甘草多糖提取過程中除蛋白方法的比較研究[畢業(yè)設(shè)計+開題報告+文獻(xiàn)綜述]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(論文)</p><p><b>　　（二零 屆）</b></p><p>　　甘草多糖提取過程中除蛋白方法的比較研究 </p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物工程

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要: 采用水提醇沉法提取甘草粗多糖，采用Sevag法、三氯乙酸法和酶

3、法對甘草多糖進(jìn)行脫蛋白研究。結(jié)果表明：Sevag法、三氯乙酸法和酶法的蛋白含量分別為52.7%、51.8%、47.8%，脫除率分別為35.1％、41.3％、64.8％；多糖含量分別為36%、41.1%、45.3%，損失率分別為18.3％、30.2％、3.3％。比較這三種脫蛋白方法，酶法具有良好的脫蛋白效果。</p><p>　　關(guān)鍵詞:多糖；Sevag法；酶； </p><p>　　Abs

4、tract: Extracting polysaccharide with the method of decoction and alcohol sedimentation.The different ways to removing protein from polysaccharide of Glycyrrhiza among Sevag method, Trimethoxysilane acid method and enzy

5、me is compared. The results showed that Sevag method, Trimethoxysilane acid method and enzyme protein content of 52.7%、51.8%、47.8%, removal rate was 35.1％、41.3％、64.8％; polysaccharide content was 36%、41.1%、45.3% ,loss rat

6、e was 18.3％、30.2％、3.3％. Comparison of three methods of re</p><p>　　Keywords: polysaccharide; Sevag method ; enzyme</p><p>　　; ; </p><p><b>　　目 錄</b></p>

7、<p><b>　　摘要1</b></p><p>　　Abstract.2</p><p><b>　　1 緒論4</b></p><p>　　2 材料與方法5</p><p>　　2.1 材料和試劑5</p><p>　　2.1.1 材料

8、5</p><p>　　2.1.2 試劑和藥品5</p><p>　　2.2 方法…………………………………………………………………………………………...5</p><p>　　2.2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定………………………………………………………………..5</p><p>　　2.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定……………

9、…………………………………………………..6</p><p>　　2.2.3 Sevag法脫蛋白……………………………………………………………………….6</p><p>　　2.2.4 酶法……………………………………………………………………………………6</p><p>　　2.2.5 三氯乙酸法………………………………………………………………………

10、……6</p><p>　　2.2.6 多糖含量的測定…………………………………………………………………….…6.</p><p>　　2.2.7 蛋白質(zhì)含量的測定……………………………………………………………………..7</p><p>　　3 結(jié)果與分析7</p><p>　　3.1 甘草多糖多糖含量和蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果7&

11、lt;/p><p>　　3.1.1 甘草粗多糖的制備結(jié)果7</p><p>　　3.1.2 葡萄糖曲線制作的結(jié)果......7</p><p>　　3.1.3 蛋白質(zhì)曲線制作的結(jié)果................................................8</p><p>　　3.1.4 甘草多糖的樣品測定的結(jié)果

12、............................................9</p><p>　　3.1.5 Sevag法脫蛋白的結(jié)果................................................9</p><p>　　3.1.6 三氯乙酸法的結(jié)果...............................................

13、......9</p><p>　　3.1.7 酶法的結(jié)果..........................................................9</p><p>　　3.2 甘草多糖含量和蛋白質(zhì)含量的數(shù)據(jù)分析.......................................10</p><p><b>　　4

14、 結(jié)論11</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)12</b></p><p><b>　　致 謝13</b></p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　多糖是除核酸和蛋白質(zhì)之外的另一類重要的生命物質(zhì)，廣泛存在于動物、植物、

15、微生物等有機(jī)體中，具有能量儲存、結(jié)構(gòu)支持、防御功能等多方面的生物功能：同時多糖聯(lián)系著細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與外界的能量和物質(zhì)傳遞，決定著大分子與細(xì)胞及與其它分子之間的相互作用。近年來，植物、海洋生物及菌類等來源的多糖己作為有生物活性的天然產(chǎn)物中的一個重要類型出現(xiàn)，各種多糖所具有的抗腫瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相繼被發(fā)現(xiàn)。據(jù)Franz等報道[1]，已有近百種植物的多糖被分離提取鑒定出來，這類多糖來源廣泛且沒有細(xì)胞毒性，應(yīng)用于生物

16、體毒副作用小，因此多糖生物資源的開發(fā)利用和研究日益活躍，成為天然藥物、生物化學(xué)、生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，糖生物學(xué)也被稱為“生物化學(xué)最的巨大前沿之一”[ 1]，成為繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)滯后的另一研究熱點(diǎn)。多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其生物活性與其純度和化學(xué)結(jié)構(gòu)有著重要的關(guān)系。因此，對多糖的研究開發(fā)包含了多糖的提取，分離、純化。</p><p>　　甘草屬植物為豆科蝶形花亞科多年生草本植物。該屬植物共有29種6變種，我國產(chǎn)18種3變

17、種，其中烏拉爾甘草、脹果甘草和光果甘草被各版中國藥典收載，為傳統(tǒng)中藥甘草的來源。甘草作為我國最常用傳統(tǒng)中藥之一，素有“十方九草”之稱，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功效，民間用于治療乳腺炎、胃及十二指腸潰瘍、脾胃虛弱、咳嗽、肝炎、咽喉腫痛、食物中毒等癥[2]。</p><p>　　甘草的現(xiàn)代化學(xué)及藥理活性研究重點(diǎn)多集中在甘草酸、甘草次酸等三萜皂苷類化合物和甘草苷等黃酮類化合物上，而對甘草中

