假微型海鏈藻dgat基因cdna全長序列的分子克隆和分析【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　海洋生物資源與環(huán)境</b></p><p>　　假微型海鏈藻DGAT基因cDNA全長序列的分子克隆和分析</p><p>　　一、選題的背景與意義&

2、lt;/p><p>　　1.微藻制備生物柴油</p><p><b>　　1.1生物柴油</b></p><p>　　近年來，隨著全球經(jīng)濟的快速增長，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危機已迫在眉睫，對生物質(zhì)能等可再生能源的關注逐漸成為熱點。</p><p>　　生物柴油，又稱單烷基脂肪酸酯，是以動、植物油脂

3、為原料，與醇類經(jīng)轉酯作用獲得的單烷基脂肪酸酯。生物柴油作為化石燃料的替代品，與化石柴油和燃料乙醇等其他液體燃料相比，有著突出的特性：生物柴油不含石蠟，閃點高，燃燒性能和效率要高于普通柴油，使用時更安全；可以通過種植、養(yǎng)殖或培養(yǎng)源源不斷地得到，因而屬于可再生資源；生物柴油產(chǎn)品中含硫和氮較少，可以減少產(chǎn)生SO2和NO對大氣的排放量。以淀粉類作物和木質(zhì)纖維素類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的燃料乙醇，燃燒后尾氣排放污染小，但其熱值只有普通汽油的2/3，比柴油更

4、低，且乙醇易吸水使燃燒值下降。</p><p>　　1.2微藻制備生物柴油的優(yōu)勢</p><p>　　作為新一代生物柴油原料，微藻擁有很多優(yōu)勢。例如：</p><p>　　微藻種類繁多，分布極其廣泛。全球已經(jīng)鑒定的微藻大約有40000種，且其數(shù)量還在不斷增加。大多分布在江海湖泊中，不與農(nóng)作物爭地，可以整年生長。</p><p>　　微藻通常呈

5、單細胞或絲狀體，結構簡單，整個生物體都能進行光合作用，所以光合作用效率高，生長周期短、速度快。微藻還可利用微生物發(fā)酵技術，在光反應器中高密度、高速率培養(yǎng)。在同樣條件下，微藻細胞生長加倍時間通常在24 h內(nèi)，對數(shù)生長期內(nèi)細胞物質(zhì)加倍時間縮短至3.5 h。</p><p>　　微藻油脂含量高。例如葡萄藻（Botryococcus braunii）的含油量為細胞干重的25～75%。而高等植物種子的脂肪酸含量僅為干重的1

6、5%~20%左右。其油脂組成與一般油料植物相似，以C16、C18系脂肪酸為主。</p><p>　　微藻能吸收并利用工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中排放出的大量CO2和氮化物或從廢水中取得氮、磷等，有利于改善環(huán)境。</p><p>　　1.3 假微型海鏈藻</p><p>　　假微型海鏈藻屬于中心硅藻綱，圓篩藻目，海鏈藻屬。</p><p>　　通過尼羅紅染色法

7、對寧波大學微藻種質(zhì)庫的63株微藻進行篩選，研究結果顯示，中性脂含量最高的為假微型海鏈藻（T. pseudonana），雖然假微型海鏈藻的中性脂含量最高，但是其細胞密度在整個生長期都比較低，因此對它的分子研究及培養(yǎng)條件的優(yōu)化極為重要。</p><p>　　1.3.1 DGAT</p><p>　　DGAT (二酰甘油?；D移酶)催化TAG（三酰甘油）合成途徑的最后一步反應，也是該途徑的限速酶

8、，對它的研究對于進一步提高微藻含油量，降低生物柴油生產(chǎn)成本，有著十分重要的意義。另外，DGAT基因全長的克隆為下一步轉入到擬南芥中提供目的基因。</p><p>　　研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　1. 研究的基本內(nèi)容</p><p>　　1.1 假微型海鏈藻（T. pseudonana）DGAT基因全長cDNA的克隆</p>

9、<p>　　1.2 DGAT基因全長cDNA序列分析、比對</p><p>　　2. 擬解決的主要問題</p><p>　　2.1 得到假微型海鏈藻DGAT基因全長cDNA的克隆</p><p>　　2.2 分析和比對DGAT基因全長cDNA序列</p><p>　　三、研究的方法與技術路線：</p><p>

10、;　　1.假微型海鏈藻（T. pseudonana）DGAT基因全長cDNA的克隆</p><p><b>　　1.1材料</b></p><p>　　實驗材料假微型海鏈藻（T. pseudonana）取自寧波大學微藻種質(zhì)庫，于5000 mL三角瓶中，在溫度20℃，鹽度25～30‰，光照強度為50 μmol/(m2·s)，光暗比12 h:12 h的條件下采用

11、NML3#培養(yǎng)液（表1）培養(yǎng)10 d。</p><p>　　表1. NML3#培養(yǎng)液配方</p><p>　　Table.1. Composition of culture fluid</p><p><b>　　1.2方法</b></p><p>　　1.2.1總RNA的提取</p><p>　

12、　首先，將三角瓶中的假微型海鏈藻（T. pseudonana）離心，去上清，得到100 mg的藻泥于2 ml EP管中。然后加入1 mL的Trizol試劑，超聲波清洗機中超聲5 min后提取總RNA。最后用20 μL DEPC水（RNase Free）溶解RNA，測定RNA的濃度和OD260/OD280的值。</p><p>　　1.2.2反轉錄合成cDNA的第一條鏈</p><p>　　

