小硅藻培養(yǎng)過(guò)程中脂類代謝物的變化研究【開(kāi)題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開(kāi)題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　小硅藻培養(yǎng)過(guò)程中脂類代謝物的變化研究</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><

2、p>　　微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最重要的自養(yǎng)生物，是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最主要初級(jí)生產(chǎn)者，也是海洋生物資源的重要組成部分，具有種類多、數(shù)量大、繁殖快等特點(diǎn)，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起著極其重要的作用。它們的盛衰直接或間接地影響著整個(gè)海洋生態(tài)系的生產(chǎn)力，因此，與漁業(yè)資源、水產(chǎn)養(yǎng)殖、環(huán)保、地質(zhì)等密切相關(guān)。微藻本身營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、多糖等各種生物活性物質(zhì)。微藻中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)屬于多不飽和脂肪酸(

3、PUFA)，EPA對(duì)人類循環(huán)系統(tǒng)的多種疾病具有突出的療效，可用于治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、血栓的形成。DHA俗稱腦黃金，是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)及維持的一種主要元素，是大腦和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，對(duì)胎嬰兒智力和視力發(fā)育至關(guān)重要。此外，EPA還能增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫系統(tǒng)功能，提高存活力和抗病能力，是水產(chǎn)飼料中的必需脂肪酸。因此，微藻在醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值。</p><p>

4、　　植物細(xì)胞體內(nèi)含中性脂和極性脂，有研究結(jié)果表明，微藻不同生長(zhǎng)階段，會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)總脂含量和脂肪酸組成的變化。而海洋微藻的脂類含量和組成除了決定于藻種本身的遺傳因素外，還受細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期期和環(huán)境條件，如培養(yǎng)基組成、溫度、光強(qiáng)等的影響。魏東等人研究海洋微藻后棘藻(Ellipsoidion sp.7-14)和眼點(diǎn)擬微球藻(Nannochloropsis oculata)兩種微藻后發(fā)現(xiàn)，總脂的含量均在穩(wěn)定期達(dá)到最高，而EPA、ω-3多不飽和脂肪酸

5、和PUFA占總脂肪酸的最高比例均出現(xiàn)在對(duì)數(shù)早期，此時(shí)的總脂含量卻是最低的。Eizadora等人研究了N，Si缺乏時(shí)T.pseudonana和P.tricornutum生長(zhǎng)周期中三酰甘油TGA的變化。研究發(fā)現(xiàn)，Si缺少樣品中，T.pseudonana一些TAG種類在進(jìn)入穩(wěn)定期早期劇烈下降，如48：5，50：4，50：5，50：6，50：8，52：5，52：6，P.tricornutum藻細(xì)胞表現(xiàn)出在穩(wěn)定期開(kāi)始時(shí)TAGs不飽和度增高（特別是

6、52：8，52：9等的增加），即藻細(xì)胞從指數(shù)期向穩(wěn)定期轉(zhuǎn)變過(guò)程當(dāng)中TAG種類中不飽和脂肪酸增多了。由于脂類化合物在藻體內(nèi)的不</p><p>　　目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于環(huán)境因子對(duì)微藻脂類積累影響的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)鹽成分、光強(qiáng)、溫度等因素上，而生長(zhǎng)周期內(nèi)脂類積累的，特別是極性脂積累變化的研究較少。本文研究的意義在于通過(guò)UPLC-Q-TOF分析微藻在其生長(zhǎng)周期不同階段脂類代謝物的變化，科學(xué)確定出脂類、能源積累的階段，

7、從而為微藻的能源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。</p><p>　　研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問(wèn)題：</p><p>　?。ㄒ唬?、課題研究的基本內(nèi)容</p><p>　　利用UPLC-Q-TOF-MS分析系統(tǒng)，以分布在微藻細(xì)胞內(nèi)脂類代謝物為主要研究對(duì)象，建立生物體內(nèi)脂類的定性和定量分析方法；利用建立的方法對(duì)在生長(zhǎng)周期不同階段典型微藻的脂類組成和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，分析其脂組的差

8、異性。</p><p>　?。ǘ?、擬解決的主要問(wèn)題</p><p>　　(1) 摸索總脂Q-TOF MS質(zhì)譜最佳測(cè)定條件。</p><p>　　(2) 摸索出總脂的UPLC分離條件。</p><p>　　(3) 根據(jù)Q-TOF MS數(shù)據(jù)對(duì)樣品中總脂各組分的結(jié)構(gòu)特征、脂鏈連接方式判定、MSMS分析、精確分子量分析。</p>&l

9、t;p>　　(4) PCA和SIMCA-P統(tǒng)計(jì)軟件處理生長(zhǎng)周期中不同階段微藻脂類的不同，分析微藻培養(yǎng)過(guò)程中脂組的變化規(guī)律。</p><p>　　研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010.10—2010.11: </p><p>　　查詢與論文有關(guān)的資料、撰寫(xiě)試驗(yàn)計(jì)劃、熟悉基本的實(shí)

10、驗(yàn)操作。</p><p>　　2010.11 —2010.12:</p><p>　　建立總脂的定性和定量分析方法。</p><p>　　2010.12—2011.1:</p><p>　　利用以建立的方法分析被測(cè)微藻的脂類代謝物的組成和結(jié)構(gòu)，利用SIMCA-P統(tǒng)計(jì)軟件分析脂組的變化規(guī)律。</p><p>　　2011

11、.3―2011.5:</p><p>　　典型微藻的脂組分析測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)所涉及到的內(nèi)容的不足之處進(jìn)行補(bǔ)充性實(shí)驗(yàn)，收集整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和撰寫(xiě)論文。</p><p><b>　　主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 魏東, 張學(xué)成, 鄒立紅, 徐年軍. 細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)兩種海洋微藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 20

12、00, 30(3):503-509.</p><p>　　[2] Eizadora T. Yu, Frank J. Zendejas, Pamela D. Lane, et al. Triacylglycerol accumulation and profiling in the model diatoms Thalassiosira pseudonana and Phaeodactylum tricornutu

13、m (Baccilariophyceae) during starvation[J]. J . Appl. Phycol, 2009, 21:669-681.</p><p>　　[3] Yang W, Feng F. Y, Hou H.T, et al. Alternation in lipid composition of wheat leaves induced by phosphate deficienc

14、y is related to both lipid biosynthesis and phosphatidylglycerol degradation[J]. Acta botanica sinica, 2004, 46:211-215.</p><p>　　[4] Van Mooy BA, Rocap G, Fredricks HF, Evans CT, Devol AH. Sulfolipids drama