18、另一類重要的生物活性物質(zhì)甘草多糖的研究報道相對較少。而且關(guān)于甘草多糖藥理的文獻(xiàn)較少，主要是關(guān)于抗病毒、抗腫瘤、提高免疫功能方面的。甘草多糖對牛艾滋病病毒(HⅣ)、腺病毒Ⅲ型(AdVⅢ)和柯薩奇病毒(CBV3)有抑制作用。王忱等[3]發(fā)現(xiàn)甘草多糖對于小鼠S-180腫瘤具有抑制作用。鄭堯等[4]通過實(shí)驗發(fā)現(xiàn)甘草多糖(GPS)能提高小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)功能，不僅對特異性免疫功能有促進(jìn)作用，而且對非特異性免疫功能亦有增強(qiáng)。</p&g

19、t;<p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　　2.1 材料和試劑</p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　2.1.2 試劑和藥品</p><p>　　表2-1 主要化學(xué)藥品和試劑</p><p>&

20、lt;b>　　2.2 試驗方法</b></p><p>　　2.2.1 超聲波法提取甘草粗多糖</p><p>　　取甘草100克，粉碎成10-20目大小，放入1000mL的錐形瓶中，加水500mL,水的量最</p><p>　　溢過甘草表面2厘米左右，放入超聲波儀中，提取30分鐘，過濾，重復(fù)一次，合并濾液。減壓濃縮至200ml,加95%的乙醇6

21、00mL，靜置過夜，抽濾，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗三次得到甘草多糖</p><p>　　2.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，</p><p>　　稱取0.5018g干燥的無水葡萄糖，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容制成葡萄糖標(biāo)夜。分別吸取葡萄糖標(biāo)液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6mL置于100ml容量瓶中，用蒸餾水定容。</p>

22、<p>　　稱取50g苯酚，0.05g鋁片，0.15g碳酸氫鈉置于三口瓶中，在180℃下蒸餾，收集餾分，配置成80%的苯酚溶液，用時配成65%的苯酚溶液。測定時，分別取1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)稀釋液于25mL比色管中，加6%苯酚1mL，濃硫酸5mL，用漩渦混合氣混勻后置于50℃水浴中保溫30min，取出冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，在490nm處測吸光度。</p><p>　　2.2.3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

23、</p><p>　　準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白1.0758g，加蒸餾水溶解后移至1000mL容量瓶，定容制成蛋白質(zhì)標(biāo)夜。分別吸取蛋白質(zhì)10,20,40,60,80 mL置于100ml容量瓶中，用蒸餾水定容制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲備液。</p><p>　　準(zhǔn)確稱取考馬斯亮蘭0.1g，用50mL95%乙醇將其溶解后移至1000mL容量瓶中，再加入100mL85%磷酸，用蒸餾水定容，即為考馬斯亮蘭溶液。分別吸

24、取1mL準(zhǔn)蛋白儲備液置于25mL比色管中，加入5mL考馬斯亮蘭溶液，用漩渦混合器混勻后放置2至5min，然后以蒸餾水為空白，在595nm處測吸光值。</p><p>　　2.2.4 Sevag法</p><p>　　取甘草定溶液加入試管中，并向此溶液中加入其體積1/5的氯仿—正丁醇（5:1）溶液，震蕩30min，經(jīng)離心去除沉淀，脫蛋白。脫離心，取上清液，加95%的乙醇至含醇量達(dá)80%，離

25、心，收集沉淀。依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀，沉淀物干燥后得出甘草多糖1。</p><p>　　2.2.5 酶法</p><p>　　準(zhǔn)確稱取胰蛋白酶2g，用pH8的蒸餾水溶解，置于100mL容量瓶中。精確配置0.02g/mL的多糖溶液，取10mL置于錐形瓶中，調(diào)pH為8。將樣品液于酶夜放置37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，然后分別吸取酶液置于錐形瓶中再分別加入蒸餾水。37℃恒溫振蕩器

26、中震蕩30min后，放入100℃水浴鍋中滅酶10min。冷卻至室溫，加95%的乙醇40mL，離心，收集沉淀，依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀，沉淀物經(jīng)干燥后得到甘草多糖2。</p><p>　　2.2.6 三氯乙酸法</p><p>　　取50mL甘草多糖溶液置于錐形瓶中，加入5mL的40%三氯乙酸溶液，混勻放置，離心取上清液，加入95%乙醇200mL，離心，收集沉淀物，依次用無水乙醇

27、，丙酮，乙醚洗滌沉淀，沉淀物干燥得到甘草多糖3。</p><p>　　2.2.7 多糖含量的測定</p><p>　　準(zhǔn)確稱取制備得到的甘草多糖，用蒸餾水溶解后，置于100 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，吸取該稀釋液lml置于25mL比色管，以下操作過程同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過程，按式(1)計算換算因子f=2.3243。</p><p><b>　　式（1）&l

28、t;/b></p><p>　　式中，W為甘草多糖重量，C為甘草多糖在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)葡萄糖的濃度(mg／mL)，D為多糖的稀釋倍數(shù)。</p><p>　　用少量蒸餾水溶解甘草多糖，置于100 mL容量瓶中，定容制成甘草多糖儲備液。吸取甘草多糖儲備液1．00 ml置于25 mL比色管中，以下操作過程同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過程。分別按式(1)、(2)計算多糖含量和多糖損失率。</p>

