粉的質(zhì)量，計(jì)算提取率和多糖含量，確定合適的提取時(shí)間。&

89、lt;/p><p>　　3.4 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化蛙皮多糖的提取工藝</p><p>　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，熱水法選取三個(gè)影響因素：料液比，提取溫度，提取時(shí)間，堿法選取三個(gè)影響因素：料液比，堿提液濃度，提取時(shí)間。酶法選取三個(gè)因素：提取時(shí)間、溫度、胃蛋白酶與胰蛋白酶之比。按照L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以多糖提取率為指標(biāo)，確定三種方法對(duì)蛙皮多糖的最佳提取工藝。因素水平見(jiàn)表3-2，3-3，3-4。&

90、lt;/p><p>　　表3-2 熱回流法正交試驗(yàn)因素水平表</p><p>　　表3-3 堿法正交試驗(yàn)因素水平表</p><p>　　表3-4 酶法正交試驗(yàn)因素水平表</p><p><b>　　3.5 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.5.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p>&

91、lt;p>　　表3-5為不同濃度葡萄糖所對(duì)應(yīng)的吸光光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3-4所示。</p><p>　　表3-5苯酚-硫酸法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度值</p><p>　　圖3-5葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0700X-0.0065，相關(guān)系數(shù)R=0.9996，該方程相關(guān)系數(shù)較高，線性

92、關(guān)系較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線較為準(zhǔn)確，可以用來(lái)測(cè)定多糖含量，且誤差相對(duì)較小。</p><p>　　3.5.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析</p><p>　　3.5.2.1熱水浸提法的單因素實(shí)驗(yàn)分析</p><p>　　以多糖提取率為指標(biāo)，考察料液比，提取溫度，提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。</p><p>　　3-6料液比對(duì)多糖提取率的影響</p>

93、<p>　　如圖3-6所示，當(dāng)料液比在1:4到1:8范圍內(nèi)多糖含量增加，料液比在1:8到1:12范圍內(nèi)多糖含量反而降低，因此料液比為1:8為最佳條件.</p><p>　　3-7 溫度對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　由圖3-7所示，35℃到45℃范圍內(nèi)多糖提取量增加明顯，溫度增加到45℃以后是多糖提取量增幅減小，綜合考考選溫度為45℃是為最佳提取溫度。</p>

94、;<p>　　3-8 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　由圖3-8所示，9-12h多糖提取量逐漸增加，超過(guò)12h多糖提取量減少，因此12h為林蛙皮多糖提取的最佳提取時(shí)間。</p><p>　　3.5.2.2 堿法提取多糖的單因素實(shí)驗(yàn)分析</p><p>　　取20g干燥林蛙皮粉碎，過(guò)40目篩，以多糖提取率為指標(biāo)，考察料液比，提取溫度，提取

95、時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。</p><p>　　3-9 料液比對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　由圖3-9所示，當(dāng)料液比1:3-1:5時(shí)多糖提取量增加較明顯，當(dāng)料液比大于1:5時(shí)多糖提取量增加較緩，綜合考慮，當(dāng)料液比為1：5時(shí)為堿法提取的最佳料液比。</p><p>　　3-10 堿提液濃度對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　如圖3-

96、10可知，當(dāng)堿提液濃度為5%時(shí)多糖提取量最高，因此堿濃度為5%是為提取多糖的最佳濃度。</p><p>　　3-11 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　如圖3-11所示，1-3h多糖提取量增加明顯。3-5h開(kāi)始下降，所以3h為多糖提取的最佳提取時(shí)間。</p><p>　　3.5.2.3 酶法提取多糖的單因素實(shí)驗(yàn)分析</p><p&g

97、t;　　林蛙皮粉碎，過(guò)40目篩，以提取時(shí)間、溫度、胃蛋白酶與胰蛋白酶之比為實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以多糖提取率為考察指標(biāo)。</p><p>　　3-12 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　如圖3-12所示，4-6h多糖提取量隨時(shí)間增加而增加，大于7h時(shí)隨時(shí)間增加而減少，因此6h為酶法提取的最佳時(shí)間。</p><p>　　3-13 提取溫度對(duì)多糖提取率的

98、影響</p><p>　　由圖3-13所示，35℃-50℃多糖提取量逐漸增加，大于50℃時(shí)提取量明顯下降，因此得出結(jié)論50℃為酶法提取的最佳溫度。</p><p>　　3-14 酶比對(duì)多糖提取率的影響</p><p>　　該實(shí)驗(yàn)以林蛙皮用量的2%胃蛋白為一個(gè)單位進(jìn)行，由圖3-14可知胃蛋白酶：胰蛋白酶為2:2時(shí)多糖提取量最高，但由于兩酶比為2:1是與之差別不大，綜合