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16、3-246.</p><p>　　[6] 魏 東, 張學(xué)成, 隋正紅等. 氮源和N/P對(duì)眼點(diǎn)擬微球藻的生長(zhǎng)、總脂含量和脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2000, 7(24):46-51.</p><p>　　[7] 蔣冰飛, 孫穎穎, 王長(zhǎng)海. 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)和脂肪酸含量及組分的影響[J]海洋通報(bào), 2007, (05):56-61.</p><p>

17、　　[8] 蔣霞敏. 溫度、光照、氮含量對(duì)微綠球藻生長(zhǎng)及脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2002, (08):9-12.</p><p>　　[9] 代玉華, 劉訓(xùn)言, 孟慶偉, 趙世杰. 低溫脅迫對(duì)類囊體膜脂代謝的影響[J]. 植物學(xué)通報(bào), 2004, (04):506-511.</p><p>　　[10] 曹春暉, 孫世春, 麥康森, 梁英. 光照強(qiáng)度對(duì)四株海洋綠藻總脂含量和脂

18、肪酸組成的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, (09):2347-2353.</p><p>　　[11] 黃冠華, 陳峰. 環(huán)境因子對(duì)異養(yǎng)小球藻脂肪酸組分含量和脂肪總酸產(chǎn)量的影響[J]. 可再生能源, 2009, 27(3):65-69.</p><p>　　[12] 吳瑞珊, 魏東. Fe對(duì)眼點(diǎn)擬微球藻的生長(zhǎng)和脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2008, 32(7):93-95&

19、lt;/p><p>　　[13] 李春穎, 仇雪梅. 海洋微藻脂肪酸組成的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2008, (4):63-65.</p><p>　　[14] 徐繼林, 陳德瑩, 嚴(yán)小軍, 等. 超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)混合光合作用糖脂的分析[J]. 分析化學(xué), 2009, (4):511-516.</p><p>　　[15] 徐繼林, 嚴(yán)小

20、軍. 脂類分析在海洋微藻化學(xué)分類學(xué)上的研究進(jìn)展[J]. 海洋通報(bào), 2004, 2(32):65-70.</p><p>　　[16] 蔣漢明, 高坤山. 氮源及其濃度對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)和脂肪酸組成的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2004, 28(5):545- 551.</p><p>　　[17] 王菊芳, 梁世中, 吳振強(qiáng). 碳氮比對(duì)隱甲藻(Crypthecodinium cohnii

21、)總脂及DHA含量的影響[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 28(10):28-31.</p><p>　　[18] 梁 英, 麥康森, 孫世春. 硝酸鈉濃度對(duì)2 株三角褐指藻生長(zhǎng)及脂肪酸組成的影響[J]. 黃渤海海洋, 2001, 19(4):56-62.</p><p>　　[19] 梁 英, 麥康森, 孫世春等. 硝酸鈉濃度對(duì)三角褐指藻( Phaeodactylum trico

22、rnutum) MACC/ B226 生長(zhǎng)及脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2002, 6(5):48-51.</p><p>　　[20] 陳 娜, 郭尚敬, 孟慶偉. 膜脂組成與植物抗冷性的關(guān)系及其分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2005, 2:6-9.</p><p>　　[21] 謝玉英. 膜脂組成與植物抗寒性的關(guān)系[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 13(11

23、):38-39.</p><p>　　[22] Murata N. Molecular species composition of phosphatidylglycerols from chilling-sensitive and chilling-resistant Plants [J]. Plant Cell Physiol , 1983, 24:81-86. </p><p>　　

24、[23] 侯旭光, 姜英輝, 李光友. 南極冰藻的總脂含量及脂肪酸組成與其低溫適應(yīng)性的關(guān)系[J]. 黃渤海海洋, 2002, 20(1):47-53.</p><p>　　[24] 石 娟, 潘克厚. 不同光照條件對(duì)小新月菱形藻和等鞭金藻8701生長(zhǎng)及生化成分的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2004, 11(2):121-128.</p><p>　　[25] 李荷芳, 周漢秋. 光照強(qiáng)度

25、對(duì)海洋微藻脂肪含量及脂肪酸組成影響的研究[J]. 海洋科學(xué)集刊, 2001, 43:178-183.</p><p>　　[26] 繆錦來(lái), 王波, 闞光鋒, 丁燏, 姜英輝, 侯旭光, 李光友. 環(huán)境因子對(duì)2種南極綠藻脂肪含量和脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2005, (01):4-10.</p><p>　　[27] 蔣敏霞, 柳敏海, 邢晨光, 等. 不同生長(zhǎng)條件對(duì)綠色巴夫藻

26、生長(zhǎng)與脂肪酸組成的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31(1):88–93.</p><p>　　[28] 蔣漢明, 翟靜, 張媛英, 顧洪雁, 高坤山. 等鞭金藻生長(zhǎng)和脂肪酸組成隨Fe3+濃度變化的研究[J]. 中國(guó)油脂, 2005, 30(8):57-59.</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p>&l

27、t;b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　環(huán)境因子對(duì)微藻脂類的影響</p><p>　　摘要：環(huán)境因子包括培養(yǎng)基的組成，光照、溫度、鹽度等，它們?cè)跊Q定微藻脂類的種類和數(shù)量方面起著重要作用。微藻細(xì)胞中脂類的數(shù)量及質(zhì)量是評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。大量研究表明，環(huán)境因子變化對(duì)微藻的脂肪含量和脂肪酸組成有著顯著變化。這些變化既表現(xiàn)在細(xì)胞膜膜脂性質(zhì)的變化，又體現(xiàn)在貯存脂類合

28、成和利用速率的相對(duì)變化。</p><p>　　關(guān)鍵詞：環(huán)境因子；微藻；脂類</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最重要的自養(yǎng)生物，是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的最主要初級(jí)生產(chǎn)者，也是海洋生物資源的重要組成部分，具有種類多、數(shù)量大、繁殖快等特點(diǎn)。微藻的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與其生化組成特別是脂類和脂肪酸的組成和含量密切相關(guān)。

29、海洋微藻是海洋多不飽和脂肪酸的初級(jí)生產(chǎn)者，微藻中的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,簡(jiǎn)稱EPA,20:5ω-3)是長(zhǎng)鏈ω-3系列多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,簡(jiǎn)稱PUFA)的一種，對(duì)人類循環(huán)系統(tǒng)的多種疾病具有突出的療效，可用于治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、血栓形成，對(duì)治療其它疾病如癌癥、炎癥、哮喘、糖尿病等也取得了令人鼓舞的結(jié)果[1]。作為人類的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)食品和藥品越