29、;<p>　　多糖含量(％)= 式（2）</p><p>　　式中，C為甘草多糖在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的葡萄糖濃度(mg／mL)，D為稀釋倍數(shù)，W′為甘草樣品的重量(mg),f為換算因子=2.3243</p><p>　　多糖損失率(％)= 式（3）</p>

30、;<p>　　式中，C1為未經(jīng)脫蛋白處理甘草多糖在標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)葡萄糖的濃度(mg/mL)，C2為經(jīng)過脫蛋白處理甘草多糖在標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)葡萄糖的濃度(mg/mL)。</p><p>　　2.2.8 蛋白質(zhì)含量測定</p><p>　　取1．00ml甘草多糖濃縮液置于25mL比色管中，以下操作過程同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作過程。按照(3)式計算蛋白質(zhì)含量，(4)式計算蛋白質(zhì)去除率。<

31、/p><p>　　蛋白質(zhì)含量(％)= 式(4)</p><p>　　式中，A為甘草溶液中的蛋白質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度(mg/mL)，D為稀釋倍數(shù)，W為甘草樣品的重量(mg)。</p><p>　　蛋白質(zhì)去除率(％) = 式(5)</

32、p><p>　　式中，A1為未經(jīng)脫蛋白處理的甘草溶液中的蛋白質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度(μg/mL)，A2為經(jīng)脫蛋白處理的甘草溶液中的蛋白質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度(μg／ml)。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1葡萄糖與蛋白質(zhì)的測定</p><p>　　3.1.

33、1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定</p><p>　　表3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗結(jié)果</p><p>　　3.1.2蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定</p><p>　　3.1.4 甘草多糖樣品含量測定</p><p>　　甘草多糖樣品多糖含量和蛋白含量的測定鑒2.2.7-2.2.8，結(jié)果如下</p><p>　　3.1.5 sevag法脫

34、蛋白測定結(jié)果</p><p>　　3.1.6 三氯乙酸法脫蛋白含量測定</p><p>　　3.1.7 酶法除蛋白含量的測定</p><p>　　3.2 甘草多糖多糖含量和蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)分析</p><p>　　每種方法對粗甘草多糖處理后都能達(dá)到精制多糖的效果，，通過上表可以看出sevag法處理后甘草多糖含量為30%~41%，蛋白質(zhì)含量為

35、49%~55%。三氯乙酸法處理后多糖含量為38~44%，蛋白質(zhì)含量為48%~55%。酶法處理后多糖含量為43%~47%，蛋白質(zhì)含量為42%~55%。但各個方法都能一定程度上的引起甘草多糖的損失。sevag法，三氯乙酸法，酶法隨著處理次數(shù)的增加甘草多糖的損失越大，sevag法處理后多糖損失率為4.8%~33%，三氯乙酸法為21.3%~38.1%，而酶法僅僅為2.3%~4.2%，可以看出酶法具有良好的脫蛋白和避免甘草多糖損失的方案。<

36、/p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　對于傳統(tǒng)的Sevag法，若要達(dá)到理想的脫蛋效果，就要增加實(shí)驗次數(shù)，但這將造成多糖損失率增加，原因可能是：用氯仿、正丁醇等有機(jī)試劑多次反復(fù)處理所形成的蛋白質(zhì)與氯仿．正丁醇凝膠物中難免夾帶少量多糖物質(zhì)，特別是與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的糖復(fù)合物，容易引起凝聚沉淀，導(dǎo)致多糖得率降低；對于三氯乙酸法、酶法，一次處理即可達(dá)到較好

37、的脫蛋白效果，但是三氯乙酸法造成多糖損失嚴(yán)重，而酶法則較好的保存了多糖。</p><p>　　3種方法在脫蛋白處理后，都有一定的蛋白質(zhì)存在，這是因為甘草多糖本身就含有糖蛋白復(fù)合物。酶法在脫除甘草多糖中蛋白質(zhì)的同時，具有操作條件溫和、利于保持多糖的活性，以及避免了使用有機(jī)試劑帶來的危害等優(yōu)點(diǎn)。所以酶法脫蛋白是一種脫蛋白效率高、操作簡單、多糖損失小的有效脫蛋白的方法。</p><p><

38、b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]國藥典委員會. 中國藥典(一部)[M]. 北京: 科學(xué)出版社,1977，131</p><p>　　[2]HPLC法測定甘草中總黃酮含量.第十屆全國有機(jī)分析學(xué)術(shù)研討會論文集，1998.B127一B128.</p><p>　　[3]呂欣，付玉杰，王微等.紫外分光光度法測定甘草黃酮含量.植物研究，2

39、003,23(2):192一194</p><p>　　[4.李知敏,王伯初,等.植物多糖提取液的幾種脫蛋白方法的比較分析[J].重慶大學(xué)學(xué)</p><p>　　報,2004,27(8):57-59.</p><p>　　[5]高英春,陳鈞.山藥粗多糖脫蛋白方法的對比研究[J].食品科技，2009，34(6):71-74.</p><p>　

40、　[6]張偉,朱連勤,王吉才等.黃芪多糖在增強(qiáng)家禽免疫功能和抗病毒方面的應(yīng)用[J].家禽科學(xué), 2007,1:41-42.</p><p>　　[7]楊曉杰,鄭云姬,等.蒲公英多糖提取中脫蛋白方法的研究[J].高師理科學(xué)刊,2009,29(3):62</p><p><b>　　-64.</b></p><p>　　[8]李厚聰,劉圓,等.薏苡