13、取各樣品RNA 1 μg按Takara PrimeScriptTM RT-PCR Kit（寶生物工程有限公司）操作方法：在一個DEPC水處理過的PCR管中加入總RNA 1 μg，Oligo dT Primer (2.5 μM) 1 μL，dNTP Mixture（10 mM each）1 μL，加RNase Free dH2O補至10 μL，PCR儀上65℃反應5 min后，離心數(shù)秒使模板RNA、引物等的混合液聚集于PCR管底部。然后

14、加入5×PrimeScriptTM Buffer 10 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.5 μL，PrimeScriptTM RTase（for 2 step）0.5 μL，RNase Free dH2O 5 μL，混勻后PCR儀上進行反轉錄反應：30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min，得到的cDNA產(chǎn)物可直接用于基因全長cDNA的克隆或放﹣20℃保存。</p>

15、<p>　　3’-RACE引物設計</p><p>　　按照NCBI上公布的假微型海鏈藻（T. pseudonana）CCMP1335的DGAT基因的全長序列（XM_002287179.1），用Primer Premier 5.0設計DGAT基因的特異性引物，接頭及接頭引物由3’-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒提供（表6）。</p><p>　　表6.

16、 假微型海鏈藻（T. pseudonana）3’-RACE引物</p><p>　　Table.6. Primers in 3’-RACE of T. pseudonana</p><p>　　3’-RACE獲得DGAT基因全長cDNA</p><p>　　Outer PCR反應體系為50 μL：反轉錄反應液 3 μL，1×cDNA Dilution Bu

17、fferⅡ 7 μL，Gene Specific Outer Primer (10 μM) 2 μL，3’-RACE Outer Primer (10 μM) 2 μL，10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Free) 4 μL，MgCl2（25 mM） 3 μL，Takara LA Taq（5 U/μL） 0.25 μL，dH2O 28.75 μL。反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，7

18、2℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。</p><p>　　Inner PCR反應體系為50 μL：稀釋后的Outer PCR產(chǎn)物 1 μL，dNTP Mixture (2.5 mM each) 8 μL，10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Free) 5 μL，，MgCl2（25 mM） 5 μL，Takara LA Taq（5 U/μL） 0.5 μL，Gene Spec

19、ific Inner Primer (10 μM) 2 μL，3’-RACE Inner Primer (10 μM) 2 μL，dH2O 26.5 μL。反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。</p><p><b>　　測序分析</b></p><p>　　取5 μL PCR反

20、應液進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測3’-RACE PCR擴增產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T受體上，轉化到大腸桿菌中再進行測序。</p><p><b>　　1.3 技術路線</b></p><p>　　研究的總體安排與進度：</p><p>　　2010.7—2010.9：查閱資料、預實驗等前期準備。</p><p>

21、　　2010.9—2010.11：假微型海鏈藻DGAT基因全長cDNA的克隆</p><p>　　2010.11—2010.12：DGAT基因全長cDNA序列分析、比對</p><p>　　2011.1—2011.2：整理數(shù)據(jù)，撰寫論文。</p><p><b>　　主要參考文獻：</b></p><p>　　[1] 嵇

22、磊，張利雄，姚志龍等.利用藻類生物質(zhì)制備生物燃料研究進展[J].石油學報：石油加工，2007，23(6)：1-5.</p><p>　　[2] 王金娜，嚴小軍，周成旭，徐繼林.產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動態(tài)積累過程的檢測. 生物物理學報2010，26(5)</p><p>　　[3] 劉波，孫艷,劉永紅，趙宗保.產(chǎn)油微生物油脂生物合成與代謝調(diào)控研究進展微生物學報.2005.15(1).<

23、/p><p>　　[4] 劉源，姜運良.豬DGAT1基因部分序列的克隆及分析.山東2005年學術年會，246-248.</p><p>　　[5] 李栒.油菜種子含油量相關基因PEPC和DGAT的克隆及遺傳轉化研究.湖南農(nóng)業(yè)大學博士論文.</p><p>　　[6] 馬海明，施啟順，柳小春.DGAT相關基因的研究進展.遺傳學報，2005，32（12）：1327-1332

24、.</p><p>　　[7] N Ilaiyaraja, A P Rajarani etc. Cloning and characterization of DGAT cDNA sequence from Brassica junceea cv. Pusa Bold</p><p>　　[8] E.Virginia Arbrust, John A. Berges, Chris Bowle

25、r, The Genome of the Diatom Thalassiosira Pseudonana: Ecology, Evolution,and Metabolism,Science,vol306,1 october,2004</p><p>　　[9] Bouvier P，Benveniste P，Oelkersp，Sturley S L，Schaiier H．Expression in yeast a

26、nd tobacco of plant cDNAs encodings acylCoA：diacylglycerol acyItransferase[J]．Eur．J．Biochem．，2000，267(1)：85—96．</p><p>　　[10] Lung S C，Weselake R J．Diacylglycerol acyltransferase：a key mediator of plant tria

27、cylglycerol synthesis[J]．Lipids，2006，41(12)：1073-1088．</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　海洋生物資源與環(huán)境</b></p><p>　　植物二酰甘油?；D移酶基因（DGAT）研究進展</p><p&g

28、t;　　摘要：石油的大量使用會導致能源枯竭和溫室氣體排放的增加，為了實現(xiàn)經(jīng)濟和環(huán)境的和諧發(fā)展，必須開發(fā)替代能源。生物柴油作為一種理想的可再生能源，近年來得到迅速發(fā)展。三酰甘油(TAG)是油料作物最主要的儲藏脂類,二酰甘油?；D移酶(DGAT,EC2.3.1.20)是TAG合成途徑的限速酶,其主要作用是催化二酰甘油加上酰基脂肪酸形成三酰甘油.在植物中已發(fā)現(xiàn)了3種不同類型的DGAT基因,分別為DGAT1、DGAT2和DGAT3.該文對近年來