30、來(lái)越受到重視。EPA還能增強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫系統(tǒng)功能，提高存活力和抗病能力，是水產(chǎn)飼料中的必需脂肪酸[2]。</p><p>　　海洋微藻總脂含量和脂肪酸組成，除微藻本身遺傳因素外，培養(yǎng)基組成(如氮、磷濃度和氮磷比)、環(huán)境條件(如光強(qiáng)、溫度、鹽度等)因素都會(huì)極大地影響它們的生物合成和積累。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)告[3]，在高氮濃度下小球藻(Chlorella sp.)、紫球藻(Porphyridium cruentum

31、)的PUFA含量增加，低的光照強(qiáng)度能促進(jìn)PUFA的形成和積累。而提高光照強(qiáng)度能使小球藻(Chlorellasp.)和紫球藻(Porphyridium cruentum)中的EPA得以積累。</p><p>　　因此，海洋微藻總脂含量和脂肪酸組成在很大程度上受到環(huán)境因子的影響。控制好培養(yǎng)條件，并在特定的生長(zhǎng)期收獲，能使微藻的總脂含量和脂肪酸組成滿足特定的需要。本文以各種環(huán)境因子變化對(duì)海洋微藻脂類積累產(chǎn)生的影響加以概

32、述。</p><p>　　2氮濃度對(duì)微藻脂類積累的影響</p><p>　　氮作為微藻生長(zhǎng)必需的基本元素之一，氮源的種類及濃度對(duì)微藻脂肪酸組成的影響較大。Eizadora等[4]的研究表明，在N、P缺乏下，所檢測(cè)到的TAG種類和含量均不同，表現(xiàn)在飽和度不同。蔣漢明等[5]的研究表明不添加氮源時(shí)，EPA的合成受到明顯的抑制，使得C18∶2 (n - 6) 和C18∶3 (n - 6) 大量積

33、累，從而導(dǎo)致PUFAs占總脂肪酸的比例也較高；高濃度的氮，尤其是NH2CONH2 ，能夠促進(jìn)三角褐指藻合成較高的EPA和PUFAs，其占總脂肪酸的比例也隨著NH2CONH2濃度的增加而上升。王菊芳等[6]的研究發(fā)現(xiàn)隨著碳氮比的提高，DHA占總脂肪酸的百分比降低。梁英等[7,8]用含有不同硝酸鈉濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)三角褐指藻( Phaeodactylum tricornutum) (MACC/ B118，B221，B226)，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范

34、圍內(nèi)，EPA 含量隨硝酸鈉濃度增加而增加，在硝酸鈉濃度為75mg/L時(shí)EPA含量最低(9.3%-10.1%)，在硝酸鈉濃度為l875mg/L時(shí)EPA含量最高(12.2%-13,4%)。硅藻DHA 含量較低，硝酸鈉濃度對(duì)DHA含量的影響不明顯，但</p><p>　　3磷濃度對(duì)微藻脂類積累的影響</p><p>　　P源是維持很多植物和微生物正常生長(zhǎng)的重要因素，魏東等研究了氮源和N/P對(duì)眼點(diǎn)

35、擬微球藻的生長(zhǎng)、總脂含量和脂肪酸組成的影響，當(dāng)將培養(yǎng)基中所有營(yíng)養(yǎng)鹽增加4倍，EPA含量可提高到35 %，說(shuō)明富含氮、磷的培養(yǎng)基可使細(xì)胞始終保持旺盛生長(zhǎng)、富含EPA的狀態(tài)，這也是該種微藻大規(guī)模培養(yǎng)中高產(chǎn)EPA的關(guān)鍵措施[9]。蔣冰飛等[10]在營(yíng)養(yǎng)鹽（NaH2PO4）對(duì)球等金藻脂肪酸含量及組分的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的增加藻細(xì)胞中脂肪酸含量占細(xì)胞干重的比例呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且營(yíng)養(yǎng)鹽濃度上升越高，其下降幅度也越大。球等鞭金藻細(xì)胞

36、中C14:0，C16:0和C18系列脂肪酸居多，以C18:2為最多，并含有豐富的C22:6(DHA)。隨著營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的上升，PUFA占細(xì)胞干重的百分含量下降，且下降程度大，DHA占細(xì)胞干重的百分比也下降，但下降程度不大。</p><p>　　Yang Wen等[11]研究了不同磷酸鹽梯度下小麥葉片脂類組成的變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)磷酸鹽缺乏時(shí)，光合膜中脂類水平將發(fā)生重大改變，其中PG和MGDG含量降低，伴隨著DGDG和SQD

37、G的含量升高。且脂類的變化和葉齡有關(guān)。這些結(jié)果表明，磷酸鹽的缺乏將會(huì)影響脂類的生物合成，同時(shí)，PG含量的降低也與此相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在磷脅迫下，磷脂和糖脂會(huì)發(fā)生互相取代作用。在磷脅迫下，檢測(cè)芽部和根部細(xì)胞中DGDG的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DGDG在兩者細(xì)胞中的含量均上升。此外，在液泡膜和線粒體膜中也檢測(cè)到DGDG，猜測(cè)糖脂從質(zhì)體轉(zhuǎn)移到線粒體中是基于兩者的直接接觸。在海洋生態(tài)系統(tǒng)中磷脂和糖脂相互取代的這種能力顯得尤為重要。在北太平洋亞熱帶環(huán)流區(qū)，

38、浮游生物吸收的磷酸鹽大約有18%～28% 用來(lái)合成生物體內(nèi)的膜脂。但是原綠球藻（一種藻青菌，在整個(gè)亞熱帶環(huán)流區(qū)的浮游生物中居于主導(dǎo)地位）卻用不到1%的磷酸鹽合成膜磷脂，反而主要合成的是SQDG，其與MGDG、DGDG共同組成了總脂的94%～99%。生物這種“硫取代磷”的適應(yīng)性策略為生活在磷酸鹽缺乏的海洋中的生物成功繁衍提供了保障[12]。</p><p>　　4溫度對(duì)微藻脂類積累的影響</p>&l

39、t;p>　　溫度是影響微藻細(xì)胞合成脂肪和脂肪酸的重要因子之一，其影響因藻種而異。溫度對(duì)微藻總脂含量的影響只對(duì)少數(shù)種作了研究，變化的趨勢(shì)并不一致。蔣霞敏[13]在溫度對(duì)微綠球藻脂肪酸組成的影響實(shí)驗(yàn)中指出，當(dāng)溫度在5~20℃范圍內(nèi)，EPA隨著溫度的上升而增高，20℃時(shí)EPA達(dá)到最高水平，但超過(guò)20℃，EPA隨著溫度的上升而降低，在30℃時(shí)EPA最低；而16：1(n-7)隨著溫度的上升而下降，20℃時(shí)降至最低水平，但超過(guò)20℃16 1(

