蘇門(mén)白酒草葉斑病的診斷及其病原菌研究.pdf

1、蘇門(mén)白酒草(Conyzasumatrensis)是19世紀(jì)初侵入我國(guó)的一種重要的外來(lái)入侵物種,是危害麥類、玉米、蔬菜、豆類等多種農(nóng)作物和生態(tài)環(huán)境的惡性雜草。通過(guò)近幾年對(duì)重慶市不同地區(qū)的蘇門(mén)白酒草進(jìn)行調(diào)查,在蘇門(mén)白酒草上發(fā)現(xiàn)一種新的病害,即蘇門(mén)白酒草葉斑病。本研究對(duì)這種新病害進(jìn)行了診斷鑒定,分離病原菌,篩選蘇門(mén)白酒草的生防真菌并研究其主要生物學(xué)特性。
　　 蘇門(mén)白酒草葉斑病的診斷.蘇門(mén)白酒草在田間自然條件發(fā)病的病斑呈長(zhǎng)梭形或橢圓形

2、,外緣有淡黃色暈圈,中部組織死亡呈褐色。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)病斑擴(kuò)大呈梭形大斑,最后整個(gè)葉片死亡。常規(guī)組織分離獲得病原菌,它們?cè)谑覂?nèi)葉片接種后產(chǎn)生的病害癥狀與田間相同,一般3d后可見(jiàn)明顯的病斑,到8d后葉片可部分或完全枯死。從接種葉片的病斑上再分離可獲得同樣的病原菌。
　　 蘇門(mén)白酒草葉斑病的病原菌分離.通過(guò)組織分離和純化和柯赫氏證病程序,從采自于重慶北碚區(qū)、合川區(qū)、沙坪壩區(qū)等地蘇門(mén)白酒草葉斑病上獲得了3個(gè)致病菌株,其中SMBC-22

3、菌株致病性最強(qiáng),葉片接種發(fā)病率達(dá)100%,病情指數(shù)達(dá)75%以上,由此認(rèn)為該病原菌在蘇門(mén)白酒草的生物控制中可能具有應(yīng)用價(jià)值,所以對(duì)其進(jìn)行了分類學(xué)鑒定和主要生物學(xué)特性分析。
　　 葉斑病菌SMBC-22的形態(tài)學(xué)鑒定.菌株SMBC-22在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈圓形或近圓形,邊緣整齊,表面輪紋狀,后期同心輪紋隆起較明顯。菌落較薄。初期表面白色,逐漸變?yōu)榛野咨?氣生菌絲不發(fā)達(dá)。絨狀;菌落背面初期也為白色,培養(yǎng)3d后逐漸轉(zhuǎn)變成黑褐色,最終基

4、部形成黑灰相間的綸紋。菌落適宜生長(zhǎng)溫度為15-30℃,最適生長(zhǎng)溫度為28℃。菌絲無(wú)色,分枝,具隔,直徑3.1-4.6μm。在PDA培養(yǎng)基上光暗12h/12h條件下培養(yǎng)8d后開(kāi)始形成分生孢子器,分生孢子器黑色,散生、埋生或半埋生于培養(yǎng)基中,球型或近球形,直徑72.140μm,頂端有孔:分生孢子器中以瓶梗式產(chǎn)生分生孢子,分生孢子橢圓形或卵形。無(wú)色,單胞,部分細(xì)胞中部有溢縮,大小為(4.5-5.8)μm×(1.6-2.1)μm,有1-2個(gè)油球

5、。根據(jù)這些病菌的特征,參考相關(guān)的資料將該病原菌初步鑒定為莖點(diǎn)霉屬(Phoma)。
　　 SMBC-22的分子鑒定.提取SMBC-22菌株的基因組DNA,用真菌的通用引物ITS4和ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約500bp的rDNA-ITS區(qū)段。同時(shí)用LROR和LR7引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約為1300bp的rDNA-LSU區(qū)段。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后提交到NCBIGenBaak獲得登錄號(hào)分別為HQ645974和JF966194。通過(guò)在GenB