29、國內(nèi)外有關植物DGAT相關基因及其蛋白分類、定位、結構及其在脂肪酸合成等研究進展進行綜述.為提高產(chǎn)油植物油含量以及特定脂肪酸積累提供理論參考。</p><p>　　關鍵詞：生物柴油 植物油脂 TAG DGAT 含油量</p><p>　　近年來，隨著全球經(jīng)濟的快速增長，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危機已迫在眉睫，對生物質(zhì)能等可再生能源的關注逐漸成為熱點[1]。生物柴

30、油，又稱單烷基脂肪酸酯，是以動、植物油脂為原料，與醇類經(jīng)轉酯作用獲得的單烷基脂肪酸酯，是一種安全清潔的可再生能源。微藻作為新一代生物柴油原料，光合作用效率高、環(huán)境適應能力強、生長周期短和生物產(chǎn)量及含油量高，已經(jīng)成為制備生物柴油的研究熱點[2]。</p><p>　　DGAT (二酰甘油?；D移酶)催化TAG（三酰甘油）合成途徑的最后一步反應，也是該途徑的限速酶[3]，對它的研究對于進一步提高微藻含油量，降低生物柴

31、油生產(chǎn)成本，有著十分重要的意義。</p><p><b>　　1.1 作用</b></p><p>　　質(zhì)體是植物發(fā)育種子中脂肪酸生物合成的主要場所。葡萄糖是脂肪酸碳C骨架的最初來源。如圖1所示，葉片中合成的葡萄糖運輸?shù)桨l(fā)育的種子細胞中，經(jīng)過一系列生化反應形成丙酮酸(Pyruvate)。丙酮酸進入質(zhì)體，在丙酮酸脫氫酶(PDH)催化下生成乙酰輔酶A(Acetyl-CoA

32、)，為脂肪酸合成提供了起始的2C分子。丙酮酸的合成及其轉入質(zhì)體中的數(shù)量是脂肪酸合成和積累的一個限速步驟。脂肪酸生物合成的第一步反應是乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的催化下加上一個羧基生成3C分子丙二酰輔酶A(Malonyl-CoA)。這一步也是脂肪酸合成和積累的一個限速步驟。接著，在轉酰基酶(AT)的作用下，丙二?；鶑妮o酶A分子轉移到酰基載體蛋白(ACP)上，形成丙二酰-ACP（Malonyl-ACP）。然后，在脂肪酸合成

33、酶(FAS)復合體的作用下，丙二酰-ACP經(jīng)過多次循環(huán)，每次循環(huán)使碳鏈增加兩個碳原子，直到飽和脂肪酸鏈長度達到16個碳原子的軟脂酸為止。這是正常的脂肪酸合成酶作用的終點。更長鏈的脂肪酸，或不飽和脂肪酸等都是把軟脂酸作為前體，需要另外的酶反應形成[5]。</p><p>　　圖1中，在質(zhì)體中合成的脂酰-ACP，經(jīng)硫酯酶(TE)催化生成脂肪酸，接著與位于質(zhì)體外膜上的輔酶A結合，形成脂酰-CoA。接著脂酰-CoA（Fa

34、tty acyl-CoA）從質(zhì)體經(jīng)細胞質(zhì)轉運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，用于合成甘油脂。首先，在3-磷酸甘油酰基轉移酶(GPAT)和溶血性磷脂酸?；?LPAT)的先后作用下，脂肪酸碳鏈從各種脂酰-CoA分子上轉移到甘油-3-磷酸(Glycerol-3-phosphate)的sn-1和sn-2位置上，從而生成磷脂酸(Phosphatidate)。然后，磷脂酸分子上sn-3位的磷酸基被磷脂酸磷酸酶(PAP)切除后就形成二酰甘油酯</p>&l

35、t;p>　　圖1 植物三酰甘油的生物合成途徑圖</p><p>　　(Diacylglycerol)。最后，在二酰甘油酰基轉移酶(DGAT)作用下，二酰甘油的sn-3位置上發(fā)生?；?即結合一個脂肪酸碳鏈)，形成三酰甘油(Triacylglycerol)。最近，研究發(fā)現(xiàn)了另一條不依賴于乙酰輔酶A的三酰甘油合成途徑，即在磷脂二酰甘油酯轉移酶(DGAT)的催化作用下，脂?；苯訌牧字Ｄ憠A(PC)轉移至二酰甘油

36、，從而合成三酰甘油，而沒有經(jīng)中間產(chǎn)物輔酶[24]。 </p><p><b>　　1.2 分類</b></p><p>　　根據(jù)從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中得到的各個物種中DGAT蛋白的氨基酸序列（如表1），運用生物信息學軟件(DNAMAN 6．0)分析可以把它們分為3類(如圖2)：DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族[25]。</p><p>

37、;　　表1 已測序植物DGAT蛋白的名稱及其登錄號</p><p>　　DGAT1基因家族只存在于動物和植物中 [7,16,17,27,28]。高等植物DGAT1蛋白的氨基酸殘基數(shù)一般在480～550之間，不同物種的DGAT氨基端前100個氨基酸殘基相似性較低(低于20%)，而位于100以后的氨基酸殘基相似性較高(大于70%)，可能正是這種N端差異導致了不同植物DGAT1酶屬性的不同[22]。一般情況下，植物DG

38、ATl具有9～lO個跨膜結構域，在N端有一個由100多個氨基酸組成的親水域，該親水域位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的胞質(zhì)面。</p><p>　　DGAT2基因家族的成員在動物、植物和酵母中都存在[15,16,22,25]，并且與DGAT1基因家族沒有明顯的相關性。目前對植物DGAT2的研究較少，僅在擬南芥、油菜、蓖麻等少數(shù)植物中克隆出來。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，C端明顯比N端保守，同樣也具有相似的親水結構域和疏水結構域。幾種已知的DG