40、n 7)隨著溫度的上升而增高。</p><p>　　生物膜主要由脂類、蛋白質(zhì)和一些碳水化合物組成。膜的流動(dòng)性是維持正常膜功能的基礎(chǔ)，它主要取決于膜的脂類分子的飽和程度[14]。生物膜結(jié)構(gòu)是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡體系，隨外界溫度變化內(nèi)部成分進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整[16]。正常情況下，植物的生理活動(dòng)需要在液晶態(tài)的膜相，這時(shí)的膜流動(dòng)性好，當(dāng)溫度降低到一定程度時(shí)，膜脂由液晶態(tài)變?yōu)槟z態(tài)，這種膜脂相變會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)流動(dòng)停止，膜結(jié)合酶活力降低和

41、膜透性增大，引起胞內(nèi)離子滲漏，胞內(nèi)離子失去平衡，繼而使細(xì)胞代謝失調(diào)，有毒的中間代謝物積累，使植物細(xì)胞受害[15]。如果含不同飽和程度的膜脂，由于不飽和脂肪酸，相變溫度較低，能在較低溫度下保持流動(dòng)性，從而維持植物的正常生理功能。</p><p>　　近年來(lái)的研究表明，PG因具有較多的飽和脂肪酸，而成為決定膜脂相變的主要因素[16]。Murata[17]對(duì)12種抗冷植物9種冷敏感植物中的PG脂肪酸飽和度進(jìn)行了分析，發(fā)

42、現(xiàn)在8種冷敏感植物中（除番茄外)PG的飽和脂肪酸含量比較高，占總脂肪酸的60%～75%，而11種抗冷植物中的則為50%～57%，說(shuō)明PG的飽和度與植物的抗冷性明顯的相關(guān)。膜脂對(duì)低溫脅迫作用的適應(yīng)可能與膜脂脂肪酸不飽和程度增高有關(guān)。侯旭光、姜英輝等人[18]發(fā)現(xiàn)4種南極冰藻的脂肪酸組成中主要是不飽和脂肪酸的形式，在低溫的條件下（－2～10℃）不飽和脂肪酸的含量會(huì)增加，飽和脂肪酸的含量會(huì)下降。</p><p>　　5

43、光照對(duì)微藻脂類積累的影響</p><p>　　光是藻培養(yǎng)中影響其生長(zhǎng)的最重要的因子之一，光線的明與暗，光度的強(qiáng)與弱，不僅對(duì)微藻的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)量有影響，而且對(duì)其總脂含量和脂肪酸的組成也有影響。曹春暉等[19]在光照強(qiáng)度對(duì)四株海洋綠藻（小球藻Chlorela spp.MACC/C95,/C97,/C102和桿狀裂絲藻Stichococcus bacillarisMACC/C19）總脂含量和脂肪酸組成的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，C1

44、9的脂肪含量在低中光強(qiáng)(3000-5000lx)間變化不大，而在高光照強(qiáng)度時(shí)總脂含量顯著低于其它各組；C95的總脂含量隨光照強(qiáng)度變化不大；C97和C102的總脂含量隨光照強(qiáng)度升高而明顯升高。小球藻EPA含量隨光照強(qiáng)度的增加而明顯降低，SFA和MUFA總量隨光照強(qiáng)度的增加總體呈增加趨勢(shì)；桿狀裂絲藻C19的EPA含量隨光照強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)低-高-低趨勢(shì)，SFA隨光照強(qiáng)度的增加呈降低趨勢(shì)，MUFA隨光照強(qiáng)度的增加呈增加趨勢(shì)。4株綠藻的PUFA總

45、量均隨光照強(qiáng)度的增加而降低。石娟等[20]研究發(fā)現(xiàn)低光下小新月菱形藻和等鞭金藻的脂肪含量多而高光下則相反，這種變化也許跟細(xì)胞內(nèi)參與光合作用的細(xì)胞器的變化有關(guān)。李荷芳等[21]人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，</p><p>　　6 植物鹽對(duì)微藻脂類積累的影響</p><p>　　有關(guān)鹽度對(duì)微藻脂類組成的影響只在少數(shù)藻類中作過(guò)研究。不同的微藻對(duì)鹽度有不同的反應(yīng)。繆錦來(lái)等[22]在用不同鹽度對(duì)2種綠藻（Pyr

46、amidomonas sp和Chlorophyceae L-4）總脂含量和脂肪酸組成影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鹽度對(duì)2種綠藻脂肪的積累有一定的影響。隨著鹽度的提高，Pyramidomonas sp.總脂含量上升；鹽度為33-150時(shí),Chlorophyceae L-4總脂含量也增加，鹽度的提高有利于2種綠藻積累脂肪。隨著鹽度的增加，2種綠藻的飽和脂肪酸增加，多不飽和脂肪酸的含量則降低。對(duì)于Pyramidomonas sp.而言,C18:3和C2

47、0:4的含量隨著鹽度的增加而降低，鹽度的增加不利于多不飽和脂肪酸的積累。黃冠華等[23]在鹽度對(duì)小球藻脂肪酸組成和含量的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低濃度的NaCl能明顯地降低小球藻中脂肪酸的飽和度，生成更多的不飽和脂肪酸，當(dāng)NaCl濃度升高時(shí)，小球藻脂肪酸的飽和度逐漸增加。蔣霞敏等[24]的研究表明綠色巴夫藻(Pavlava viridid)在低鹽度條件下有利于PUFA(n-3)及EPA的合成。</p><p>　　7微量

48、元素對(duì)微藻脂類積累的影響</p><p>　　微量元素對(duì)微藻脂類的積累也起著重要的作用。鐵是海水中重要的微量元素，海水中鐵的含量和存在形式不僅會(huì)影響到藻類的生長(zhǎng)而且可能會(huì)影響藻類的生化組成。蔣漢明等[25]利用微量元素鐵對(duì)等鞭金藻的脂肪酸的影響作了研究，發(fā)現(xiàn)等邊金藻DHA占總脂肪酸的比例隨Fe3+濃度增加而升高，PUFA占總脂肪酸的比例隨著Fe3+濃度增加先上升后下降。吳瑞珊等[26]在Fe2+對(duì)眼點(diǎn)擬微球藻的脂

49、肪酸組成的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著Fe2+濃度的升高，細(xì)胞中主要的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例有所降低,而多不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例則有較大的提高。另外，在一定范圍內(nèi)(0~0.3mmol/L)，F(xiàn)e2+濃度的升高則會(huì)促使細(xì)胞內(nèi)積累EPA。在培養(yǎng)基中，F(xiàn)e2+在空氣中極易被氧化成Fe3+形成膠體態(tài)和顆粒態(tài)鐵。真核微藻細(xì)胞膜上具有鐵還原酶，可以將環(huán)境中的Fe3+還原成Fe2+加以吸收利用。像等邊金藻在天然海水（鐵濃度為0.5μ