41、多糖的提取、分離與純化工藝研究[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2009,35(2):278-282.</p><p>　　[9]何傳波,陳玲,等.巴戟天多糖脫蛋白方法的研究[J].食品科技，2006，(6):25-27.</p><p>　　[10]姚新生．天然藥物化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002．</p><p>　　[11]吳壽金，趙泰，秦永祺

42、．現(xiàn)代中草藥成分分析[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002．</p><p>　　[12]張彥民，李寶才，朱利平，等．多糖化學(xué)及其生物活性研究進(jìn)展[J]．昆明理工大學(xué)學(xué)報，2003，28(3)：140—145,149．</p><p>　　[13]秦衛(wèi)東，馬利華，陳學(xué)紅，趙悅. 生姜多糖的提取及脫蛋白研究[J].食品科學(xué)，2008</p><p>　　[14]謝

43、建華，謝明勇。聶少平。等．青錢柳中多糖的測定[J]．分析試驗室，2007，36(8)：32—36．</p><p>　　[15]趙梅，丁霄霖．甘薯糖蛋白脫游離蛋白的研究[J]．食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006，25(1)：89—91．</p><p><b>　　文獻(xiàn)綜述</b></p><p>　　甘草多糖提取過程中除蛋白方法研究</p&g

44、t;<p><b>　　1 前言</b></p><p>　　多糖是除核酸和蛋白質(zhì)之外的另一類重要的生命物質(zhì)，廣泛存在于動物、植物、微生物等有機(jī)體中，具有能量儲存、結(jié)構(gòu)支持、防御功能等多方面的生物功能：同時多糖聯(lián)系著細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與外界的能量和物質(zhì)傳遞，決定著大分子與細(xì)胞及與其它分子之間的相互作用。近年來，植物、海洋生物及菌類等來源的多糖己作為有生物活性的天然產(chǎn)物中的一

45、個重要類型出現(xiàn)，各種多糖所具有的抗腫瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相繼被發(fā)現(xiàn)。據(jù)Franz等報道[1]，已有近百種植物的多糖被分離提取鑒定出來，這類多糖來源廣泛且沒有細(xì)胞毒性，應(yīng)用于生物體毒副作用小，因此多糖生物資源的開發(fā)利用和研究日益活躍，成為天然藥物、生物化學(xué)、生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，糖生物學(xué)也被稱為“生物化學(xué)最的巨大前沿之一”，成為繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)滯后的另一研究熱點(diǎn)。多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其生物活性與其純度和化學(xué)結(jié)構(gòu)有著重要的關(guān)

46、系。因此，對多糖的研究開發(fā)包含了多糖的提取，分離、純化?！?lt;/p><p>　　甘草屬(Glycyrrhiza L)植物為豆科蝶形花亞科多年生草本植物。該屬植物共有29種6變種，我國產(chǎn)18種3變種，其中烏拉爾甘草(G uralensis Fisch．)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat．)和光果甘草(Glycyrrhiza glabra L．)被各版中國藥典收載，為傳統(tǒng)中藥甘草的來源。甘草

47、作為我國最常用傳統(tǒng)中藥之一，素有“十方九草”之稱，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功效，民間用于治療乳腺炎、胃及十二指腸潰瘍、脾胃虛弱、咳嗽、肝炎、咽喉腫痛、食物中毒等癥[2]。</p><p><b>　　2 甘草多糖</b></p><p>　　2.1 甘草多糖的化學(xué)組成 </p><p>　　前蘇聯(lián)學(xué)者曾對光果甘

48、草(Glycyrrhizaglabra L．)和粗毛甘草(Glycyrrhiza asperaPall．)的地上部分和根中的多糖進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明兩者地上部分分別含水溶性多糖0．8％和4．0％，果膠含量均為5．8％，其多糖組分也相似，均由鼠李糖、萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，而光果甘草根中的水溶性多糖則為1．6％f[3]。趙秀英等進(jìn)一步證實(shí)烏拉爾甘草種子中的多糖為半乳甘露聚糖，其摩爾比為1：2．06。劉丙燦等從烏拉爾甘

49、草根的稀堿提取液中分離得到一種分子量為4000Da、無分支的a-D-(1-4)葡聚糖。周蓉等對烏拉爾甘草多糖分離純化后，樣品經(jīng)高效毛細(xì)管電泳分析表明，該多糖組分由鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖組成，并以葡聚糖為主鏈[4]。</p><p>　　2.2．甘草多糖藥理作用研究概況</p><p><b>　　2．1免疫調(diào)節(jié)作用</b></p><p&

50、gt;　　Tomada等研究從烏拉爾甘草根中分得的多糖UA、UB、UC及西北甘草匍匐莖中的多糖GA的活性，發(fā)現(xiàn)UA、UC和GA具有相當(dāng)強(qiáng)的抗補(bǔ)體活性和堿性磷酸酯酶誘發(fā)活性，UB的活性相對較弱[5]。Zhao，J．E等發(fā)現(xiàn)烏拉爾甘草根中的水溶性粗多糖GR具有抗補(bǔ)體，促有絲分裂和增強(qiáng)清除免疫復(fù)合物活性，經(jīng)溴化十六烷基三甲胺作用后產(chǎn)生的5個組分中，含60％半乳糖醛酸的GR-2免疫調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)，抗補(bǔ)體活性和促有絲分裂活性可能是由多糖復(fù)合物中的聚