39、AT2蛋白具有2～3個跨膜結構域。</p><p>　　DGAT3基因是Saha等從發(fā)育中的花生子葉細胞質(zhì)中克隆的一個與TAG合成相關的基因，該基因?qū)儆贒GAT基因家族，但是與DGATl和DGAT2基因家族的相似性不足10％，其蛋白序列與上面兩種DGAT家族同源性很低，但是具有類似DGAT蛋白功能基序[5,22]。該蛋白含有345個氨基酸，推測其分子量為41 kD，不存在跨膜結構和信號肽序列，因此推測該蛋白定位于

40、細胞質(zhì)中，是一種可溶性蛋白。</p><p>　　圖2 不同植物中DGAT蛋白序列的進化樹分析</p><p><b>　　2. DGAT基因</b></p><p>　　2.1 已測序DGAT基因、定位及結構特點</p><p>　　從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到已測序的植物DGAT基因及登錄號（如表2）。擬南芥DGATl基

41、因定位于染色體Ⅱ上，該基因DNA總長度為3020bp，含有16個外顯子和15個內(nèi)含子，cDNA全長1 998 bp。擬南芥DGAT2基因位于染色體Ⅲ上，DNA總長度為2 164bp，含有8個外顯子和7個內(nèi)含子，cDNA全長1 330 bp?；ㄉ鶧GAT3基因組序列還未得到，其cDNA全長1 637 bp。</p><p>　　各類植物的DGAT基因結構略有不同：其中油桐和水稻DGATl含有16個外顯子和15個內(nèi)含

42、子，外顯子長度和擬南芥基本一致。百脈根以及大豆DGATl含有15個外顯子和14個內(nèi)含子，它們最后一個外顯子長度與擬南芥和水稻的最后兩個外顯子長度之和基本相等。</p><p>　　表2 已測序的植物DGAT基因及登錄號</p><p>　　2.2 已測序的植物DGAT基因進化樹分析</p><p>　　從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到已測序的植物DGAT，運用ClastalX

43、軟件進行多序列比對（圖3）和迭代比對（圖4）7種植物DGAT基因，得到進化樹分析。</p><p>　　圖3多序列比對進化樹分析(gi+物種的拼音)</p><p>　　圖4迭代比對進化樹分析(gi+物種的拼音)</p><p>　　2.3 DGAT的基因操作</p><p>　　2.3.1 DGAT序列克隆</p><p

44、>　　DGAT序列克隆是進幾十年才開始的。從Cases等在小鼠中克隆了第一個DGATl基因后，Hobbs等擬南芥中克隆了DGAT基因，該基因在擬南芥中僅有一個拷貝。隨后，在油菜、蓖麻、煙草、大豆、百脈根等其他植物也得到了DGATl的同源基因。目前對植物DGAT2的研究較少，僅在擬南芥、油菜、蓖麻等少數(shù)植物中克隆出來。DGAT3基因目前只在花生中發(fā)現(xiàn)。</p><p>　　2.3.2 DGAT的轉基因工作&l

45、t;/p><p>　　表3 DGAT的轉基因工作</p><p><b>　　3.結論</b></p><p>　　（1）根據(jù)從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中得到的各個物種中DGAT蛋白的氨基酸序列運用生物信息學軟件(DNAMAN 6．0)分析可以把它們分為3類：DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族。</p><p>　　（2）

46、從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到已測序的植物DGAT，運用ClastalX軟件進行多序列比對和迭代比對得到完全相同進化樹(見圖3和圖4)。</p><p><b>　　4.展望</b></p><p>　　植物油作為一種可再生的生物柴油產(chǎn)品，具有非常廣泛的應用：(1)TAG是植物油的主要成分，植物油是食用脂類的主要來源，約占全世界脂類消耗的75％，而且植物油所含的很多單不飽和脂

47、肪酸例如油酸，比飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸具有更高的營養(yǎng)價值；(2)植物油是巨大的天然原料，很多脂肪酸例如芥酸，月桂酸，斑鳩菊酸都廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，世界上每年有1/3的植物油用于</p><p><b>　　制藥和化工生產(chǎn)。</b></p><p>　　近年來，對植物油脂的廣泛需求極大地促進了DGAT相關基因的研究，并在闡明植物油脂生物合成與代謝途徑，以及利用

48、基因工程方法改良優(yōu)質(zhì)品質(zhì)方面獲得了較大的發(fā)展。隨著各種油料作物的DGAT基因研究的逐漸深入，以及更多與植物含油量相關的DGAT基因多態(tài)性位點的發(fā)現(xiàn)，對于提高植物油產(chǎn)量以及品質(zhì)具有重要意義。</p><p>　　2008年，Zheng等通過對高油玉米DGATl的研究發(fā)現(xiàn)，在DGATl-2蛋白的F469位點處的一個苯丙氨酸的插入是提高油含量和油酸含量的重要決定因素，闡明了油含量以及組成差異的分子基礎。通過誘變得到DG

49、ATl-2蛋白苯丙氨酸突變型是未來大幅提高產(chǎn)脂量的值得研究的方法。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 嵇磊，張利雄，姚志龍等．利用藻類生物質(zhì)制備生物燃料研究進展[J]．石油學報石油加工，2007，23(6)：1-5．</p><p>　　[2] 王金娜，嚴小軍，周成旭，徐繼林．產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動態(tài)積

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51、EPC和DGAT的克隆及遺傳轉化研究．湖南農(nóng)業(yè)大學博士論文．</p><p>　　[6] 馬海明，施啟順，柳小春．DGAT相關基因的研究進展．遺傳學報，2005，32（12）：1327-1332．</p><p>　　[7] Xiaohua He, Charlotta Turner, Grace Q. Chen, Jiann-Tsyh Lin, and Thomas A. McKeon.C