50、mol/L）條件下，DHA和PUFA含量很低，可能是由于缺乏足夠的Fe3+，使等邊金藻可利用的Fe2+減少，從而影響了DHA和其他不飽和脂肪酸的合成[25]。</p><p><b>　　8總結(jié)</b></p><p>　　環(huán)境因子的變化對(duì)海洋微藻脂類的積累會(huì)產(chǎn)生很大的影響。不同種藻在某種環(huán)境因子的改變下對(duì)其脂類影響可能不同。通過(guò)微藻在不同環(huán)境因子的作用下脂類積累的研

51、究，可以科學(xué)確定出脂類、能源積累的最適條件，從而為微藻的生物活性物質(zhì)提取以及能源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 蔣霞敏, 鄭亦周. 14種微藻總脂含量和脂肪酸組成研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2003, (03):243-246.</p><p>　　[2] 魏東, 張學(xué)成. 微藻脂

52、肪酸去飽和酶及其基因表達(dá)的生態(tài)調(diào)控研究新進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 2000, 24(08):42-46.</p><p>　　[3] 魏東, 張學(xué)成, 鄒立紅, 徐年軍. 細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)兩種海洋微藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 30(3):503-509.</p><p>　　[4] Eizadora T. Yu, Frank J. Zendejas,

53、 Pamela D. Lane, et al. Triacylglycerol accumulation and profiling in the model diatomsThalassiosira pseudonana and Phaeodactylum tricornutum(Baccilariophyceae) during starvation[J]. J . Appl. Phycol, 2009, 21:669-681.&l

54、t;/p><p>　　[5] 蔣漢明, 高坤山. 氮源及其濃度對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)和脂肪酸組成的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2004, 28(5):545- 551.</p><p>　　[6] 王菊芳, 梁世中, 吳振強(qiáng). 碳氮比對(duì)隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)總脂及DHA含量的影響[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 28(10):28-31.</p>

55、<p>　　[7] 梁 英, 麥康森, 孫世春. 硝酸鈉濃度對(duì)2 株三角褐指藻生長(zhǎng)及脂肪酸組成的影響[J]. 黃渤海海洋, 2001, 19(4):56-62.</p><p>　　[8] 梁 英, 麥康森, 孫世春等. 硝酸鈉濃度對(duì)三角褐指藻( Phaeodactylum tricornutum) MACC/ B226 生長(zhǎng)及脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2002, 6(5):48-51.

56、</p><p>　　[9] 魏 東, 張學(xué)成, 隋正紅等. 氮源和N/P對(duì)眼點(diǎn)擬微球藻的生長(zhǎng)、總脂含量和脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2000, 7(24):46-51.</p><p>　　[10]. 蔣冰飛, 孫穎穎, 王長(zhǎng)海. 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)和脂肪酸含量及組分的影響[J]海洋通報(bào), 2007, (05):56-61.</p><p>　　[1

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58、2004, 46:211-215.</p><p>　　[12] Van Mooy BA, Rocap G, Fredricks HF, Evans CT, Devol AH. Sulfolipids dramatically decrease phosphorus demand by picocyanobacteria in oligotrophic marine environments[J]. Proc N

59、atl Acad Sci USA, 2006, 103:8607-8612.</p><p>　　[13] 蔣霞敏. 溫度、光照、氮含量對(duì)微綠球藻生長(zhǎng)及脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2002, (08):9-12.</p><p>　　[14] 代玉華, 劉訓(xùn)言, 孟慶偉, 趙世杰. 低溫脅迫對(duì)類囊體膜脂代謝的影響[J]. 植物學(xué)通報(bào), 2004, (04):506-511.<

60、;/p><p>　　[15] 陳 娜, 郭尚敬, 孟慶偉. 膜脂組成與植物抗冷性的關(guān)系及其分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2005, 2:6-9.</p><p>　　[16] 謝玉英. 膜脂組成與植物抗寒性的關(guān)系[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 13(11):38-39.</p><p>　　[17] Murata N. Molecular speci

61、es composition of phosphatidylglycerols from chilling-sensitive and chilling-resistant Plants [J]. Plant Cell Physiol , 1983, 24:81-86. </p><p>　　[18] 侯旭光, 姜英輝, 李光友. 南極冰藻的總脂含量及脂肪酸組成與其低溫適應(yīng)性的關(guān)系[J]. 黃渤海海洋, 2002

62、, 20(1):47-53.</p><p>　　[19] 曹春暉, 孫世春, 麥康森, 梁英. 光照強(qiáng)度對(duì)四株海洋綠藻總脂含量和脂肪酸組成的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, (09):2347-2353.</p><p>　　[20] 石 娟, 潘克厚. 不同光照條件對(duì)小新月菱形藻和等鞭金藻8701生長(zhǎng)及生化成分的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2004, 11(2):121-128.

63、</p><p>　　[21] 李荷芳, 周漢秋. 光照強(qiáng)度對(duì)海洋微藻脂肪含量及脂肪酸組成影響的研究[J]. 海洋科學(xué)集刊, 2001, 43:178-183.</p><p>　　[22] 繆錦來(lái), 王波, 闞光鋒, 丁燏, 姜英輝, 侯旭光, 李光友. 環(huán)境因子對(duì)2種南極綠藻脂肪含量和脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2005, (01):4-10.</p><

64、;p>　　[23] 黃冠華, 陳峰. 環(huán)境因子對(duì)異養(yǎng)小球藻脂肪酸組分含量和脂肪總酸產(chǎn)量的影響[J]. 可再生能源, 2009, 27(3):65-69.</p><p>　　[24] 蔣敏霞, 柳敏海, 邢晨光, 等. 不同生長(zhǎng)條件對(duì)綠色巴夫藻生長(zhǎng)與脂肪酸組成的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31(1):88–93.</p><p>　　[25] 蔣漢明, 翟靜, 張媛英,

65、 顧洪雁, 高坤山. 等鞭金藻生長(zhǎng)和脂肪酸組成隨Fe3+濃度變化的研究[J]. 中國(guó)油脂, 2005, 30(8):57-59.</p><p>　　[26] 吳瑞珊, 魏東. Fe對(duì)眼點(diǎn)擬微球藻的生長(zhǎng)和脂肪酸組成的影響[J]. 海洋科學(xué), 2008, 32(7):93-95.</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p>

66、<b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　小硅藻培養(yǎng)過(guò)程中脂類代謝物的變化研究</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料和方法2</p><p>　　2

67、.1 實(shí)驗(yàn)材料2</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)藻種2</p><p>　　2.1.2 培養(yǎng)基2</p><p>　　2.1.3 儀器和試劑2</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法2</p><p>　　2.2.1 小硅藻的培養(yǎng)3</p><p>　　2.2.2 小硅藻細(xì)胞密度