51、半乳糖醛酸部分引起[6]。</p><p>　　Yamada等研究發(fā)現(xiàn)含烏拉爾甘草等10種草藥的日本復(fù)方藥Juzen-Taiho—To具有免疫調(diào)節(jié)活性，其中的甘草多糖活性最強(qiáng)，過碘酸氧化后活性則降低[7]。Kiyohara，H．進(jìn)一一步證實(shí)Juzen-Taiho．To的激活補(bǔ)體、促有絲分裂、增強(qiáng)IL-2產(chǎn)生能力等活性與其中來自烏拉爾甘草等草藥的多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。果膠類、果膠阿拉伯半乳聚糖的中性l，6-半乳糖和雜

52、多糖側(cè)鏈對其激活補(bǔ)體、促有絲分裂活性的影響較大，而聚鼠李半乳糖醛酸II型多糖經(jīng)硼酸鹽二酯作用產(chǎn)生的二聚體與其IL-2產(chǎn)生能力的增強(qiáng)有關(guān)[8]。</p><p>　　有實(shí)驗對甘草多糖及高碘酸氧化還原產(chǎn)物，控制Smith降解產(chǎn)物的抗補(bǔ)體活性和堿性磷酸酯酶的誘發(fā)活性進(jìn)行了研究，結(jié)果控制Smith降解產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的活性[9]。還有實(shí)驗表明，從甘草的酸性多糖組分中分離的3種酸性多糖(GR-2IIa，GR-2IIb，GR-2

53、IIc、)，具有明顯的抗補(bǔ)體活性，且GR-2IIc具有促有絲分裂活性。GR-2IIc結(jié)構(gòu)中的鼠李半乳糖醛酸聚糖核心PG-1能夠激活內(nèi)毒素介導(dǎo)的凝結(jié)因子，鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(LAL)顯陽性，與甘草多糖的抗補(bǔ)體、促有絲分裂、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞Fc受體興奮性等活性有關(guān)[10]。</p><p>　　Hwang．Bng-Hyum等對烏拉爾甘草根中的粗多糖GU-3及其分離純化組分的活性研究表明，GU-3能促進(jìn)派爾斑介導(dǎo)的骨髓細(xì)

54、胞增殖能力，增強(qiáng)NK-cell介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性，這是由其中的果膠阿拉伯半乳糖醛酸和果膠類引起的[11]。鄭堯等人采用印度墨汁廓清實(shí)驗法測定甘草多糖對小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)中的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能的影響。結(jié)果表明GPS能提高小鼠RES功能，不僅對特異性免疫功能有促進(jìn)作用，而且對非特異性免疫功能亦有增強(qiáng)[12]。另有研究表明，GPS還具有類似LPS的作用，能刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性，且呈作用劑量依賴關(guān)系；主要表現(xiàn)為GPS能刺激巨噬細(xì)胞

55、的吞噬能力、能量代謝水平增強(qiáng)以及IL-1、IL-6、IL-12含量的顯著升高[13]。甘草多糖還具有激活小鼠淋巴細(xì)胞增殖作用，且呈作用劑量依賴關(guān)系，可作為小鼠B淋巴細(xì)胞非特異分裂原[14]。甘草多糖對ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖也有較好的促進(jìn)作用[15]。</p><p><b>　　2．2抗腫瘤作用</b></p><p>　　甘草多糖具有一定的抗腫瘤活性，可以延長腹

56、水瘤小鼠的生存期，抑制實(shí)體瘤的生長。甘草多糖對于小鼠S180腫瘤也具有抑制作用，可影響bcl-2、p53及bax基因蛋白的表達(dá)，這可能是甘草多糖抑瘤作用的一個重要機(jī)制[16]。甘草多糖對S-180荷瘤、艾氏腹水瘤也有明顯的抑制作用， 能夠顯著延長荷瘤小鼠的生命，且對雄性小鼠的抑瘤作用優(yōu)于雌性小鼠[17]。</p><p>　　史玉榮等采用ANNEXINV-FITC加PI雙標(biāo)法和PI單標(biāo)法行流式細(xì)胞儀檢測甘草多糖對

57、小鼠S-180肉瘤的凋亡誘導(dǎo)作用，凋亡率分別為1.0g／kg組24．7％；0．75g／kg組23．2％；</p><p>　　0．5g／kg組44．6％；表明甘草多糖有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。同時證實(shí)低劑量甘草多糖通過誘導(dǎo)小鼠S-180肉瘤凋亡來抑制腫瘤生長，而陰性對照組環(huán)磷酰胺對照組殺傷小鼠S-180肉瘤則是以導(dǎo)致細(xì)胞壞死為主[18]。</p><p><b>　　2．3抗病毒作用

58、‘</b></p><p>　　常雅萍等從甘草中提取甘草多糖對7種RNA和DNA類病毒作了體外抗病毒研究，結(jié)果表明，GPS對水皰性口炎病毒(VSV)、腺病毒3型(AdVIII])、單純皰疹病毒1型(HSV-1)和牛痘病毒(VV)均有明顯的抑制作用，不但可直接滅活上述4種病毒，而且對細(xì)胞內(nèi)的病毒也有作用，可阻止VSV、AdVⅡI吸附與進(jìn)入細(xì)胞。GPS還對病毒復(fù)制有一定抑制作用[19].</p>

59、;<p>　　王岳五等用甘草多糖(GPS)作為抗病毒制劑，檢測其抗牛艾滋病病毒(BIV)、腺病毒3型(AdVIII)、柯薩奇病毒(CBv3)作用。結(jié)果表明GPS對三種病毒均有較明顯的拮抗作用，對艾滋病病毒的抑制率為36．2％，可影響病毒合胞體形成，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞作用。GPS還可影響腺病毒和柯薩奇病毒的吸附及進(jìn)入細(xì)胞的功能，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞作用，其保護(hù)率分別為74．5％和59%，因此可認(rèn)為GPS可吸附于細(xì)胞表面或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以防止