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62、p><p>　　[18] Lehner R, Kuksis A. Biosynthesis of triacylglycerols [J]. Progress in Lipid Research, 1996, 35(2): 169—201.</p><p>　　[19] Lung S C, Weselake R J. Diacylglycerol acyltransferase: a key

63、mediator of plant triacylglycerol synthesis [J]. Lipids, 2006, 41(12): 1073-1088. </p><p>　　[20]Saha S, Enugutti B, Rajakumari S. Cytosolic triacylglycerol biosynthetic pathway in oil seeds., Molecular cloni

64、ng and expression of peanut Cytosolic diacylglycerol acy1transerase [J]. Plant Physiology, 2006, 141(4): 1533-1543. </p><p>　　[21] Stahl U, Carlsson A S, Lenmna M. Cloning and functional characterizations of

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66、[J]. J.Bio1.Chem, 2002, 277(8): 6478-6482.</p><p>　　[23] Routaboui J M, Benning C, Bechtold N. The TAG1 locus of Arabidopsis encodes for a diacylglycerol acyltransferase [J]. Plant Physiol. Biochem., 1999, 3

67、7(11): 831-840.</p><p>　　[24] Zou J, Wei Y D, Jako C. The Arabidopsis thaliana TAG1 mutant has a mutation in a diacylglycerol acyItransferase gene [J]. Plant Journal, 1999, 19(6): 645-653.</p><p&g

68、t;　　[25] Xiaohua He, Charlotta Turner, Grace Q. Chen, Jiann-Tsyh Lin, and Thomas A. McKeon.Cloning and Characterization of a cDNA Encoding Diacylglycerol Acyltransferase from Castor Bean[J]. Lipids, 2004, 4(39): 311–318.

69、</p><p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　假微型海鏈藻DGAT基因cDNA全長序列的分子克隆和分析</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b&

70、gt;　　1緒論1</b></p><p>　　1.1生物柴油的研究現(xiàn)狀1</p><p>　　1.1.1生物柴油作為替代燃料的優(yōu)勢1</p><p>　　1.1.2國外制備生物柴油的原料1</p><p>　　1.1.3國內(nèi)制備生物柴油的原料1</p><p>　　1.1.4存在的問題2<

71、;/p><p>　　1.2微藻制備生物柴油的研究現(xiàn)狀2</p><p>　　1.2.1微藻制備生物柴油的優(yōu)勢2</p><p>　　1.2.2國外微藻制備生物柴油的研究進展2</p><p>　　1.2.3國內(nèi)微藻制備生物柴油的研究進展3</p><p>　　1.2.4存在的問題和今后研究的方向4</p&g

72、t;<p>　　1.3 DGAT研究現(xiàn)狀5</p><p>　　1.3.1 DGAT在TAG合成中的作用5</p><p>　　1.3.2 DGAT的分類5</p><p><b>　　2材料與方法6</b></p><p><b>　　2.1材料6</b></p>

73、;<p><b>　　2.2 方法6</b></p><p>　　2.2.1總RNA的提取6</p><p>　　2.2.2 反轉錄合成cDNA的第一條鏈6</p><p>　　2.2.3 3’- RACE引物設計7</p><p>　　2.2.4 3’- RACE獲得DGAT基因全長cDNA7&

74、lt;/p><p>　　2.2.5 測序分析7</p><p>　　2.2.6 DGAT基因cDNA全長的生物信息學分析7</p><p><b>　　3結果與討論8</b></p><p>　　3.1 假微型海鏈藻DGAT cDNA克隆8</p><p>　　3.2 生物信息學分析8<

75、;/p><p>　　3.2.1核苷酸序列分析8</p><p>　　3.2.2推導的氨基酸序列同源性分析10</p><p><b>　　4小結12</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻12</b></p>

76、<p>　　摘 要：高昂的成本限制了微藻生物柴油的產(chǎn)業(yè)化，降低生產(chǎn)成本是關鍵所在。微藻具有光合作用效率高、環(huán)境適應能力強、生長周期短和生物產(chǎn)量高等優(yōu)勢，已經(jīng)成為制備生物柴油的研究熱點。DGAT (二酰甘油?；D移酶)催化TAG（三酰甘油）合成途徑的最后一步反應，也是該途徑的限速酶，對它的研究對于進一步提高微藻含油量，降低生物柴油生產(chǎn)成本，有著十分重要的意義。在本研究中，選取寧波大學藻種庫中性脂含量最高的假微型海鏈藻（Tha

77、lassiosira pseudonana）為材料，提取總RNA，利用RACE技術，獲得編碼RcDGAT的全長cDNA。該cDNA全長1512bp，開放閱讀框為1365bp，編碼455個氨基酸，為DGAT1。 Blastx搜索結果顯示,假微型海鏈藻DGAT核苷酸序列與已報道的藻類的同源性較高，其中三角褐指藻同源性54%為最高，但與已報道的高等植物只具有37-41%的相似性。對GenBank同源性搜索獲得的其它植物DGAT基因核苷酸序列進

78、行系統(tǒng)進化分析，通過Mag5.0分析，修建氨基酸序列長度至421個，發(fā)現(xiàn)最先與假微型海鏈藻聚類合并的是三角褐指藻，接著與變種小球藻（作者翻譯）聚合</p><p>　　關鍵詞：假微型海鏈藻；DGAT cDNA全長；RACE；基因克隆 </p><p>　　Abstract: With the rapid growth of global economy, fossil energy is