68、的測(cè)定3</p><p>　　2.2.3 脂類代謝物的提取3</p><p>　　2.2.4 色譜和質(zhì)譜條件3</p><p>　　2.2.5 數(shù)據(jù)處理4</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果5</b></p><p>　　3.1 小硅藻生長(zhǎng)周期試驗(yàn)的指紋識(shí)別5</p>

69、<p>　　3.2 小硅藻生長(zhǎng)周期代謝指標(biāo)物的定性分析8</p><p>　　3.3 小硅藻周期試驗(yàn)過(guò)程中脂類代謝指標(biāo)物的變化11</p><p><b>　　4 討論11</b></p><p><b>　　5 總結(jié)11</b></p><p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。&

70、lt;/p><p><b>　　參考文獻(xiàn)12</b></p><p>　　摘要：為了研究小硅藻（Nitzschia closterium f. minutissima）在培養(yǎng)過(guò)程中脂類代謝物的變化，利用超高效液相色譜－四極桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS），電噴霧電離源分別在正負(fù)離子模式下，對(duì)小硅藻對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的脂類代謝物進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)SIMCA-P軟件

71、進(jìn)行主成分分析和正交偏最小二乘法辨別分析。結(jié)果表明，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期到穩(wěn)定期，三酰甘油及溶血lyso-DGDG、lyso-SQDG均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；而PC、MGDG、DGDG、SQDG、PG均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。這些脂類代謝物的變化，不僅可以用來(lái)判別微藻的脂類合成途徑，而且可以科學(xué)確定出脂類、能源積累的階段，從而為微藻的能源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：小硅藻；生長(zhǎng)周期；脂類代謝物；四極桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜

72、；超高效液相色譜</p><p>　　Abstract: The aim of this study was to investigate how the lipid metabolites change in Nitzschia closterium f.minutissima during the growth phase. It was studied by the ultra performance li

73、quid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) using electron spraying ionization with positive and negative mode, in an effort to find potential metabolite biomarkers during the growth.

74、After the UPLC-Q-TOF analysis, principal components analysis (PCA) and orthogonal projectio</p><p>　　Keywords: Nitzschia closterium f.minutissima; growth phase; Lipidomics; Quadrupole-time of flight-mass spe

75、ctrometry; ultra performance liquid chromatography</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最重要的自養(yǎng)生物，也是最主要初級(jí)生產(chǎn)者，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起著極其重要的作用。</p><p>　　海洋微藻作為優(yōu)良的天然餌料被廣泛應(yīng)用

76、于水產(chǎn)養(yǎng)殖，是海水仔魚(yú)、蝦蟹貝等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物幼體的主要食源，其產(chǎn)生的一些多不飽和脂肪酸（PUFA），特別是EPA，20:5（n-3）和DHA，22:6（n-3），其含</p><p>　　量直接關(guān)系到仔魚(yú)及幼體的存活和生長(zhǎng)發(fā)育[1]。海洋微藻中的小硅藻（Nitzschia closterium f. minutissima），也稱小新月菱形藻，在分類上屬于硅藻門(mén)，細(xì)胞呈紡錘形。個(gè)體小、繁殖快、脂肪含量高，環(huán)境適應(yīng)

77、能力強(qiáng)。小硅藻還含有高度不飽和脂肪酸EPA，可作為理想的保健食品，也可以作為甲殼類、雙殼類和仔魚(yú)的餌料從而在海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位[2]。</p><p>　　微藻的餌料價(jià)值與許多因素有關(guān)，包括細(xì)胞大小、細(xì)胞壁的可消化程度和細(xì)胞內(nèi)的生化組成特別是脂類的組成和含量，尤以后者最為重要[3,4]。先前的研究認(rèn)為不飽和脂肪酸的含量是影響微藻餌料價(jià)值的最主要因子，但脂類代謝物作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和供能物質(zhì)，對(duì)養(yǎng)殖生物的生長(zhǎng)發(fā)育同

78、樣起決定作用[5]。植物細(xì)胞體內(nèi)含中性脂和極性脂，極性脂一般為海洋微藻的主要脂類，大部分為磷脂和糖脂；中性脂主要為三酰基甘油，它作為脂肪酸的一種儲(chǔ)存形式，在細(xì)胞分裂、能量代謝、維持膜的穩(wěn)定性、生物合成及其他許多生理過(guò)程中起作用，為主要的儲(chǔ)存脂類[6,7]。</p><p>　　目前有研究結(jié)果表明，微藻不同生長(zhǎng)階段（對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期），會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)總脂含量和脂肪酸組成的變化[8,9]。而海洋微藻的脂類含量和組成除了決

79、定于藻種本身的遺傳因素外[10]，還受其他環(huán)境條件，如溫度[11,12]、光照[13]，.鹽度[14]等的影響。培養(yǎng)基的種類也會(huì)對(duì)微藻的脂肪酸組成產(chǎn)生影響[15]，特別是培養(yǎng)液中氮源的影響更為顯著[16]。</p><p>　　由于國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于環(huán)境因子對(duì)微藻脂類積累影響的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)鹽成分、光強(qiáng)、溫度等因素上，而生長(zhǎng)周期內(nèi)脂類的積累，特別是極性脂積累變化的研究較少。因此本文以小硅藻為研究對(duì)象，研究其生長(zhǎng)周

80、期不同階段脂類代謝物的變化，從而科學(xué)確定出脂類、能源積累的階段，為小硅藻的大規(guī)模培養(yǎng)和能源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　2 實(shí)驗(yàn)材料和方法</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)藻種</p><p>　　小硅藻（Nitzs

81、chia closterium f.minutissima），由寧波大學(xué)海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微藻室提供。</p><p><b>　　2.1.2 培養(yǎng)基</b></p><p>　　小硅藻的培養(yǎng)使用f/2培養(yǎng)液。其基本配方見(jiàn)表1。</p><p>　　2.1.3 儀器和試劑</p><p>　　ACQUITY超高效液相

82、色譜系統(tǒng)，色譜柱ACQUITY UPLC BEH C8（1.7µm，100mm×2.1mm），Q-TOF Premier高分辨四極桿和飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，MassLynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)均為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；超純水系統(tǒng)（法國(guó)Millipore公司）；GXZ智能型光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；LDZX-50FB高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；TDLSO-2B飛鴿低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TP3

83、00超聲波清洗機(jī)（北京泰拓公司）；漩渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)公司）；W-O系列恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器均為上海中順生物科技公司產(chǎn)品；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（義烏平華儀器公司）等。抗氧化劑2,6-二特丁基對(duì)甲酚（BHT，>99.9%）；色譜純氯仿、甲醇、乙腈、甲酸均為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；純水來(lái)源由超純水系統(tǒng)制備。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b>