60、病毒的吸附和進(jìn)入，可適用于預(yù)防病毒感染和治療[20]</p><p><b>　　甘草多糖的提取</b></p><p>　　2.21甘草粗多糖的提取</p><p><b>　　1，熱水浸提法</b></p><p>　　稱取100g甘草原料，粉碎后裝入兩個1000ml的大錐形瓶中，向每個錐形瓶中

61、加入500ml蒸餾水，放入恒溫水浴中，80℃浸提2小時后，離心，收集上清液，重復(fù)操作三次，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，濃縮至1/5體積，得到甘草多糖濃縮液，加95%d的乙醇至含乙醇達(dá)80%，離心，收集沉淀物，依次用無水乙醇，你同，乙醚洗滌沉淀3次，沉淀經(jīng)凍干后得粗甘草多糖。</p><p><b>　　2，超聲波法提取</b></p><p>　　取甘草100克

62、，粉碎成10-20目大小，放入1000ml的錐形瓶中，加水500ml,水的量最好溢過甘草表面2厘米左右，放入超聲波儀中，提取30分鐘，過濾，重復(fù)一次，合并濾液</p><p>　　2.22精多糖的提取</p><p><b>　　1Sevag法：</b></p><p>　　取甘草定溶液加入試管中，并向此溶液中加入其體積1/5的氯仿—正丁醇（5

63、:1）溶液，震蕩30min，經(jīng)離心去除沉淀，脫蛋白。脫離心，取上清液，加95%的乙醇至含醇量達(dá)80%，離心，收集沉淀。依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀，沉淀物干燥后得出多糖。</p><p><b>　　2酶法：</b></p><p>　　準(zhǔn)確稱取胰蛋白酶2g，用PH8的蒸餾水溶解，置于100ml容量瓶中。精確配置0.02g/ml的多糖溶液，取10ml置于錐形瓶中

64、，調(diào)節(jié)PH為8。將樣品液于酶夜放置37℃水浴鍋中預(yù)熱10min，然后分別吸取酶液置于錐形瓶中再分別加入蒸餾水。37℃恒溫振蕩器中震蕩30min后，放入100℃水浴鍋中滅酶10min。冷卻至室溫，加95%的乙醇40ml，離心，收集沉淀，依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀，沉淀物經(jīng)干燥后得到甘草多糖。</p><p><b>　　3三氯乙酸法</b></p><p>　　

65、取50ml甘草多糖溶液置于錐形瓶中，加入5ml的40%三氯乙酸溶液，混勻放置，離心取上清液，加入95%乙醇200ml，離心，收集沉淀物，依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀，沉淀物干燥得到多糖。</p><p><b>　　3 結(jié)論</b></p><p>　　各國學(xué)者對甘草化學(xué)成分提取研究十分青睞,但多數(shù)只注重于三萜類和黃酮類化合物的提取,而對甘草多糖的研究較少。本

66、研究主要是對各種甘草多糖的提取方法進(jìn)行終結(jié)并提出最優(yōu)方案。實(shí)驗表明酶法對甘草多糖的提取有著顯著作用。根據(jù)正交實(shí)驗結(jié)果得出酶量2%溫度40℃，時間1h，PH8時甘草多糖的產(chǎn)量最大。甘草多糖的藥用價值表明其未來是光明的</p><p><b>　　4 參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 熱娜·卡斯木 脹果甘草多糖的提取與理化性質(zhì) 華西藥學(xué)雜志2008

67、/04</p><p>　　[2] 張卉 甘草RNA提取方法研究 時珍國醫(yī)國藥2007/12</p><p>　　[3] 張澤生 甘草免疫調(diào)節(jié)作用的研究 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展2008/10</p><p>　　[4]陳鳳清 甘草多糖超聲波提取優(yōu)化研究 中國釀造2009/01\</p><p>　　[6]Kim Y，Park H.W，Kim J．H

68、.，et a1．Anti-canoer effect and structural characterization of endo-polysaceharide from cultivated myeelia of Inonotus obtiquus[J].Life Sci,2006,79(1):72．80．</p><p>　　[7] Yamada H.，Kiyohara,H.，Takemoto N.，et

69、a1．Mitogenic and complement activating activities of the herbal components of Juzentaihoto[J]．Planta Med，1 992，</p><p>　　58(2)：166—170．</p><p>　　[8] Kiyohara,H．Elucidation of pharmacologically a

70、ctive polysaccharides from Kampo medicines and component herbs[1]．Z Congress Series.，1998，1157：161-171．</p><p>　　[9] Nose M.，Terawaki K.，Oguri K.,et a1．Activation of macrophages by crude</p><p>

71、　　polysaccharide fractions obtained from shoots ofGlycyrrhiza glabra andhairy roots</p><p>　　of Glycyrrhiza uralensis in vitro[J]．Biol.Pharm．Bull.，1998，21(10)：1110—1112．</p><p>　　[10] Hirano M．，

72、Matsumoto，T．,Kiyohara H.，et a1．Lipopolysaccharidc—independent Limulus amebocyte lysate activating，mitogenic and anti-complementary activities of pectic polysaccharides from Chinese herbs[j]．Planta Med．，1 994，60(3)：248-25

