帕金森病相關(guān)蛋白Parkin、PINK1和mortalin交互作用對線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)控研究.pdf

1、帕金森病 相 關(guān)蛋 白 parkin、pINK I 和 mortalin交互 作用 對線粒體穩(wěn) 態(tài)調(diào) 控研 究院 系 :專 業(yè) :姓 名 :指 導(dǎo) 教 師 :導(dǎo) 師 組 成 員 :完 成 日 期 :上 海 醫(yī) 學(xué) 院遺 傳 學(xué)楊 輝劉 雯左 極劉 曉 宇20 11 年 4 月 10 日復(fù) 旦 大學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文中文摘 要幾汀 * 了 n 作 為常染色 體 隱性 帕金森 病 (Par ki ns on ’5disea se， P

2、D ) 常 見致病 基因之 一 ，編碼 的蛋 白具有泛素 E3 連接 酶 活 性 。Par kin 除 了通 過 泛 素蛋 白酶體途徑參 與底 物 降解 ，還在包括信 號傳 導(dǎo) 、氧化應(yīng) 激和 線粒體穩(wěn)態(tài) 等 方 面發(fā) 揮 重要 調(diào)控 作 用 。尸 幾 勃 產(chǎn) 了 n du ce dp uta tz ’ ve kz ’ 刀 ase 了 扭力 晰 7 夕 作 為另 一 個 與 常 染 色體 隱性 遺傳 即 相 關(guān)致 病基 因 ，編 碼 的

3、蛋 白質(zhì) 主要 定位 于線粒體 并 具有 絲 氨 酸-蘇氨 酸激 酶 活 性 。 P工 NK I/Parkin 通 路在 調(diào) 控 線 粒 體 形態(tài) 和 功 能上 發(fā) 揮 重 要 作 用 。Morta lin 是 主要 定位 于線 粒體 并 參 與 線 粒 體穩(wěn) 態(tài) 調(diào)控 的分 子 伴 侶 。 Mo rt al in與 PD 的發(fā) 病 密 切 相 關(guān) ，主 要證 據(jù) 包括 PD 病 人 二 二 tal 初 基 因編碼 區(qū)存 在 突 變 和

4、mort al in 在 PD 病 人 受 影 響相 關(guān)腦 區(qū) 中表 達(dá) 水 平 下 降 以及 mort al in 與 PD 相 關(guān) 蛋白 DJ一 1/ a 一 Synucle in 存 在 相 互作 用 。 通 過 對 攜 帶 二 or tal 初 突 變 的 PD 病 人 成 纖維 上皮 細(xì)胞 進(jìn) 行研 究 ，發(fā)現(xiàn) 氧 化應(yīng) 激 的發(fā) 生 、線 粒 體形 態(tài) 及膜 電位 異 常 。然 而 Par k in 、P INKI 和 mo

5、r 七 al in 的相 互 作 用 情 況 及他們 參與 調(diào) 控 線 粒 體 的具 體機(jī)制仍然 不清 。 因此在本研 究 中， 我們 主要 在 HeLa 細(xì)胞 中對 Par k in 和 P INKI ，Pa rkin 和 mo rt al in 之 間 的相互 作 用進(jìn) 行研 究 ， 并觀 察他 們 對線粒 體 功 能 的 影 響 。主 要方 法 和 結(jié) 果 如 下 :1)Parkin R工 NG I 結(jié)構(gòu) 域突變質(zhì)粒 構(gòu)建 。利用

6、 已構(gòu) 建 的編碼野 生型 Par kin 質(zhì)粒作 為模 板 ， 經(jīng)重 疊 延伸 PCR 方法 獲得相 關(guān) R 工 NGI 突變 型 Par kin 質(zhì)粒 并測序證 實 。2)Park inRI NG I 結(jié)構(gòu) 域突變對其 與 PINKI 的相互 作用和 對線粒 體 轉(zhuǎn)位 的影 響 。免疫熒光 結(jié)果表 明 HeLa 細(xì) 胞 內(nèi)轉(zhuǎn)染 G即 標(biāo)記 的 Par k in 在胞漿 、胞 核均有 分布 ，RINGI 結(jié)構(gòu)域相 關(guān) 突變 并未影 響

7、其 亞細(xì) 胞 定位 。當(dāng) PINKI 與 Par ki n 共 轉(zhuǎn)染 細(xì)胞后 ，野 生型與突變 型 Par kin 與線粒體 共定位 的程度顯 著增加 。免疫共沉淀 結(jié)果表 明野 生 型 Par k in 與 PI NKI 在 HeLa 細(xì)胞 中存 在 相 互 作用 ，PaI ’ ki n 的 RI NGI 結(jié)構(gòu) 域 突變 R275W 與 P INK I 的結(jié)合減 弱 。3)HeLa 細(xì) 胞 中 Par k in 和 mo rt al

8、in 的 亞細(xì) 胞 定位 及 相 互作用 。免 疫 熒光 結(jié) 果 表明 內(nèi)源 性 mor tal in 主 要 定位 于 線粒 體 ， Par k in 在 加 入 CCCP 后 與線 粒 體共 定 位 。免疫沉 淀 結(jié) 果 顯 示 在 HeLa 細(xì)胞 中 ，CCCP 誘 導(dǎo) 野 生 型及 T24OR 突 變 型 Par k in 與內(nèi)源 性 mor tal in 存 在 相 互作用 ，而 Par k in 的 R275W 及 R 工