84、;</p><p>　　2.2.1 小硅藻的培養(yǎng)</p><p>　　用于微藻培養(yǎng)的海水均經(jīng)脫脂棉過(guò)濾、煮沸消毒，所有容器均高溫滅菌。培養(yǎng)器皿為3000mL三角燒瓶，培養(yǎng)3個(gè)平行樣。往瓶中加入2000mL培養(yǎng)液（1:1000），200ml藻液，用紙蓋好瓶口，用棉繩扎緊。培養(yǎng)條件是在光照培養(yǎng)箱中，明暗周期為12h:12h；光照方式：日光燈；光照強(qiáng)度約2500lx；溫度為20±2℃。

85、</p><p>　　表1 f/2培養(yǎng)液配方</p><p>　　2.2.2 小硅藻細(xì)胞密度的測(cè)定</p><p>　　每天振搖2次，每天定時(shí)取樣一次，取5.00mL充分搖勻的藻液，加入1－2滴5%（V/V）的福爾馬林溶液固定，然后取一滴藻液置于血球計(jì)數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每一批次做3個(gè)平行樣，取其平均值，然后換算成相應(yīng)的藻細(xì)胞密度（藻細(xì)胞密度=藻

86、數(shù)×104個(gè)/cm3）。作培養(yǎng)時(shí)間（天）與藻細(xì)胞密度的關(guān)系圖，得到小硅藻的生長(zhǎng)曲線（圖1）。</p><p>　　2.2.3 脂類代謝物的提取</p><p>　　取不同生長(zhǎng)階段（對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期）一定體積的藻液，4000－4800r/min離心10min，再用消毒淡水清洗2－3次，經(jīng)冷凍干燥，放入玻璃離心管中低溫（-4℃）保存。將干燥的藻泥采用氯仿:甲醇（v/v，1:1）提取法得

87、到藻中的脂類代謝物。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，干燥后充入氮?dú)?，?20℃貯存待用。所有溶液均加入BHT（50mg/L）。</p><p>　　2.2.4 色譜和質(zhì)譜條件</p><p>　　色譜條件：流動(dòng)相為85乙腈/甲醇（V/V，2:1）:15異丙醇（V/V）溶液（A）和水（B），進(jìn)樣1L，流速0.25mL/min，柱后1:4分流進(jìn)入質(zhì)譜。流動(dòng)相中加入0.1％甲酸和0.05µmol/L 的

88、甲酸鈉。采用梯度洗脫時(shí)洗脫梯度為：B從在8min內(nèi)從初始5％升至70％，在12min內(nèi)從70％升至90％，在8min內(nèi)從90％升至95％，保持14min，在1min升至100％保持3min，最后在1min內(nèi)降到5％然后平衡11min。</p><p>　　質(zhì)譜條件：使用電噴霧電離源（ESI）進(jìn)行分析，脫溶劑的氮?dú)饬魉贋?00L/h，脫溶劑的溫度為250℃，離子源的溫度為120℃，錐孔反吹氮?dú)鉃?。TOF離子飛行的

89、方式為V模式，四極桿的掃描范圍為50－1200。目標(biāo)離子的精確質(zhì)量數(shù)由外標(biāo)物亮腦啡肽進(jìn)行鎖定。正離子模式下，毛細(xì)管電離電壓3.0kV，負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電離電壓2.6kV；取樣錐孔電壓為35－80V，碰撞室能量看分析目的不同采用5－60V不等。</p><p>　　2.2.5 數(shù)據(jù)處理</p><p>　　原始數(shù)據(jù)由美國(guó)WATERS公司研發(fā)的MassLynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采集，再通

90、過(guò)MarkerLynx管理系統(tǒng)進(jìn)行處理，從而建立每一樣品對(duì)應(yīng)保留時(shí)間和質(zhì)荷比的峰數(shù)量以及歸一化的峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)庫(kù)，然后將這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入SIMCA-P分析軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘法分析（O-PLS-DA）和主成分分析（PCA）。采用MassFragment分析軟件、Human Metabolome Database數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等多種技術(shù)手段，對(duì)候選生物標(biāo)記物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。</p><p>　　圖1 3個(gè)平行樣的小硅

91、藻生長(zhǎng)曲線</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　3.1 小硅藻生長(zhǎng)周期試驗(yàn)的指紋識(shí)別</p><p>　　為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠和統(tǒng)計(jì)正確，減小誤差，每個(gè)小硅藻樣品重復(fù)進(jìn)樣三次。為了得到每一個(gè)樣品的信息，對(duì)樣品在正負(fù)離子模式下進(jìn)行液相色譜－質(zhì)譜（LC-MS）分析。每個(gè)樣品進(jìn)樣數(shù)為六次，分別是電噴霧正離子模式分析三次

92、和負(fù)離子模式分析三次。利用UPLC-Q-TOF-MS分析系統(tǒng)，使小硅藻的脂類代謝物在液相色譜柱上發(fā)生分離（圖2）。</p><p>　　圖2 小硅藻樣品的總離子流圖。A. ESI-掃描；B. ESI+掃描</p><p>　　經(jīng)MarkerLynx處理，小硅藻樣品可以分別得到8398（正離子模式）、3067個(gè)（負(fù)離子模式）信號(hào)峰，將這些信號(hào)峰通過(guò)歸納處理，進(jìn)行主成分分析，得到５組小硅藻樣品

93、在正負(fù)離子模式下的PCA得分圖（圖3）。圖上每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，每組樣品用圈隔開(kāi)以方便觀察，從圖中可以直觀在看到不同生長(zhǎng)時(shí)期小硅藻樣品的差異性[17]。</p><p>　　根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，通過(guò)SIMCA-P分析軟件對(duì)樣品進(jìn)行正交偏最小二乘法（O-PLS-DA）分析。圖4是基于正交偏最小二乘法獲得的第一組（7天后和9天后收集的為第一組）和第二組（17天后、24天后和27天后收集的為第二組）小硅藻樣品數(shù)據(jù)分析結(jié)果

94、的S載荷圖（S-loading plot）。在S載荷圖上，每一個(gè)點(diǎn)為一個(gè)數(shù)據(jù)對(duì)，其表示了該物質(zhì)的質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間。中間的橫軸表示可變量，數(shù)據(jù)對(duì)離0越遠(yuǎn)，說(shuō)明樣品的差異性越大?？v軸表示每個(gè)樣品間的相關(guān)性，數(shù)據(jù)對(duì)離0越遠(yuǎn)，說(shuō)明樣品的相關(guān)性越好。所以，圖中兩端的數(shù)據(jù)對(duì)表示了樣品中可信度最高的特征離子。然后根據(jù)變異權(quán)重參數(shù)（VIP）在正負(fù)離子模式下分別提取前20個(gè)特征離子（表2）作為潛在標(biāo)志物進(jìn)行定性分析。</p><p&g