73、2．</p><p>　　[11] Hwang J．H.，Lee K．H.，Yu K．W. Characterization of the immunologically active components of Glycyrrhiza uralensis prepared as herbal kimchi[J]．Nutraceu Food, 2003，8(1)：29—35．</p><p&g

74、t;　　[12]鄭堯，何景華，高建華，等．甘草多糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響[J]．中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21(2)：254．255．</p><p>　　[13]程安瑋，金征宇，萬發(fā)春．甘草多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的激活作用[J]．食品科學(xué)，2007，28(12)：43 1-434．</p><p>　　[14]_史勇，楊貴貞．甘草多糖對小鼠淋巴細(xì)胞的激活增值效應(yīng)[J]．中國免疫學(xué)雜志．

75、1986，2(5)：295．300．</p><p>　　[15] 聶小華，尹光耀，史寶軍。甘草有效成分體外抗腫瘤活性和免疫活性的研究[J]．中藥材，2003，26(7)：507．509．</p><p>　　[16] 王忱，謝廣茹，史玉榮，等．甘草多糖的體內(nèi)抑瘤作用及其機(jī)制的研究[J]．臨床腫瘤學(xué)雜志，2003，8(2)：85—87．</p><p>　　[17]

76、王岳五，史玉榮，張海波，等．甘草殘渣中多糖GPS抗腫瘤作用的研究[J]．南開大學(xué)學(xué)報，2000，33(4)：46-48．</p><p>　　[18] 史玉榮，魏熙胤，楊毅，等．流式細(xì)胞儀檢測甘草多糖對小鼠S-180肉瘤的凋亡誘導(dǎo)作用．現(xiàn)代儀器。2005，(4)：31-33．</p><p>　　[19]常雅萍，畢無邪，楊貴貞．甘草多糖抗病毒作用研究[J]．中國中藥雜志，1989，l 4(

77、4)：44-46．</p><p>　　[20]王岳五，史玉榮，張海波，等．甘草多糖GPS對病毒的抑制作用[J]．南開大學(xué)學(xué)報，2001，34(2)：126-128．</p><p><b>　　開題報告</b></p><p>　　甘草多糖提取過程中除蛋白方法的比較研究　　 </p><p>　　1 選題的背景和意義

78、</p><p>　　甘草(Glycyrrhiza)是多年生草本植物，屬豆科甘草屬。作為中藥甘草指的是甘草屬部分植物的根及根莖。我國作為藥用而收載的甘草主要有烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch．)、脹果甘草(Glycyrrhizainflata Batal)和光果甘草(aycyrrhiza glabra L)。甘草是一味應(yīng)用極其廣泛的中藥，這與甘草中的有效成分有關(guān)。</p&g

79、t;<p>　　廣泛存在于各種動植物和微生物組織中的多糖，是由各種單糖組成的天然高分子化合物。除典型的纖維素和幾丁質(zhì)外，各種類型的纖維素、果膠、粘液質(zhì)都具有結(jié)構(gòu)多糖的功能。從二十世紀(jì)六十年代后，多糖所具有的各種生理功能逐漸為人們所重視，尤其是增強(qiáng)免疫力的功能被廣泛認(rèn)同，并被廣泛應(yīng)用于腫瘤化療等。目前世界各國，尤其是美國、日本等發(fā)達(dá)國家正投入大量人力、財力對各種動植物、微生物多糖進(jìn)行深入研究。但天然植物中多糖與蛋白質(zhì)兩種高分

80、子成分共存，且兩種物質(zhì)分子量相近，另外糖常常與蛋白形成糖蛋白復(fù)合物，使蛋白質(zhì)的脫除變得更加困難。但也許正是由于結(jié)合了這部分蛋白質(zhì)，多糖才具有眾多獨(dú)特的生理功能。</p><p>　　另據(jù)報道甘草中的多糖有降血糖、抑瘤作用等多種功能：可是在提取甘草多糖時，提取物中蛋白質(zhì)含量很高，這對純化帶來了很大困難。本文針對甘草多糖水提物中蛋白質(zhì)含量高這一情況，對幾種甘草多糖脫蛋白方法進(jìn)行了對比研究，以確定最佳脫蛋白。</

81、p><p>　　2 相關(guān)研究的最新成果及動態(tài) </p><p>　　對于甘草多糖的藥理研究剛剛起步，主要在抗病毒、抗腫瘤、提高免疫功能等方面。</p><p>　　甘草多糖是近年來我國學(xué)者從中藥甘草中提取出的活性中藥多糖，具有一定的抑瘤作用。通過建立好的Balb/c荷瘤小鼠模型進(jìn)行動物試驗，計算抑癌率是比較直接準(zhǔn)確的觀察甘草多糖抑瘤作用的方法。給予甘草多糖處理過的小鼠的

82、腫瘤明顯縮小，且輕于只給予生理鹽水的對照組小鼠，二者具有統(tǒng)計學(xué)上顯著差異，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致。</p><p>　　用甘草多糖（GPS）作為抗病毒制劑，檢測其抗牛艾滋病病毒、腺病毒、柯薩奇病毒。多糖是一種重要的生物高分子化合物，作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑可影響機(jī)體免疫功能力而起到抗炎、抗病作用。結(jié)果表明GPS對三種病毒均有較明顯的拮抗作用，對艾滋病病毒的抑制率為36.2%可影響病毒合胞體形成^達(dá)到保護(hù)細(xì)胞作用，還可影響