6、ank進(jìn)行Blast對(duì)比分析,并構(gòu)建了相關(guān)真菌種類的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),由此得知該菌株的ITS序列與已有巨腔莖點(diǎn)霉(phomamacrostoma)菌株DQ474092處于一個(gè)最小的分枝內(nèi),相似性達(dá)到99%,而其LSU序列與巨腔莖點(diǎn)霉的菌株序列GU238096處于同一分枝內(nèi),相似性也為99%。兩個(gè)序列與莖點(diǎn)霉屬其它種類菌株的相應(yīng)序列的相似性都小于98%。據(jù)此,最終鑒定SMBC-22為巨腔莖點(diǎn)霉(P.macrostoma)。
　　 SMB

7、C-22的相關(guān)影響因子測(cè)定.通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到菌株SMBC-22最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基,產(chǎn)孢量也最大,菌落最適生長(zhǎng)溫度范圍為22-30℃,最適產(chǎn)孢溫度為28℃,分生孢子在10-30℃之間均可萌發(fā),最適孢子萌發(fā)溫度為25℃;該菌在pH6.0-9.0范圍內(nèi)可較好地生長(zhǎng),pH8.0最適宜產(chǎn)孢;分生孢子在pH5-0.11.0均可萌發(fā),最適萌發(fā)pH值為7.0。該病原菌對(duì)葡萄糖、蔗糖兩種碳源及酵母浸膏、硝酸銨兩種氮源利用率最好,在葡萄糖和硝酸鉀上菌落

8、長(zhǎng)勢(shì)、菌絲重量和產(chǎn)孢量大;光暗交替的環(huán)境更易菌株生長(zhǎng),在光暗16h/8h條件下菌株產(chǎn)孢濃度最大,而光照條件對(duì)菌株孢子萌發(fā)影響不顯著。另外,菌株分生孢子要相對(duì)濕度在90%以上時(shí)才能萌發(fā)。在相對(duì)濕度到達(dá)100%時(shí),孢子萌發(fā)率為最高74.6%。同時(shí)通過(guò)測(cè)試,分生孢子的致死條件為60℃下處理20min。
　　 SMBC-22寄主范圍的測(cè)定.本研究通過(guò)測(cè)定SMBC-22菌株對(duì)6個(gè)科18個(gè)種的植物(禾本科的小麥、玉米、水稻,茄科的茄子、辣椒

9、、番茄,十字花科的油菜、白菜、蘿卜、甘藍(lán),豆科的四季豆、豇豆,莧科的菠菜和葫蘆科的黃瓜、南瓜、西瓜、冬瓜、絲瓜)是否具有致病性,來(lái)判斷其寄主范圍。接種15d后觀察沒(méi)有引起任何作物植株發(fā)病。同時(shí),用SMBC-22菌株的培養(yǎng)濾液和分生孢子萌發(fā)液處理供試作物種子和作物植株后,作物種子的萌發(fā)率以及植株的生長(zhǎng)與清水空白對(duì)照沒(méi)有顯著差異。這表明,蘇門(mén)白酒草病原菌SMBC-22及其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)這些主要的經(jīng)濟(jì)作物都沒(méi)有致病力。即該病原菌對(duì)作物的

10、安全性高,具有發(fā)展成為蘇門(mén)白酒草生防因子的潛力。
　　 SMBC-22粗毒素的提取與致病活性測(cè)定.本研究用乙酸乙酯萃取了蘇門(mén)白酒草病原菌SMBC-22的粗毒素,通過(guò)針刺法和葉圓片法檢測(cè),所提毒素對(duì)蘇門(mén)白酒草具有很強(qiáng)的致病活性,而對(duì)經(jīng)濟(jì)作物沒(méi)有致病活性.另外測(cè)定了pH、溫度等因素對(duì)租毒素致病活性的影響,結(jié)果表明該菌毒素在pH為5.0-11.0的范圍、溫90℃及以下的溫度范圍內(nèi)內(nèi)均可以表現(xiàn)出一定的致病活性。
　　 通過(guò)調(diào)查田