79、draining away, such as oil and coal. And carbon dioxide (CO2) from burning of fossil energy causes greenhouse effect. Then people pay their attention to look for renewable energy. Because of high photosynthetic efficienc

80、y, environmental adaption, biomass and short growth cycle, microalgae have become the focus of biodiesel production. But high cost limits industrialization of microalgae biodiesel. Reducing cost is the key proble</p&g

81、t;<p>　　Key words: T. pseudonana; DGAT Full-length cDNA; RACE; Gene sequence analysis</p><p><b>　　1緒論</b></p><p>　　近年來，隨著全球經(jīng)濟的快速增長，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危機已迫在眉睫，對生物質(zhì)能等可再生能源

82、的關注逐漸成為熱點【1】。</p><p>　　據(jù)統(tǒng)計，2004年我國一次能源消費總量約為19.7億噸標準煤，比2003年增長18%，其中煤炭占66%，石油占22%，天然氣占2.8%，水電占9.2%，石油進口超過1億噸。而且隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，對能源的需求量將越來越大，預計到2020年，我國一次能源需求量為25～33億噸標準煤，到2050年這個數(shù)字預計將可能達到50億噸標準煤。同時，能源供需矛盾將日益顯現(xiàn)，尤

83、其是石油供需矛盾將更加突出，石油供應安全凸現(xiàn)。另一方面，我國以煤碳為主的能源結構也將帶來嚴重的大氣污染，我國粉塵、二氧化碳和氮氧化物排放量的70%，二氧化硫排放量的90%來自于煤炭的燃燒。其中，二氧化硫和二氧化碳排放量已分別居世界第1位和第2位。20世紀90年代中期，我國酸雨區(qū)已占全國面積的30%左右?？晌腩w粒物、重金屬污染等對生態(tài)環(huán)境造成的不利影響也日益受到全社會的關注。我國能源大規(guī)模開發(fā)利用所引起的環(huán)境問題，尤其是以二氧化碳為主的

84、溫室氣體排放問題，已受到世界各國的普遍關注，《京都議定書》的生效和《后京都議定書》的開始談判將使我國在溫室氣體排放問題上面對的國際壓力日趨嚴重。尋找和開發(fā)化石能源的替代能源對保障國家能源安全以</p><p>　　1.1生物柴油的研究現(xiàn)狀</p><p>　　1.1.1生物柴油作為替代燃料的優(yōu)勢</p><p>　　生物柴油，又稱單烷基脂肪酸酯，是以動、植物油脂為原

85、料，與醇類經(jīng)轉酯作用獲得的單烷基脂肪酸酯。生物柴油作為化石燃料的替代品，與化石柴油和燃料乙醇等其他液體燃料相比，有著突出的特性：生物柴油不含石蠟，閃點高，燃燒性能和效率要高于普通柴油，使用時更安全；可以通過種植、養(yǎng)殖或培養(yǎng)源源不斷地得到，因而屬于可再生資源；生物柴油產(chǎn)品中含硫和氮較少，可以減少產(chǎn)生SO2和NOx對大氣的排放量。另外，與以淀粉類作物和木質(zhì)纖維素類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生的燃料乙醇相比，雖然酒精燃燒后尾氣排放污染小，但其熱值只有普通汽油

86、的2/3，比柴油更低，且乙醇易吸水使燃燒值下降【9】。</p><p>　　1.1.2國外制備生物柴油的原料</p><p>　　按照當前技術，利用動植物油脂等原料生產(chǎn)生物柴油，其原料成本占總生產(chǎn)成本的50%~85%，所以原料成本是決定生物柴油價格的最主要因素【10】。目前世界各國紛紛根據(jù)本國國情選擇合適的油脂原料生產(chǎn)生物柴油。歐洲和北美地區(qū)耕地資源豐富，農(nóng)業(yè)高度發(fā)達，因此歐洲各國，尤其是

87、德國，大規(guī)模種植油菜，采用菜籽油生產(chǎn)生物柴油，并建立了相應的產(chǎn)品標準。美國主要利用高產(chǎn)轉基因大豆，發(fā)展以大豆油為原料的生物柴油產(chǎn)業(yè)。東南亞國家屬于熱帶雨林氣候或熱帶季風氣候，全年高溫，雨水豐富，適于規(guī)模化種植油棕，棕櫚油已成為當?shù)匕l(fā)展生物柴油的重要原料。世界可再生能源生產(chǎn)大國巴西，主要利用蓖蔴籽油進行生物柴油生產(chǎn)。 </p><p>　　1.1.3國內(nèi)制備生物柴油的原料</p><p>　

88、　中國人口眾多，人均耕地面積遠低于世界平均水平，中國食用植物油脂的缺口較大【9】。因此政府首先要保證有足夠的糧油等食物供應。據(jù)統(tǒng)計，2003年我國進口油菜和菜籽油等食用油達到250 萬噸，用以滿足國內(nèi)日益增長的消費需求。我國2004年1~11月份進口食用油脂625 萬噸，其中大豆油進口為239 萬噸，同比增長56%；菜籽油進口32 萬噸，同比提高1.18倍；棕櫚油進口為216 萬噸，比上年同期提高1.2倍。2005年全年累計直接進口油脂

89、為653 萬噸，其中棕櫚油進口433 萬噸，大豆油進口169.4 萬噸，菜籽油及其他進口50.6 萬噸。海關總署表示，2008年1~12月我國共進口了816萬噸植物油，同比增長了2.6%。這決定了今后很長時間內(nèi)，中國食用植物油生產(chǎn)只能是力爭滿足人們生活需要，不可能出現(xiàn)足量剩余植物油用來發(fā)展生物柴油。種植草本油料作物油菜、大豆等需要大量土地，中國不可能利用大量的耕地來提供生物柴油原料。中國如果進口大量的大豆油、菜籽油用于生產(chǎn)生物柴油，其成