99、考慮選胃蛋白酶：胰蛋白酶為2:1。</p><p>　　3.5.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化蛙皮多糖提取工藝結(jié)果分析</p><p>　　熱回流提取法、堿法和酶法提取蛙皮多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果分別如3-6、3-7、3-8所示。</p><p>　　表3-6 熱回流法正交試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　經(jīng)分析可知，對(duì)熱水法提取多糖影響最大的是提取時(shí)間，其次是提取

100、溫度、料液比。最佳的提取工藝為：提取時(shí)間11h，提取溫度45℃，料液比1:8。對(duì)選定的最佳工藝條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，獲得的林蛙皮中多糖顏色為黃棕色，多糖的提取率為0.47%。</p><p>　　表3-7 堿提取法正交試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　經(jīng)分析可知，對(duì)堿法提取多糖影響最大的是提取時(shí)間，其次是浸提液濃度、料液比。最佳的提取工藝為：提取時(shí)間3h，浸提液濃度5%，料液比1:5。對(duì)選定的最佳

101、工藝條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，獲得的林蛙皮中多糖顏色為黃棕色，多糖的提取率為0.42%。</p><p>　　表3-8 酶法正交試驗(yàn)結(jié)果</p><p>　　經(jīng)分析可知，對(duì)提取率影響最大的是酶比，其次是溫度、提取時(shí)間。最佳的提取工藝為：酶比2:1，提取溫度50℃，提取時(shí)間7h。對(duì)選定的最佳工藝條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，獲得的林蛙皮中多糖顏色為黃棕色，多糖的提取率為0.91%。</p><

102、;p><b>　　第四章 結(jié)論與展望</b></p><p><b>　　4.1 結(jié)論</b></p><p>　?。?）本論文對(duì)林蛙皮中多糖的不同提取方法進(jìn)行了比較，分別利用熱水法、堿法、酶法對(duì)林蛙皮中的多糖進(jìn)行了提取，通過(guò)使用等量林蛙皮，等量浸提液，經(jīng)試驗(yàn)表明酶法為最佳提取方法。</p><p>　?。?）本論文

103、采用酶法，熱水法，堿法三種工藝提取多糖，并確定最佳工藝為酶法提取，最后在單因素的基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗(yàn)確定了提取多糖提取的最佳工藝條件：胃蛋白酶與胰蛋白酶為2:1，提取溫度50℃，提取時(shí)間7h。并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定了多糖的提取率為0.91%。</p><p><b>　　4.2 展望</b></p><p>　　中國(guó)林蛙作為吉林省優(yōu)勢(shì)動(dòng)物資源，尚有許多藥用價(jià)值有待于進(jìn)

104、一步開(kāi)發(fā)利用，林蛙皮是摘取林蛙油后作為飼料或廢棄物的物質(zhì)，富含多種生物活性物質(zhì)，具有很高的綜合利用價(jià)值，如果能將林蛙皮中多糖提取出來(lái)，再加以利用，這樣的話就能變廢為寶，為充分開(kāi)發(fā)林蛙的藥用價(jià)值作出新貢獻(xiàn)。</p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　感謝導(dǎo)師邱老師對(duì)本論文的悉心指導(dǎo)！導(dǎo)師對(duì)本論文的工作傾注了大量的心血！我能順利的完成實(shí)驗(yàn)并如期

105、撰寫(xiě)論文，沒(méi)有老師的支持與鼓勵(lì)是不可能完成的。同時(shí)，導(dǎo)師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，實(shí)事求是的科研作風(fēng)，活躍的科學(xué)思想、淵博的科學(xué)知識(shí)以及豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和高瞻遠(yuǎn)矚的學(xué)術(shù)眼界無(wú)時(shí)無(wú)刻不在影響著我，并將使我受益終身,在這還要特別感謝王志兵老師在百忙之中抽空給我檢查論文，王老師是一位非常優(yōu)秀的教師，祝王老師在以后能取得更多的科研成果。</p><p>　　其次論文期間，我得到了王長(zhǎng)周師兄，季師兄，刑燕學(xué)姐，杜琳學(xué)姐，紀(jì)可學(xué)姐的無(wú)私

106、幫助，同時(shí)也很感謝與我一起在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)的同學(xué)們，謝謝你們的支持！</p><p>　　最后對(duì)在本科期間辛勤培育我的化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院的各位老師表示衷心的感謝！感謝所有老師對(duì)我的辛勤培養(yǎng)和關(guān)心！感謝所有同學(xué)對(duì)我的關(guān)心和支持！</p><p>　　祝各位老師身體健康，工作順利，科研事業(yè)上取得更大的成就。謝謝！</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b

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