83、腺病毒和柯薩奇病毒的吸附及進(jìn)入細(xì)胞的功能，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞作用。其保護(hù)率分別為74.9%和59.0%因此可認(rèn)為GPS可吸附于細(xì)胞表面或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以防止病毒的吸附和進(jìn)入，可適用于預(yù)防病毒感染和治療。</p><p>　　另外，李曉冰; 何小鵑等建立H22荷瘤小鼠模型,觀察甘草多糖對模型小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響,探討甘草多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制結(jié)果:模型組小鼠Treg細(xì)胞比例明顯高于正常組,甘草多糖組Tr

84、eg細(xì)胞比例低于模型組(P<0.01),甘草多糖組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯高于環(huán)磷酰胺組。甘草多糖與環(huán)磷酰胺無交互作用。結(jié)論:甘草多糖可能通過降低荷瘤小鼠Treg細(xì)胞的比例及提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率而發(fā)揮抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用。 陸清兒; 童朝明等研究了甘草多糖的廣泛用途及抑菌效果試驗方法與試驗過程。 結(jié)果表明:甘草多糖成品對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)均為16萬mg/L;對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC均為10萬

85、mg/L;其純品對大腸桿菌的MIC和MBC均為4萬mg/L、對金黃葡萄球菌的MIC和MBC均為2萬mg/L;純品對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為5mm和8mm 。程安瑋; 金征宇等通過研究甘草多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO、iNOS的生成及iNOSmRNA表達(dá)的影響,結(jié)果表明:GP能劑量依賴性地增加活化的巨噬細(xì)胞中NO的生成量及iNOS的活性,當(dāng)GP的添加濃度</p><p>　　3 課題的研究內(nèi)容及擬采取的

86、研究方法、研究難點(diǎn)及預(yù)期達(dá)到的目標(biāo)</p><p>　　3.1 課題研究內(nèi)容</p><p>　　1、甘草多糖提取方法的確定</p><p>　?。ㄔ诶蠋熤笇?dǎo)下，并通過查找文獻(xiàn)資料，最終確定了最佳制備粗多糖的實(shí)驗條件。）</p><p>　　2、粗多糖除蛋白方法的比較研究</p><p>　　（對1制備的粗多糖進(jìn)行三種

87、除蛋白試驗，比較分析找出最佳的除蛋白方法）</p><p>　　3.2 擬采取的研究方法</p><p>　　1、超聲波法輔助提取甘草多糖：甘草飲片→粉碎→超聲波提取三次→過濾→濾液濃縮→乙醇沉淀→過濾得沉淀→無水乙醇，丙酮，乙醚分別洗滌三次→干燥→粗多糖產(chǎn)品</p><p>　　2、Sevag法: 取一定粗多糖熱水溶解→過濾→定容一定體積→加入Sevag有機(jī)溶劑，

88、震蕩脫蛋白，重復(fù)多次操作→每次取一定體積上清液加95%的乙醇至含醇量達(dá)80%，離心，收集沉淀→依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌三次沉淀→干燥→Sevag法甘草多糖I，II，III。</p><p>　　3、胰蛋白酶法: 取一定粗多糖熱水溶解→過濾→定容一定體積→加入胰蛋白酶脫蛋白，重復(fù)多次操作→滅酶→每次取一定體積上清液加95%的乙醇至含醇量達(dá)80%，離心，收集沉淀→依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌三次沉淀→干燥→胰

89、蛋白酶法多糖I，II，III。</p><p>　　4、三氯乙酸法: 取一定粗多糖熱水溶解→過濾→定容一定體積→加入40%三氯乙酸溶液脫蛋白，重復(fù)多次操作→每次取一定體積上清液加95%的乙醇至含醇量達(dá)80%，離心，收集沉淀→依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌三次沉淀→干燥→三氯乙酸法多糖I，II，III。</p><p>　　5、多糖含量測定采用苯酚－硫酸法，蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮蘭法進(jìn)行&l

90、t;/p><p><b>　　3.3 研究難點(diǎn)</b></p><p>　　1、多糖和蛋白測定方法的穩(wěn)定性不是很好，要求操作條件較苛刻；</p><p>　　2、提取粗多糖的前處理比較麻煩，處理不當(dāng)可能影響蛋白去除。</p><p><b>　　3.4 預(yù)期目標(biāo)</b></p><p

91、>　　優(yōu)化出一條蛋白去除率高、多糖損失率低，同時可操作性強(qiáng)的工業(yè)化生產(chǎn)甘草多糖的工藝路線。</p><p>　　4 論文詳細(xì)工作進(jìn)度和安排</p><p>　　2010.11.4－2011.3.15 熟悉實(shí)驗室環(huán)境和基本實(shí)驗操作，準(zhǔn)備論文實(shí)驗所需基本材料</p><p>　　2010.12.15 完成并提交文獻(xiàn)綜述、開題報告和外文翻譯</p>

92、;<p>　　2011.3.15前 在學(xué)校指定時間完成開題答辯</p><p>　　2011.3.15－2011.5.12 實(shí)驗</p><p>　　2011.5.17 完成并提交畢業(yè)論文</p><p>　　2011.5.31 在學(xué)校指定時間進(jìn)行畢業(yè)論文答辯</p><p>　　2011.6.5

93、 完成并提交答辯后的修改論文</p><p><b>　　5 參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Kim Y，Park H.W，Kim J．H.，et a1．Anti-canoer effect and structural characterization of endo-polysaceharide from cultivated myeelia

94、 of Inonotus obtiquus[J].Life Sci,2006,79(1):72-80．</p><p>　　[2] Yamada H.，Kiyohara,H.，Takemoto N.，et a1．Mitogenic and complement activating activities of the herbal components of Juzentaihoto[J]．Planta Med，

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