90、本太高，市場競爭力差，需要大量的政府補貼，并不符合中國的國情。</p><p>　　我國木本油料植物資源豐富，麻瘋樹、黃連木、油桐、烏桕等含油量可達20%【9】。因此我國目前主要以野生油料木本植物種子和廢棄動植物油脂為原料生產(chǎn)生物柴油。生物柴油原料的發(fā)展?jié)摿薮?，麻瘋樹、黃連木等油料植物可滿足500萬噸/年生物柴油裝置的原料需求，廢棄動植物油回收每年可生產(chǎn)約200萬噸生物柴油。 </p><p

91、>　　1.1.4存在的問題</p><p>　　綠色植物中草本油料作物的含油量較高，收獲的種子存儲和加工比較簡便，但我國現(xiàn)在還需要從國外進口大量食用油，不能依靠大豆、油菜等來大量生產(chǎn)生物柴油【9】。其他非食用油料作物也可以作為生物柴油的生產(chǎn)原料，但也會與糧油棉等作物爭地、爭水、爭肥。木本油料植物可以利用荒山野嶺來種植，不與農(nóng)作物爭地，還可以綠化環(huán)境，改良生態(tài)，在我國已有企業(yè)實施的成功范例。但這些樹木的含油果

92、實一般一年只收獲一次，而且存儲的成本較高，以此為原料進行生物柴油生產(chǎn)會受到季節(jié)的限制。</p><p>　　另外，在生物柴油制備方法方面，物理法得到的燃料油不適合在柴油發(fā)動機中長時間使用。化學法和生物酶法都各有優(yōu)缺點，但都有成本過高的缺陷。目前生物柴油的制備主要是利用化學酯交換法。</p><p>　　1.2微藻制備生物柴油的研究現(xiàn)狀</p><p>　　1.2.1

93、微藻制備生物柴油的優(yōu)勢</p><p>　　作為新一代生物柴油原料，微藻擁有很多優(yōu)勢。例如：</p><p>　　微藻種類繁多，分布極其廣泛。全球已經(jīng)鑒定的微藻大約有40000種，且其數(shù)量還在不斷增加。大多分布在江海湖泊中，不與農(nóng)作物爭地，可以整年生長。</p><p>　　微藻通常呈單細胞或絲狀體，結構簡單，整個生物體都能進行光合作用，所以光合作用效率高，生長周期

94、短、速度快。微藻還可利用微生物發(fā)酵技術，在光反應器中高密度、高速率培養(yǎng)。在同樣條件下，微藻細胞生長加倍時間通常在24 h內(nèi)，對數(shù)生長期內(nèi)細胞物質(zhì)加倍時間縮短至3.5 h【11】。</p><p>　　微藻油脂含量高。例如葡萄藻（Botryococcus braunii）的含油量為細胞干重的25～75%。而高等植物種子的脂肪酸含量僅為干重的15%~20%左右。其油脂組成與一般油料植物相似，以C16、C18系脂肪酸為

95、主。</p><p>　　微藻能吸收并利用工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中排放出的大量CO2和氮化物或從廢水中取得氮、磷等，有利于改善環(huán)境。</p><p>　　1.2.2國外微藻制備生物柴油的研究進展</p><p>　　20世紀50年代，美國麻省理工學院在校園內(nèi)建筑物的屋頂開始進行養(yǎng)殖藻類生產(chǎn)生物燃料的試驗，并在研究報告中第一次提到了藻類生物燃料。</p><p

96、>　　1978年，美國能源部可再生能源國家實驗室開始養(yǎng)殖微藻生產(chǎn)生物燃料項目(Aquatic Spices Program，簡稱ASP項目)的研究，研究內(nèi)容從微藻篩選、微藻生化機理分析、工程微藻制備到中試。研究人員在美國加利福尼亞州、夏威夷州、新墨西哥州等地進行了中試放大。中試裝置運行了一年，可獲得高達0.05 kg/(m2·d)的工程微藻，微藻含油量達到40%～60%。該項目持續(xù)到1996年，1978~1996年累計投

97、入科研經(jīng)費2505萬美元。由于油價上漲，2007年底美國能源部又將這個中斷了11年之久的項目重新啟動【10】。</p><p>　　進入21世紀后，研究工作出現(xiàn)了新的進展，逐步從實驗室走向中型規(guī)模驗證和生產(chǎn)放大階段。2002年，美國圣地亞國家實驗室在LiveFuels公司資助下，利用分子生物學反應工程技術進行增加微藻細胞含油量和產(chǎn)量方面的研究，經(jīng)過5年的工作，制取出了性能類似大豆油的海藻油，油脂含量豐富，可生產(chǎn)生

98、物燃料。其研究表明，僅需美國土地面積的0.3%就可生產(chǎn)出滿足全美國需要的運輸燃料。該項目的目標是到2010年研究獲得經(jīng)濟可行的生物柴油【8】。2005年12月，第一輛采用海藻燃料和大豆油(調(diào)合比例為1∶9)的示范轎車在印度進行了1500 km的實車試驗。</p><p>　　除科研機構外，眾多的生物燃料公司、投資公司也涌入了該研究領域。美國GreenFuel技術公司開發(fā)的海藻技術于2005年在Arizona的AP

99、S電廠完成了中試，選用高生長率的海藻，置于裝有水的大型試管內(nèi)，置于直接的陽光照射下。美國可再生能源集團(REG)于2008年8月21日宣布，該公司已擁有規(guī)模化的商業(yè)化技術，可生產(chǎn)大量高質(zhì)量的海藻生物柴油，柴油質(zhì)量超過ASTM D6751和EN 14214M標準。美國Sapphire公司2008年9月宣布投資1億美元開展養(yǎng)殖海藻生產(chǎn)生物燃料的研究，Sapphire公司有兩個引人注目的投資商：比爾蓋茨私人名下的一家投資公司(Cascade