95、t;　　圖3 小硅藻前二主成分的PCA得分圖。A. 正離子掃描模式ESI+ scan；B. 負(fù)離子掃描模式ESI- scan；</p><p>　　1. 7天后收集小硅藻樣品，2. 9天后收集，3. 17天后收集，4. 24天后收集，5. 27天后收集。</p><p>　　圖4 基于正偏交最小二乘法獲得的第一組和第二組小硅藻樣品的S-載荷圖。</p><p>　　

96、A. 正離子模式下S-載荷圖；B. 負(fù)離子模式下S-載荷圖</p><p>　　表2 對(duì)第一組和第二組小硅藻樣品進(jìn)行正偏交最小二乘法分析后相對(duì)第二組比較獲得的潛在生物標(biāo)志物</p><p>　　#：第一組為小硅藻7天和9天后取樣樣品；第二組為小硅藻17天，24天和27天取樣樣品。</p><p>　　3.2小硅藻生長(zhǎng)周期代謝指標(biāo)物的定性分析</p>&

97、lt;p>　　根據(jù)以上提取出的前20個(gè)變量離子的m/z比值的精確質(zhì)量數(shù)（質(zhì)量相對(duì)誤差小于5ppm）得到其可能的元素組成，在互聯(lián)網(wǎng)上提供的免費(fèi)LIPID MAPS庫(kù)（http://www.lipidmaps.org），HMDB庫(kù)（http://www.hmdb.ca）和METLINE庫(kù)（http://metlin.Scripps.edu）里進(jìn)行搜索，與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜行為和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)進(jìn)行最終定性。</p><

98、;p>　　對(duì)于前20個(gè)變量離子中的絕大部分離子為三酰甘油（TAG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）、硫代溶血硫代糖脂（lyso-SQDG）和單半乳糖甘油二酯（MGDG），由于無(wú)法買(mǎi)到所有的標(biāo)準(zhǔn)品，主要根據(jù)其m/z比值的精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)脂類物質(zhì)的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行最終定性。比如圖2中保留時(shí)間為34.44min、ESI+模式下m/z為825.6958代謝物離子，根據(jù)正離子掃描模式下的TIC圖中對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處的質(zhì)譜（圖5），可

99、確定出此分子對(duì)應(yīng)的[M + H]+ （m/z 803.7138）、[M + Na]+ （m/z 825.6958）、[M+NH4]+ （m/z　820.6786），故此標(biāo)志物的分子量為802.7060，而其 [M + H]+ 的精確m/z為803.7138。誤差允許0.01Da范圍內(nèi)在HMDB庫(kù)中進(jìn)行檢索，可得到8個(gè)可能的吻合物，其中有6個(gè)為三酰甘油。這些物質(zhì)有著不同的酰基脂肪酸組成，在高能量下會(huì)產(chǎn)生不同的碎片離子，所以進(jìn)一步考察目標(biāo)代

100、謝物的二級(jí)質(zhì)譜行為（圖6）：正離子模式下產(chǎn)生m/z 221和m/z 219，m/z 237和m/z 239，m/z 549和m/z 54</p><p>　　圖5 保留時(shí)間34.44min處的ESI-MS圖</p><p>　　再舉個(gè)例子，比如圖2中保留時(shí)間為19.46min、ESI+模式下m/z 為795.4997代謝物離子，根據(jù)正、負(fù)離子掃描模式下的TIC圖中對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處的質(zhì)譜（圖7

101、），可確定出此分子對(duì)應(yīng)的[M + Na]+ (m/z 795.4997)、[M-H]- (m/z 771.5066)和[M+HCOOH-H]- (m/z 817.5101)，故此標(biāo)志物的分子量為772.5099。誤差允許5ppm范圍內(nèi)在METLINE庫(kù)中進(jìn)行檢索，可得到1個(gè)可能的吻合物（18:3/18:4 MGDG）。進(jìn)一步考察目標(biāo)代謝物的二級(jí)質(zhì)譜行為（圖8）：正離子模式下m/z 243的存在預(yù)示此物質(zhì)有一個(gè)半乳糖頭部，同時(shí)</p

102、><p>　　并未找到405的離子，說(shuō)明物質(zhì)確實(shí)是MGDG[19]，負(fù)離子模式下豐度最強(qiáng)的為m/z251.1947和301.2126，正離子模式下豐度最強(qiáng)的為m/z493.2767和543.2953（為MGDG脂肪酰基基團(tuán)作為羧酸的中性丟失而產(chǎn)生的離子），表明這個(gè)單半乳糖甘油二酯的兩個(gè)脂肪?；謩e為16:2和20:5，而正離子模式下m/z493.276離子信號(hào)比m/z543.2953離子信號(hào)強(qiáng)，根據(jù)在各碰撞能量（5-

103、80V）碰撞下[M+Na-R1COOH]+的強(qiáng)度總是高于[M+Na-R2COOH]+-的強(qiáng)度的規(guī)律[19]，得出sn-1是20:5而sn-2位是16:2，最終可確定此代謝物為MGDG（20:5/16:2）。</p><p>　　圖6 [M + Na]+ (m/z 825.6958)的ESI-MS2圖</p><p>　　圖7 保留時(shí)間19.46min處的ESI-MS圖</p>

104、<p>　　根據(jù)以上定性過(guò)程，剔除重復(fù)的信息（正負(fù)離子模式下均排在前20位的同一物質(zhì)，同一離子模式不同離子化狀態(tài)的同一物質(zhì)），在獲得的潛在生物標(biāo)志物中，最終鑒定出2種MGDG，1種lyso-DGDG，1種PC，3種SQDG，3種lyso-SQDG、2種PG、7種TAG，另外9種化合物未鑒定出。（表2）</p><p>　　圖8 [M + Na]+ (m/z 795.4997)和[M+HCOOH-H]-

105、 (m/z 817.5101)的ESI-MS2圖</p><p>　　3.3 小硅藻周期試驗(yàn)過(guò)程中脂類代謝指標(biāo)物的變化</p><p>　　表2中相關(guān)系數(shù)均是相對(duì)2組的結(jié)果，正值表示與第二組樣品正相關(guān)即生長(zhǎng)過(guò)程中該代謝物呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，而負(fù)值表示與第一組樣品正相關(guān)即生長(zhǎng)過(guò)程中該代謝物呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。可見(jiàn)，從分布趨勢(shì)看，隨時(shí)間的增長(zhǎng)，三酰甘油及溶血lyso-DGDG、lyso-SQDG均呈現(xiàn)