100、investments)和為洛克菲勒家族服務的投資合作商(Venrock Partner)。Sapphire公司宣稱通過一種用太陽光、二氧化碳和光合海藻的工藝研制出了辛烷值達91的“綠色”汽油，而且生產(chǎn)的“綠色”燃料與現(xiàn)有的從煉油廠到加油站的銷售網(wǎng)絡設施完全兼容，顯示了微藻汽油與第一代生物乙醇相比的優(yōu)勢所在。 </p><p>　　1.2.3國內(nèi)微藻制備生物柴油的研究進展</p><p>

101、　　雖然我國微藻養(yǎng)殖的歷史不長，技術上與先進國家存在一定的差距，但近十多年來發(fā)展很快。螺旋藻、小球藻等微藻的養(yǎng)殖也逐漸受到重視。微藻生產(chǎn)生物燃料的研究取得了很大進展。</p><p>　　清華大學生物技術研究所繆曉玲等通過異養(yǎng)轉化細胞工程技術獲得高油脂含量的異養(yǎng)小球藻，其脂含量高達細胞干重的55%，是自養(yǎng)藻細胞的4倍。將制備的微藻離心分離獲得微藻細胞，經(jīng)蒸餾水洗和冷凍干燥成為粉狀后，用正己烷萃取細胞中的油脂，分離

102、除去萃取劑后得到皂化值和酸值分別為189.3 mgKOH/g和8.97 mgKOH/g的油脂，其相對分子質(zhì)量為933，相當于菜籽油的相對分子質(zhì)量。鑒于獲得的油脂酸值較高，研究人員利用酸催化酯交換技術進一步得到生物柴油和副產(chǎn)物甘油，得到的生物柴油符合ASTM相關標準。繆曉玲等還開發(fā)了微藻異養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)生物柴油技術。通過細胞控制技術獲得異養(yǎng)小球藻。異養(yǎng)小球藻細胞中油脂類化合物大量增加，蛋白質(zhì)含量下降。利用獨創(chuàng)的淀粉酶解和兩步法半無菌培養(yǎng)基技術

103、，以淀粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)富油脂小球藻。實驗室研究結果表明，與常規(guī)制備技術相比，成本下降5～8倍，油脂質(zhì)量分數(shù)達99%以上【1】。</p><p>　　山東海洋工程研究院與有關機構合作開展了海藻的能源化利用研究，目前已在實驗室取得了初步成果，培育出了富油微藻，最高含油量已達到68%，并在此基礎上制取生物柴油。</p><p>　　中國水產(chǎn)科學研究院、中科院海洋研究所等單位也正在開展以海洋藻類為

104、原料生產(chǎn)生物柴油的研究。目前已建立了化學法和脂肪酶法生產(chǎn)生物柴油的關鍵技術與工藝路線，生物柴油的收率達到98%以上，收集獲得了含油量超過28%的藻類，并對海藻油脂的提取進行了研究。該項目技術已完成了小試、中試，并已向北京、上海、湖北武漢、湖南長沙、河北廊坊和山東幾家公司轉讓。</p><p>　　據(jù)了解，撫順石化研究院已開展微藻利用的探索性研究，對能夠利用二氧化碳并富集油脂的藻類進行篩選和培養(yǎng)，掌握了葡萄藻、小球

105、藻、小環(huán)藻等典型藻種的培養(yǎng)條件和生長特性。正在對藻種改良，光反應器，以及油脂、糖類、纖維素等目標產(chǎn)物分離進行深入研究。</p><p>　　2008年，河北新奧集團通過微藻固定二氧化碳并制備生物質(zhì)能源項目，以微藻為原料，成功進行了生物柴油和生物燃氣的中試。該公司預計在3～5年內(nèi)逐步實現(xiàn)藻類生物能源的產(chǎn)業(yè)化。 </p><p>　　1.2.4存在的問題和今后研究的方向</p>

106、<p>　　高昂的生產(chǎn)成本是利用微藻生產(chǎn)生物柴油所面臨的第一個瓶頸問題【9】。假設采用含油量為30%的微藻來生產(chǎn)生物柴油，那么從培養(yǎng)、收集、提煉到成品，成本約為19.1 元/L。而我國2008年0號柴油的價格只有6.1 元/L，此價格還包括了稅收、運輸、利潤等費用。</p><p>　　其次是微藻大規(guī)模培養(yǎng)的問題。微藻類的大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)一般可以分為兩大類：開放式培養(yǎng)系統(tǒng)和封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)。開放式培養(yǎng)系統(tǒng)一

107、般是指室外的露天人工制造的培養(yǎng)池或特定環(huán)境下的小規(guī)模湖泊，其優(yōu)點是造價低廉、操作簡便、生產(chǎn)成本較低，但由于培養(yǎng)環(huán)境不穩(wěn)定、培養(yǎng)條件無法控制，培養(yǎng)效率較低，只能用于螺旋藻、小球藻、鹽藻等少數(shù)特定微藻的培養(yǎng)。封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)也被稱為光生物反應器，是目前流行的微藻培養(yǎng)系統(tǒng)，有柱狀、平板式、管道式等多種形式，具有培養(yǎng)環(huán)境可人工控制、光利用效率高、操作簡單等優(yōu)點，可以實現(xiàn)微藻的高密度、大規(guī)模培養(yǎng)。但封閉式光生物反應器在大規(guī)模培養(yǎng)過程中的生產(chǎn)成本相對